专利名称：用于多重pcr条件优化的方法和组分的制作方法
发明的背景介绍所谓的多重PCR指的是这样一种PCR扩增方式，它可以在一个反应管采用多套引物通过一次反应即实现多个没表序列的同步扩增。在实际的核酸分析和检测中如采用多重PCR可以大大简化操作，缩短时间，同时相对于常规的PCR并不需要额外的操作和仪器。自从1988年第一次报道之后(Chamberlain，J.S.，et al.，1988.Nucleic Acids Res.，16，11141-11156)，多重PCR在临床和研究实验室成为了了一种快速而简便的筛选方法。多重PCR已经被成功的应用于许多领域，包括基因缺失分析(Sieber，O.M.，et al.，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，99，2954-2958)，基因突变和基因多态性分析(Moutou，C.，et al.，2002.Eur.J.Hum.Genet.，10，231-238)，mRNA定量分析(Zimmermann，K.，et al.，1996.Biotechniques，21，480-484)，RNA检测(Jin，L.，et al.，1996.Mol.Cell Probes，10，191-200；Zou，S.，et al.，1998.J.Clin.Microbiol.，36，1544-1548)以及基因组序列分析(Tettelin，H.，et al.，1999.Genomics，62，500-507)。在感染性疾病的诊断方面，多重PCR已经在病毒(Druce，J.，et al.，2002.J.Clin.Microbiol.，40，1728-1732；Robert，P.Y.，et al.，2002.J.Med.Virol.，66，506-511)、细菌(Osek，J.，2002.Lett.Appl.Microbiol.，34，304-310；Sloan，L.M.，et al.，2002.J.Clin.如.Microbiol.，40，96-100)，寄生虫(Harris，E.，et al.，1998.J.Clin.Microbiol.，36，1989-1995)以及细菌的耐药性(Oliveira，D.C.and Lencastre，H.H.2002.Antimicrob.AgentsChemother.，46，2155-2161)的鉴定、分析研究方面发挥了重要的作用。
通常需要非常仔细的引物设计以及多轮筛选后才能建立一个有效的多重PCR程序。多重PCR中经常遇到的问题是不同目标片段之间的扩增的不均衡，甚至在多重体系中的某些根本没有任何有效的扩增，同时其重现性交差。对于一个成功的多成PCR程序来说，需要考虑以下一些因素，具体包括引物的使用浓度、PCR缓冲液的浓度、镁离子浓度和dNTP浓度之间的平衡、PCR循环中各步的温度、模板DNA以及TaqDNA聚合酶的用量。PCR中的退火温度与缓冲液体系的最优组合对于保证多重PCR的特异性非常有必要，镁离子浓度和dNTP浓度之间需要保持一定的比例，同时引物浓度的调整也是非常有必要的(Markoulatos，P.，et al.，2002.J.Clin.Lab Anal.，16，47-51；Elnifro，E.M.，et al.，2000.Clin.Microbiol.Rev.，13，559-570)。Henegariu等(Henegariu，O.，et al.，1997.Biotechniques，23，504-511)通过对多重PCR中的多种因素进行研究后给出了一个详细的多重PCR优化程序，采用该程序进行优化时需要经过多步优化。
偏向于扩增一种或者某些序列操作其它一种或一些序列，也即最终产物的比例与起始模板的比例不同或者差别较大是多重PCR中的一种常见的现象。这主要是由于多重PCR扩增体系中的酶和单核苷酸的量是有限的，反应中所有引物对竞争这些有限的酶和单核苷酸，但是这些引物对的扩增效率并不相同。多重PCR的扩增的不均一性主要是在于引物的选择，而对模板的以来则较小(Suzuki，M.T.andGiovannoni，S.J.1996.Appl.Environ.Microbiol.，62，625-630)。因此，对每一种引物的终浓度的确定就成为了多重PCR体系建立中的关键因素。为了避免引物之间以及引物和非特异性模板之间的可能的交叉互补，需要对引物进行详细的设计和分析。在理想的情况下，多重PCR中的所有的引物对均有相同的扩增效率，不同的引物的相同的扩增效率可以通过在设计时保证各自的退火的一直来实现(控制引物的长度在18~28bp以及GC含量在45~60％，并且不同的引物之间以及引物自身均无较高的同源性。通常的情况下多重PCR中的每套引物的浓度是通过经验来实现的。
对本发明的简要总结一方面，本专利是直接关于一种优化多重PCR引物的方法，该方法包括；a)提供了大量的5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)提供一个5’通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同。d)分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
另一方面，本发明是直接关于一种用于多重PCR引物优化的组分。该组分包括a)大量不同浓度的所述的大量5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)一定浓度的5’通用引物和3’通用引物，5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度。
在另一个方面，本发明是直接关于一种用于多重PCR引物优化的试剂盒。该试剂盒包括a)提供了大量的5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)提供一个5’通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)提供了一种方式，该方式是针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同。d)提供了一种方式，该方式是分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
对于附图的简要说明
图1所示的是为本发明的一个实例的优化过程。1为上游通用引物，2为上游特异性引物，3为模板，4为下游特异性引物，5为下游通用引物。
图2所示的是本专利的另一个实例的优化过程。
图3所示的是HBV、HAV、HDV和EBV的四重扩增结果。
图4所示的是DMD基因的多重扩增结果。
本发明的详细说明为了清楚的阐述而非限制本发明，专利将从一下几个部分做详细说明。
A.定义除了专门定义之外，本发明所用的技术和科学术语都和普通理解的意思相同，可以被本专利所属技术领域内的一个普通的技术人员所理解。所有在本专利中所参考的专利、申请、已经公开的申请以及其它的出版物已经在专利的参考文献中列出。如果本部分中所提到的某个定义与本专利中所参考的专利、申请、已经公开的申请以及其它的出版物的定义相矛盾或者不一致，则以本部分中的定义为准。一个术语即使是以单数形式出现，发明者也可考虑它的复数形式。在这里文章中使用的命名和在下面描述的实验过程都是众所周知的和普遍使用的。贯彻整篇文章，下面的术语尽管在整篇文章中使用，如果不是特别说明，都以下面的解释为准
这里的“一个”或“一种”指“至少一个”或者“一个或更多”。
这里所说的“聚合酶链式反应”指的是一种可以在体外进行DNA扩增的系统。反应中需要两条合成的寡核苷酸引物，他们分别与要扩增的目标DNA的两条链的不同区域互补， 反应中用到的DNA模板可以是不纯的，反应体系中还需要有过量的脱氧单核苷酸以及热稳定的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶存在。在一系列的热循环，例如30个热循环中，目标DNA在90℃左右被反复的变性，在50-60℃与引物经退火而结合，然后在72℃延伸而获得子代DNA链。因为子代链可以被作为模板而在后续的循环中被复制，因此可以同时与两条引物结合的目标序列将会被指数扩增而非线性扩增。原始的DNA不需要是纯的或者很大的量，PCR技术已经获得了广泛的应用，应用领域不仅仅包括科研，同时还包括临床诊断以及法医科学。
这里所说的“巢式PCR”指的是这样一种PCR扩增方式，在该种扩增中先后使用了两套引物来提高扩增的效率以及扩增的特异性。在第一步反应中采用外引物，第二步发应中则以第一步发应中的产物的一部分为模板，采用第二套引物来进行扩增。
这里所说“反转录PCR或者RT-PCR”指的是这样一种PCR扩增方式，在该种扩增方式中的起始模板为RNA，所以需要在正式的PCR扩增之前将RNA模板反转录为DNA模板，某些热稳定的聚合酶具有一定的反转录活性，然而更常用的是采用专门的反专利酶来进行反转录，灭活反转录酶或者纯化PCR产物，然后进行常规的PCR。
这里所指的”引物”指的是一段可以与目标序互补结合的寡核苷酸，引物可以在扩增过程中引导核酸的合成。
这里所指的“5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度”指的是5’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’特异性引物的浓度，3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的3’特异性引物的浓度。
这里所指的“5’和3’特异性引物在不同的反应体系中的浓度是不同的”指的是在不同的反应体系中不同的5’特异性引物的浓度不同，同时不同的3’特异性引物的浓度亦不同。.
这里所述的“所述的目标序列获得了相当的扩增”指的是不同的目标序列在多重PCR体系中的扩增效率比较均衡。通常情况下，不同模板之间的扩增效率之间的差异应该在50％以内。更合适的情况是，不同模板之间的扩增效率之间的差异应该为40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％。
最合适的情况是，不同的目标序列之间具有相同的扩增效率。
这里所述的“发卡结构”指的是多聚核苷酸或者核酸具有一个双链的茎的结构以及一个单链的环的结构，形成茎结构的两条多聚核苷酸以及核酸链处于一条链之上但是被形成环结构的单链核苷酸所隔开，茎环结构可以进一步在双链的茎结构之外带有5’或者3’的单链区域。
“核酸”指的是任何形式的DNA或RNA，包括单链、双链、三链、线状以及环状等多种形式。核酸可以是多聚核苷酸、寡核苷酸以及核酸和核酸类似物的嵌合体，核酸可以是由熟知的几种核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸以及它们的类似物或衍生物所组成。核酸可以由自然存在的或非自然存在的核苷酸碱基组成，如黄嘌呤、核苷碱基的延伸物2-氨基酰嘌呤或类似物等。核酸可以是肽核酸。核酸可以是任意长度，可以是单链或双链，或者是部分单链和部分双链。同时还包括其它的非典型的磷酸二酯键骨架的寡核苷酸衍生物，例如磷酸三酯键，肽核酸(PNA)、甲基磷酸、磷硫酸、 多聚核苷酸引物、锁定核酸(LNA)以及其它。
“互补或配对”指的是是两个核酸序列至少有50％的序列互补。更适宜于指两个核酸序列具有至少60％，70，％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列互补。“互补或配对”同时也指两个核酸序列能够在低，中或者高的严谨度下杂交。
“充分的互补或充分的配对”指的是两个核酸序列有至少90％的序列互补。更适宜于指两个核酸序列具有至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列互补。“充分的互补或充分的配对”也可以解释为两个核酸序列能够在高严谨度下杂交。
“两个完全配对的核酸序列”指的是一个核酸双链中的两个核酸链按照Watson-Crick碱基配对原则互补配对，也就是在DNADNA双链中A和T配对，C和G配对，而在DNARNA或者RNARNA双链中A和U配对C和G配对，在配对的两条链中没有插入和缺失。
“杂交严谨度”主要用于区分错配的程度，其详细的描述如下1)高严谨度0.1×SSPE(or0.1×SSC)，0.1％SDS，65℃；2)中等严谨度0.2×SSPE(or1.0×SSC)，0.1％SDS，50℃；3)低严谨度1.0×SSPE(or5.0×SSC)，0.1％SDS，50℃.
采用不同的缓冲液，盐和温度可以获得相同的杂交严谨度。
“基因”指的是在染色体上占据有特定位置的遗传单位，特定基因的存在如否可以通过不同的等位基因的存在而确定。如果基因是不连续的，那么它们包括一组DNA序列(外显子)，而这些外显子的存在是产生一个完整的多肽所必需的。“退火温度”(“Tm”)指的是使50％的双链解链时所需要的温度，这里的双链包括DNADNA，DNARNA，RNARNA，PNADNA，LNARNA以及LNADNA等。
“样品”指的是应用本芯片实验室系统或者方法分析的提取的核酸或者蛋白，或者任何可能带有目标核酸或目标蛋白的物质。样品可以是生物样品，例如生物流体或者生物组织。生物流体包括尿液，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰，脑脊液，眼泪，粘液，羊水或其它类似的东西。生物组织则包括细胞聚集物，通常指形成人类，动物，植物，细菌，真菌或者病毒结构的由特定细胞通过胞间成分而相连的结构物质。生物组织的例子包括器官，肿瘤，淋巴结，动脉以及细胞。生物组织通常需要处理而获得细胞悬液样品。样品也可以是体外制备的细胞混合物。样品也可以培养的细胞悬浮物。对于生物样品，样品可以是粗的样品也可以是处理过的样品，该样品是对原始样品进行多步处理而得到的。举例来说，不同的细胞分离方法(例如磁激活的细胞分选)可以从体液样品(例如血液)中分离或富集目标细胞。本专利中的样品可以采用基于细胞富集的细胞分离。
“液体样品”指的是在自然状态下以液体或流体状态存在的样品，例如生物流体。“液体样品”也指自然条件下以非液体状态存在，例如固态或气态，但是被制备成包含固体或气体样品物质的液体，流体，溶液或者悬浮液。举例来说，液体样品可以是包含生物组织的液体，流体，溶液或者悬浮液。
这里所说的“对PCR产物进行分析”指的是对PCR产物的定性和定量分析，或者是获得PCR产物水平的一种指示，比例，百分比，可视化或者是其它有价值的指标。
对于PCR产物的分析可以是直接的也可以是间接的，最终检测的物质可以不是PCR产物本身，但可以是PCR产物的衍生物或者进一步的其它物质。
B.用于多重PCR引物优化的方法一方面，本专利是直接关于一种优化多重PCR引物的方法，该方法包括a)提供了大量的5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)提供一个5’ 通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同。d)分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
在一个特殊的实例中，至少是特异性引物中的一条或者是所有特异性引物中的一部分可以进一步在其5’末端带有一段序列，该序列可以在合适的条件下与3’的序列互补，从而在特异性引物的内部形成发卡结构。
5’和3’特异性引物以及通用引物可以分别同时加入或者在不同时间加入.举例来说，5’和3’特异性引物和5’，3’通用引物可以在多重PCR体系中同时出现。在另一个例子中，5’和3’通用引物是在扩增已经被5’和3’特异性引物起始后加入的，例如在加入特异性引物已经进行了1-15个循环后在加入通用引物。
在通用引物的终浓度等于或者高于特异性引物的终浓度的前提下，两者之间的浓度比可以为任何的比值。举例来说通用引物的终浓度与特异性引物的终浓度的比值可以在1到500之间。
通用引物可以为任何合适的浓度，例如在0.01μM~10μM之间. 特异性引物可以为任何合适的浓度，例如在0.01μM到1μM之间。
通用引物和特异性引物可以具任何可能的GC含量。举例来说，通用引物和特异性引物的GC含量可以从大约30％到大约80％。更好的情况是通用引物和特异性引物的含量在大约40％到大约60％。通常情况下，特异性引物的特异性性序列GC含量之间的差异应该控制在较小的范围内，例如在20％左右。
特异性引物的特异性序列可以具有任何可能的Tm值。举例来说，特异性引物的特异性序列的Tm值在30℃到80℃之间，此处的Tm是由最近邻居方法计算而得出。更合适的情况是特异性引物的特异性序列的Tm值在，40℃到60℃之间。通常情况下，特异性引物的特异性性序列Tm值之间的差异应该控制在较小的范围内，例如在20℃左右。
通用引物和特异性引物可以具任何可能的长度。举例来说，通用引物和特异性引物的长度为10到40个碱基。更合适的情况是通用引物和特异性引物的长度为18到25个碱基。通常情况下，特异性引物的特异性性序列长度之间的差异应该控制在较小的范围内，例如在10个碱基左右。
PCR产物可以通过任何合适的方法来分析。举例来说，PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳来分析。当采用琼脂糖凝胶电泳来分析PCR产物时，不同的PCR产物的长度之差应该在30 bp以上。更合适的情况是，不同的PCR产物的长度之差在30bp到50bp之间。PCR产物也可以通过其它的方式来分析，例如聚丙烯酰胺。目前的方法可以进一步包括使用确定的多重PCR引物来进行多重PCR。在优化以及进一步的扩增过程中可以采用任何目标序列。举例来说，目标序列可以是来源于病毒，细菌，真菌，植物，动物或者人类。更合适的情况是，目标序列来源于一种生物体，可以导致或者与某种疾病相关，例如可以导致严重性急性呼吸道综合症。
本专利中的方法可以用于任何可能的PCR形式中多重PCR引物的优化，举例来说，本方法可以用于多重一步法RT-PCR中的引物的优化。在一个实例中，在多重巢式PCR中，第一轮以及第二轮扩增均为常规的多重PCR。在另一个实例中，在巢式多重PCR中，第一轮扩增是多重一步法RT-PCR，第二轮扩增是常规多重PCR。
C.用于多重PCR引物优化的组分和试剂盒另一方面，本发明是直接关于一种用于多重PCR引物优化的组分。该组分包括a)大量不同浓度的所述的大量5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)一定浓度的5’通用引物和3’通用引物，5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同， 3’通用引物的序列与3’ 特异性引物上的通用部分序列相同；5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度。
在另一个方面，本发明是直接关于一种用于多重PCR引物优化的试剂盒。该试剂盒包括a)提供了大量的5’和3’ 特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)提供一个5’通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)提供了一种方式，该方式是针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同。d)提供了一种方式，该方式是分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
在上述的B部分的关于5’和3’通用引物，5’和3’特异性引物，目标序列以及其它成分的描述同样适用于C部分中的用于多重PCR引物优化的组分和试剂盒。进一步的，本发明中的方法，组分和试剂盒可以用于任何合适类型的PCR中的多重PCR引物的优化。例如常规PCR，PCR产物直接测序，用于基因组测序以及核酸印迹的连接调节的PCR，PCR产物的分子克隆，逆转录PCR，用于cDNA扩增的锚定PCR，以及通过PCR来对稀少的DNA进行定量，等等(参考文献Ausubel et al.，(Ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(2000)，Chapter 15)。
D.实施例常规的多重PCR程序的优化策略费时费力，而多重PCR条件优化中的最大的问题就是不同引物对扩增效率之间的不均衡，针对这一问题，本发明提供了一套优化的方法。方法的原理如图1所示。向常规引物(Normal Primer)的5′末端引入通用序列，该通用序列与待优化的多重PCR体系所针对的目标核酸的序列以及目标样品中其它核酸的序列不具有同源性或者同源性极低，此引物为特异性引物(SpecificPrimer)。针对特异性引物5′的通用序列，我们设计了另一引物-通用引物(Universal Primer)，该引物的序列与特异性引物5′的通用序列相同。进行扩增时，往体系中同时加入多对特异性引物以及通用引物，体系中的通用引物的浓度较高而不同特异性引物的浓度相同且较低，通过调整通用引物的浓度和特异性引物的浓度的比例来进行多重PCR体系的优化。图2所示的是本发明的操作流程。
实施例1HBV、HAV、HDV和EBV四重扩增体系的优化1.试剂除非特别说明实施例中的化学试剂均购自Sigma公司(The Woodland，TX)。TaqDNA聚合酶以及分子量参照DL2000购自大连宝生物公司。dNTPs购自上海博亚生物工程公司(10mmol/L)。
2.病毒保守序列克隆从生物芯片北京国家工程研究中心的临床感染性疾病病原克隆库中挑选了四个不同长度的克隆pCP10，pHAV249，pHDV142和pEBV478，其所包含的临床感染性疾病病原克隆的长度分别为HBV基因组的全长、249bp、142bp和478bp。这些克隆对应于四种不同的病原体HBV(乙型肝炎病毒)，HAV(甲型肝炎病毒)，HDV(丁型肝炎病毒)以及EBV(EBV病毒)。这些克隆将作为多重PCR的模板。
3.引物所有引物均在上海博亚生物工程公司合成，经过了PAGE纯化。
通用引物上游引物5′TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3′(SEQ ID NO1)，下游引物5′GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3′(SEQ ID NO2)。
特异性引物(下划线部分为反向互补序列，粗体部分为常规引物序列)。乙型肝炎病毒上游引物5′CACAGCTT TCACTTGCTTCCGTTGAGG 3′(SEQ ID NO3)，下游引物5′AGAACTCCGGTTTCGGATGTTACAGCGT 3′(SEQ ID NO4)。甲型肝炎病毒上游引物5′CATAGCTCACTTGCTTCCGTTGAGG 3′(SEQ ID NO5)，下游引物5′CAAAGAGGTTTCGGATGTTACAGCGT 3′(SEQ IDNO6)。丁型肝炎病毒上游引物5’ACGGTCTCACTTGCTTCCGTTGAGG 3’(SEQ ID NO7)，下游引物5′CGTCCTGGTTTCGGATGTTACAGCGT 3′(SEQ ID NO8)。EBV病毒上游引物5′CATTATGTCACTTGCTTCCGTTGAGG 3′(SEQ ID NO9)，下游引物5′CTAGGGTTTCGGATGTTACAGCGT 3′(SEQ ID NO10)。
4.多重PCR条件的优化首先配制四种病毒的四套引物的混合液，每种引物的在混合液中的终浓度均为50μmol/L。多重PCR体系为25μl，四种模板pCP10，pHAV249，pHDV142和pEBV478的浓度均为50ng。PCR体系的组成为10mmol/L Tris-HCl(24℃下的pH值为8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，1单位的TaqDNA聚合酶；200μmol/L的dNTPs；通用引物(上游和下游)的终浓度为1.0μmol/L；实验通过加入不等量的特异性引物的混合液而测试了9个特异性引物的浓度梯度(组合1到组合9)，分别是0.5，0.25，0.1，0.05，0.025，0.01，0.005，0.0025和0(μmol/L)。PCR反应在PTC-200热循环仪上进行(MJ Research Inc.Miami，FL)，热循环条件为预变性94℃ 3分钟；主循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保持。
5.电泳检测采用1×TBE作为电泳缓冲液，琼脂糖凝胶的浓度为1.7％，电泳在EmbiTec Runone电泳仪上进行，施加100V电压，电泳时间为30分钟。分子量参照为TaKaRa的DL2000(6个条带的大小从小到大依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量参照的上样量为5μL，PCR产物的上样量为3μL6.实验结果实验结果如附图3所示。在组合2到4中，四种目标片段均获得了较好的扩增，扩增具有较高的效率和较高的特异性，说明采用本发明中的方法可以大大简化多重PCR体系的优化。
实施例2DMD基因的多重扩增体系的优化1.人基因组DNA购自北京天为时代生物技术公司。
2.引物所有引物均在上海博亚生物工程公司合成，经过了PAGE纯化。
通用引物上游引物5′TCA CTT GCT TCC GTT GAG G 3′(SEQ ID NO11)，下游引物5′GGT TTC GGA TGT TAC AGC GT 3′(SEQ ID NO12)。
特异性引物本实施例中所用到的特异性引物在已有文献的基础上设计(Beggs，A.H.，et al.，1990 Hum.Genet.，86，45-48.)，引物的具体信息如下表1表1.用于DMD基因多重PCR扩增的特异性引物。
Exon Size(bp) No. Sequence(5′-3′)Pm/exon 1574 PMV_11104TCACTTgCTTCCgTTgAggGaagatctagacagtggatacataacaaatgcatgPMV_11105ggTTTCggATgTTACAgCgTttctccgaaggtaattgcctcccagatctgagtccexon 3 449 PMV_11106TCACTTgCTTCCgTTgAggtcatccatcatcttcggcagattaaPMV_11107ggTTTCggATgTTACAgCgTcaggcggtagagtatgccaaatgaaaatcaexon 43 396 PMV_11108TCACTTgCTTCCgTTgAgggaacatgtcaaagtcactggacttcatggPMV_11109ggTTTCggATgTTACAgCgTatatatgtgttacctacccttgtcggtccexon 50 310 PMV_11110TCACTTgCTTCCgTTgAggcaccaaatggattaagatgttcatgaatPMV_11111ggTTTCggATgTTACAgCgTtctctctcacccagtcatcacttcatagexon 13 277 PMV_11112TCACTTgCTTCCgTTgAggaataggagtacctgagatgtagcagaaatPMV_11113ggTTTCggATgTTACAgCgTctgaccttaagttgttcttccaaagcagexon 6 241 PMV_11114TCACTTgCTTCCgTTgAggccacatgtaggtcaaaaatgtaatgaaPMV_11115ggTTTCggATgTTACAgCgTgtctcagtaatcttcttacctatgactatggexon 47 220 PMV_11116TCACTTgCTTCCgTTgAggcgttgttgcatttgtctgtttcagttacPMV_11117ggTTTCggATgTTACAgCgTgtctaacctttatccactggagatttgexon 60 178 PMV_11118TCACTTgCTTCCgTTgAggaggagaaattgcgcctctgaaagagaacgPMV_11119ggTTTCggATgTTACAgCgTctgcagaagcttccatctggtgttcaggexon 52 152 PMV_11120TCACTTgCTTCCgTTgAggaatgcaggatttggaacagaggcgtccPMV_11121ggTTTCggATgTTACAgCgTttcgatccgtaatgattgttctagcctcPMV_11104到PMV_11121对应于SEQ ID13到SEQ ID30。
3.多重PCR条件的优化25μL的PCR反应体系中加入100ng的人基因组DNA为模板。PCR体系的组成为10mmol/L Tris-HCl(24℃下的pH值为8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，1单位的Taq DNA聚合酶； 200μmol/L的dNTPs；通用引物(上游和下游)的终浓度为1.0μmol/L；9对特异性引物的终浓度均为0.20(μmol/L)。PCR反应在PTC-200热循环仪上进行(MJ Research Inc.Miami，FL)，热循环条件为预变性94℃3分钟；主循环94℃30秒，65℃4分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保持。
4.电泳检测采用1×TBE作为电泳缓冲液，琼脂糖凝胶的浓度为1.7％，电泳在EmbiTec Runone电泳仪上进行，施加100V电压，电泳时间为30分钟。分子量参照为TaKaRa的DL2000(6个条带的大小从小到大依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp)。分子量参照的上样量为5μL，PCR产物的上样量为3μL。
5.实验结果实验结果如附图4所示。9种目标片段均获得了较好的扩增，扩增具有较高的效率和较高的特异性，说明采用本发明中的方法可以大大简化多重PCR体系的优化。
上述实施例仅仅是用于说明而不是用于限制本发明的范围。针对上述实施例可以有多种可能的变通方式。由于对于上述实施例的改进或者变通对于专业人员来说是显而易见的，本发明只由本专利的权利要求项来限定。
权利要求
1.一种用于优化多重PCR引物的方法，该方法包括a)提供了大量的5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列。b)提供一个5’通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同。d)分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述特异性引物的通用序列的5′末端可以进一步引入4～6个与常规引物的3′互补的碱基，在较低的温度下，该引物呈发卡状，发卡的引入可以提高扩增的特异性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述5’和3’通用引物可以与5’和3’特异性引物同时加入多重PCR体系。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述5’和3’通用引物可以加入通用引物扩增1～15循环后再加入。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述5’和3’通用引物的浓度和特异性引物的浓度的比例在1～500之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述5’和3’通用引物的浓度在0.01μM-10μM之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述5’和3’特异性引物的浓度在0.01μM，-1μM之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述通用引物和特异性引物的GC含量在30％到80％之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述特异性引物和通用引物的GC含量在40％到60％之间。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述各常规引物的GC含量一致，相互之间的差异在20％以内。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物的Tm是由最近邻居法计算所得出，在30℃～80℃之间。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物的Tm值在40℃～60℃之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述各引物的Tm一致，相互之间的差异在20℃以内。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物长度在10nt～40nt之间，最好在18nt～25nt之间。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述引物长度在18nt～25nt之间。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述各引物的长度相互之间的差异在10nt以内。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述对多重PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳，对应于凝胶电泳，多重PCR中的各目标产物的长度两两之差在30bp以上，更好的是在30bp～50bp之间。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述各目标产物的长度两两之差在30bp以上。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述各目标产物的长度两两之差在30bp到50bp之间。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述对多重PCR产物的检测采用聚丙烯酰胺电泳或者毛细管电泳。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中可以进一步采用优化的多重PCR引物来通过多重PCR来扩增目标序列。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中的目标序列来源于病毒，细菌，真菌，植物，动物或者人。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，目标序列来源于病毒，该病毒会导致严重急性呼吸道综合症(SARS-CoV)或者与该病相关。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法用于多重一步法RT-PCR条件的优化。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法用于多重巢式PCR。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述方法中，对于多重巢式PCR，第一轮和第二轮扩增均为常规多重PCR。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述方法中，对于多重巢式PCR，第一轮扩增为多出那个一步法RT-PCR，第二轮扩增则为常规多重PCR。
28.一种用于多重PCR引物优化的组分，该组分包括a)大量不同浓度的所述的大量5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列；b)一定浓度的5’通用引物和3’通用引物，5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度。29.一种用于多重PCR引物优化的试剂盒，该试剂盒包括a)提供了大量的5’和3’特异性引物，每一个所述的特异性引物均包括一段与将要扩增的目标序列互补的特异性序列以及一个通用序列；b)提供一个5’通用引物和一个3’通用引物，所述的5’通用引物的序列与5’特异性引物上的通用部分序列相同，所述的3’通用引物的序列与3’特异性引物上的通用部分序列相同；c)提供了一种方式，该方式是针对大量的模板，利用通用引物以及大量的所述的5’特异性引物和3’特异性引物进行多重PCR.在每一个所述的多重PCR中，所述的5’通用引物和3’通用引物在反应体系中的终浓度等于或高于相应的所述的5’和3’特异性引物的浓度，特异性引物在不同的多重PCR反应体系的浓度亦不相同；d)提供了一种方式，该方式是分析所述的不同的多重PCR的产物，鉴别出一个多种目标序列均获得了相当扩增的多重PCR，从而确定用于目标序列扩增的最有的多重PCR引物组合。
全文摘要
本发明属于PCR领域。尤其是，本发明提供了用于多重PCR引物优化的方法，组分和试剂盒，也就是，处于不同浓度比值的大量的5’和3’特异性引物以及5’和3’通用引物。
文档编号C12P19/34GK1496413SQ03800040
公开日2004年5月12日 申请日期2003年5月9日 优先权日2003年5月9日
发明者陶生策, 程京 申请人:清华大学, 北京博奥生物芯片有限责任公司