专利名称：IL－6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrBI分子标记的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种与中国人群腰椎骨密度连锁的分子标记，专用于与中国人群骨密度连锁的分子标记筛选，可直接应用于中国人群骨质疏松症的早期诊断。
骨密度是表征骨质的数量性状，是由很强的遗传因素决定地。低骨密度是患骨质疏松性骨折的危险因子，因此，常常用骨密度作为替代表型来研究骨质疏松症。
大量的研究鉴定了很多与骨代谢有关的候选基因，如雌激素受体，胶原蛋白，维生素D受体，白介素-6等基因，但这些基因不一定是决定骨密度的基因。因此，检测这些候选基因与骨密度的关系是一条快速寻找控制骨质疏松症基因的途径。
IL-6对骨代谢有重要的作用。它与破骨细胞的表面的白介素-6受体结合，刺激破骨细胞的分化，从而影响骨吸收。特别是可能参与由缺少雌激素而引发的骨丢失。另外，它还可能是白介素-1调节骨丢失的调节因子。
白介素-6基因内有多个多态性位点，它们与骨密度的关联和连锁关系检测在不同的人群中广泛展开。检测的方法主要有关联分析，连锁分析和传递不平衡检测(TDT)。关联分析易于产生假阳性结果；连锁分析不能进行精确定位；传递不平衡是近来发展的一种统计力较强的定位方法，且不易受群体分层和混杂的影响，特别适合检测候选基因。
发明内容
本发明的目的是从候选基因中运用传递不平衡检测法锁定与中国人群骨密度连锁的分子标记。
本发明的技术解决方案采用传递不平衡检测法IL-6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrB I分子标记。
(1)样本来自400个以上中国人群核心家庭，共计1200个以上男、女个体人；核心家庭是由父母双亲和至少一个年龄在20-45岁之间的健康女性子女组成(2)对上述(1)的核心家庭进行性状调查调查核心家庭成员的年龄、性别、体重、身高、嗜酒程度、体力强度、家庭病史，测定子女的L1-4腰椎和髋部的骨密度，用多元回归法矫正骨密度，进行数据分析处理(3)对上述(1)的个体人抽取血样本，提取DNA，确定候选基因的分子标记基因型(4)对由上述(2)(3)获得的结果用TDT法进行分析(5) 检测候选基因与骨密度变异的连锁关系，获得白介素6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrB I分子标记。
与中国人群骨密度连锁的BsrB I分子标记，位于IL-6基因启动子区，确定IL-6基因BsrB I的基因型方法为PCR引物5’-CAG CAG CCA ACC TCC TCTA-3’和5’-CCC AAG CCT GGA TTA TGAA-3’PCR反应体系为0.1-0.3μg基因组DNA，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1 U Taq聚合酶，5pmol引物；PCR反应循环条件95℃，4min；95℃，1min，54℃，1min，72℃，5min，32循环；72℃，5min。在PE-9700上进行扩增反应。PCR产物在琼脂糖凝胶中点泳，然后用紫外透视仪照相并记录结果。
具体实施例方式从IL-6基因中用传递不平衡检测法检测出与中国人群骨密度连锁的分子标记，其进行步骤如下所示 实施例征集了407个核心家庭，总共1,279个个体，核心家庭由父母和至少1个年龄在20-45岁的健康女儿组成(平均年龄±标准差31.4±5.8岁)。这些家庭的平均大小为3.14个，其中354、49、3、1个家庭分别含有1、2、3、4个子女。脊椎骨和髋部的骨密度由QDR 2000+双能X射线骨密度仪(Hologic corporation，Waltham，MA)来测量。在脊柱部位，骨密度是第1-4腰椎的联合值，在髋部处，骨密度是股骨颈、转子和转子间区的联合值。骨密度仪对腰椎和髋部的骨密度测量值的变异系数(CV)分别为0.9％和0.8％。
确定IL-6基因BsrB I的基因型方法为PCR引物5’-CAG CAG CCA ACC TCC TCTA-3’和5’-CCC AAG CCT GGA TTA TGAA-3’，PCR反应体系为0.1-0.3μg基因组DNA，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1 U Taq聚合酶，5pmol引物；PCR反应循环条件95℃，4min；95℃，1min，54℃，1min，72℃，5min，32循环；72℃，5min。在PE-9700上进行扩增反应。PCR产物在琼脂糖凝胶中点泳，然后用紫外透视仪照相并记录结果。
在IL-6基因BsrB I标记和L1-4腰椎骨密度(骨密度由年龄、身高和体重来校正)之间存在连锁(p＝0.034)、关联模型下的连锁(p＝0.046)和关联和连锁(Allison线性模型，p＝0.045)。
本发明的意义我们采用传递不平衡检测方法在中国核心家庭中检测了白介素-6基因，找出了IL-6基因与腰椎骨密度的连锁，获得了IL-6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrB I分子标记。本研究的成果可直接应用分子标记从人的早年时期来诊断那些人可能患有骨质疏松症，以便对其采取早期预防及治疗；这一研究结果也可为以后进一步为基因治疗骨质疏松症提供分子遗传学依据。本发现有助于更深一步了解骨质疏松症的发病机制，对治疗和预防骨质疏松症，降低由骨质疏松引起的骨折风险，提高中国人群的健康和身体素质具有重要的实际意义。
权利要求
1.IL-6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrB I分子标记，该分子标记与骨密度连锁关系是通过传递不平衡检测法(TDT)获得的(1)样本来自400个以上中国人群核心家庭，共计1200个以上男、女个体人；核心家庭是由父母双亲和至少一个年龄在20-45岁之间的健康女性子女组成(2)对上述(1)的核心家庭进行性状调查调查核心家庭成员的年龄、性别、体重、身高、嗜酒程度、体力强度、家庭病史，测定子女的L1-4腰椎和髋部的骨密度，用多元回归法矫正骨密度，进行数据分析处理(3)对上述(1)的个体人抽取血样本，提取DNA，确定候选基因的分子标记基因型(4)对由上述(2)(3)获得的结果用TDT法进行分析(5)检测候选基因与骨密度变异的连锁关系，获得白介素6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrB I分子标记。
2.根据权利要求1所述与中国人群骨密度连锁的BsrB I分子标记，位于IL-6基因启动子区，确定IL-6基因BsrB I的基因型方法为PCR引物5’-CAG CAG CCA ACC TCC TCTA-3’和5’-CCC AAG CCT GGA TTA TGAA-3’，PCR反应体系为0.1-0.3μg基因组DNA，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1 U Taq聚合酶，5pmol引物；PCR反应循环条件95℃，4min；95℃，1min，54℃，1min，72℃，5min，32循环；72℃，5min。在PE-9700上进行扩增反应。PCR产物在琼脂糖凝胶中点泳，然后用紫外透视仪照相并记录结果。
全文摘要
本发明IL－6基因中与中国人群腰椎骨密度连锁的BsrBI分子标记，专用于与中国人群骨密度连锁的分子标记筛选。它是运用传递不平衡检测法从与中国人群骨密度相关的候选基因IL－6中，检测锁定得到BrsBI分子标记，选取400个以上核心家庭的1200个以上男、女个体人实例取样获得的。本发明的意义在于本研究的成果可直接应用分子标记从人的早年时期来诊断那些人可能患有骨质疏松症，以便对其采取早期预防及治疗；本发现有助于更深一步了解骨质疏松症的发病机制，对治疗和预防骨质疏松症，降低由骨质疏松引起的骨折风险，提高中国人群的健康和身体素质具有重要的实际意义。
文档编号C12N15/11GK1434131SQ0311809
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月20日 优先权日2003年2月20日
发明者邓红文, 秦跃娟, 莫小阳, 周琦, 刘曼媛, 陈湘定, 雷署丰, 刘湘华, 周小刚, 李淼新, 李玉梅, 邓飞艳, 蒋德科, 简蔚霞 申请人:邓红文