表位序列的制作方法

专利名称：表位序列的制作方法
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本发明通常涉及肽，和编码肽的核酸，所述肽是靶相关抗原的有效表位。更具体地，本发明涉及具有对I类MHC的高亲和力和由靶特异性蛋白酶体产生的表位。
相关技术的描述瘤形成与免疫系统通常称为癌的肿瘤性疾病状态被认为是通常由一个生长不受控制的单细胞引起。不受控制的生长状态典型地由一个多级过程引起，其中一系列细胞系统衰竭，导致赘生性细胞的发生。产生的赘生性细胞迅速繁殖它自身，形成一种或多种肿瘤，最终可导致宿主的死亡。
由于赘生性细胞的先祖共享宿主的遗传物质，赘生性细胞大多不受宿主免疫系统攻击。在免疫监视期间，该过程中宿主免疫系统监视和定位外源物质，在宿主免疫监视机器看来赘生性细胞为“自身”细胞。
病毒与免疫系统与癌细胞相反，病毒感染涉及明显非自身抗原的表达。结果，免疫系统以最小的临床后遗症成功对付了许多病毒感染。此外，对于导致严重疾病的那些感染中的许多已经可以开发有效疫苗。已经成功使用多种疫苗方法来抗击各种疾病。这些方法包括亚单位疫苗，其由通过重组DNA技术生产的单独蛋白质组成。尽管有了这些进展，用作病毒疫苗的最小表位的选择和有效给药仍然有问题。
除与表位选择有关的困难之外，存在已经进化逃避宿主免疫系统能力的病毒的问题。许多病毒，特别是建立持久感染的病毒，如疱疹和痘病毒家族的成员，产生免疫调制分子，其允许病毒逃避宿主免疫系统。这些免疫调制分子对抗原呈递的作用可以通过将用于给药的选择表位作为免疫原性组合物的目标来克服。为了更好理解赘生性细胞和病毒感染细胞与宿主免疫系统的相互作用，下面接着讨论系统组分。
免疫系统起将对于一种生物内源的分子(“自身”分子)从对于该生物外源或异质的物质(“非自身”分子)区别开来的作用。基于介导应答的组分，免疫系统具有两类针对外物的适应性应答体液应答和细胞介导应答。体液应答是由抗体介导的，而细胞介导的应答涉及归类为淋巴细胞的细胞。近来的抗癌和抗病毒策略已集中在调动宿主免疫系统作为一种抗癌或抗病毒治疗或疗法的方法。
免疫系统在三个阶段中起作用来保护宿主免受外物伤害识别阶段，活化阶段和效应阶段。在识别阶段，免疫系统识别并发出信号体内存在外源抗原或侵入物。外源抗原可以是例如来源于赘生性细胞的细胞表面标记或病毒蛋白。一旦系统察觉到侵入物，响应于侵入物触发的信号，免疫系统的抗原特异性细胞增殖并分化。最后阶段是效应阶段，其中免疫系统的效应细胞应答并中和检测的侵入物。
一系列效应细胞实施对侵入物的免疫应答。一类效应细胞，B细胞产生靶向宿主遇到的外源抗原的抗体。与补体系统结合，抗体指导携带靶抗原的细胞或生物的破坏。另一类效应细胞是天然杀伤细胞(NK细胞)，一类淋巴细胞，其具有同时识别和破坏多种病毒感染的细胞以及恶性细胞类型的能力。不大理解NK细胞识别靶细胞所使用的方法。
另一类效应细胞，T细胞，具有分类为三亚类的成员，每亚类在免疫应答中发挥不同作用。辅助T细胞分泌细胞因子，其刺激产生有效免疫应答所必需的其它细胞的增殖，而抑制性T细胞下调免疫应答。第三类T细胞，细胞毒性T细胞(CTL)，能够直接溶解在它表面呈递外源抗原的靶细胞。
主要组织相容性复合体和T细胞目标识别T细胞是在对特异性抗原信号的应答中发挥作用的抗原特异性免疫细胞。B淋巴细胞和它们产生的抗体也是抗原特异性的实体。然而，不同于B淋巴细胞，T细胞对游离或可溶形式的抗原不应答。为了T细胞对抗原应答，需要将抗原加工成肽，其然后与主要组织相容性复合体(MHC)中编码的呈递结构结合。该要求称为“MHC限制性”并且这是T细胞从“非自身”细胞区分“自身”的机制。如果一种抗原不为可识别的MHC分子所展示，T细胞将不识别和作用于该抗原信号。与可识别MHC分子结合的肽的特异性T细胞与这些MHC-肽复合体结合，并进入免疫应答的下一阶段。
存在两类MHC，I类MHC和II类MHC。T辅助细胞(CD4+)主要与II类MHC蛋白质相互作用，而溶细胞的T细胞(CD8+)主要与I类MHC蛋白质相互作用。两类MHC蛋白质都是跨膜蛋白质，它们大部分结构在细胞外表面。此外，两类MHC蛋白质在它们的外部都具有肽结合裂缝(binding cleft)。内源或外源蛋白质的小片段被结合在该裂缝中并呈递于胞外环境中。
称为“专职抗原呈递细胞”(pAPCs)的细胞利用MHC蛋白质将抗原展示给T细胞，但另外表达各种共同刺激分子，其取决于pAPC的分化/激活的具体状态。当与可识别MHC蛋白质结合的肽的特异性T细胞与pAPCs上的这些MHC-肽复合体结合时，作用于T细胞的特异性共刺激分子指导T细胞所采取的分化/激活途径。即，共刺激分子影响在未来遭遇中当它进入免疫应答的下一阶段时T细胞将如何作用于抗原信号。
如上讨论，大多赘生性细胞被免疫系统忽略。大量努力正花在努力控制宿主免疫系统以帮助对抗宿主中赘生性细胞的存在。一个该研究领域涉及配制抗癌疫苗。
抗癌疫苗患者的免疫系统是肿瘤学家抗癌的战斗中可利用的各种武器之一。在各种努力中已经进行工作以使免疫系统抗击癌症或肿瘤性疾病。不幸地，到此为止的结果大多是令人失望的。特别感兴趣的一个领域涉及生产和使用抗癌疫苗。
为了生产疫苗或其它免疫原性组合物，必需将针对其可产生免疫应答的抗原或表位引入受试者。尽管赘生性细胞是来源于正常细胞并因此在遗传水平上与正常细胞基本上相同，但已知许多赘生性细胞呈递肿瘤相关抗原(TuAAs)。理论上，受试者的免疫系统可以利用这些抗原来识别这些抗原并攻击赘生性细胞。然而，实际上赘生性细胞通常看来似乎为宿主的免疫系统所忽略。
已经开发许多不同策略试图生产具有抗赘生性细胞活性的疫苗。这些策略包括使用肿瘤相关抗原作为免疫原。例如，美国专利号5,993,828描述了一种通过对受试者给药有效剂量的一种组合物来产生针对尿肿瘤相关抗原(Urinary Tumor Associated Antigen)特定亚基的免疫应答的方法，所述组合物包含在细胞表面具有尿肿瘤相关抗原的灭活肿瘤细胞和至少一种选自GM-2，GD-2，胎儿抗原和黑素瘤相关抗原的肿瘤相关抗原。因此，本专利描述将完整的灭活肿瘤细胞用作抗癌疫苗中的免疫原。
使用抗癌疫苗的另一种策略涉及给药一种含有单独肿瘤抗原的组合物。在一种方法中，将MAGE-A1抗原性肽用作免疫原(参见Chaux，P.，等，“Identification of Five MAGE-A1 Epitopes Recognized by Cytolytic TLymphocytes Obtained by In Vitro Stimulation with Dendritic CellsTransduced with MAGE-A1，”J.Immunol.，163(5)2928-2936(1999))。已经有几个将MAGE-A1肽用于接种的治疗实验，尽管该接种疗法的效力有限。在Vose，J.M.，“TumorAntigens Recognized by T Lymphocytes，”10thEuropean Cancer Conference，Day2，Sept.14，1999中讨论了这些试验中的一些的结果。
在另一个用作疫苗的肿瘤相关抗原的实例中，Scheinberg等使用5次注射I类相关的bcr-abl肽和辅助肽加上佐剂QS-21来治疗12位已经接受干扰素(IFN)或羟脲的慢性髓细胞性白血病(CML)患者。Scheinberg，D.A.，等，“BCR-ABL Breakpoint Derived Oncogene Fusion Peptide VaccinesGenerate Specific Immune Responses in Patients with Chronic MyelogenousLeukemia(CML)[摘要1665]，American Society of Clinical Oncology 35thAnnual Meeting，亚特兰大(1999)。引发了表示T-辅助细胞活性的增殖和迟发型超敏反应(DTH)T细胞应答，但在新鲜血样中未观测到溶细胞的杀伤T细胞活性。
在Cebon等和Scheibenbogen等的近来工作中看到尝试鉴定用作疫苗的TuAAs的另外实例。Cebon等使用皮内给药的MART-126-35肽和以增大剂量皮下或静脉内给予的IL-12免疫具有转移性黑素瘤的患者。最初的15位患者中，注意到1位完全缓解，1位部分缓解，和1位混合应答。对于T细胞产生的免疫测定包括DTH，其在使用或不使用IL-12的患者中发现。
在有临床益处(clinical benefit)迹象的患者中发现阳性CTL测定，但在没有肿瘤退化的患者中未发现。Cebon等，“Phase I Studies of Immunizationwith Melan-A and IL-12 in HLA A2+Positive Patients with Stage III and IVMalignant Melanoma，”[摘要1671]，American Society of Clinical Oncology35thAnnual Meeting，亚特兰大1999)。
Scheibenbogen等用4种I类HLA限制性酪氨酸酶肽免疫18位患者，其中16位患者用转移性黑素瘤免疫和用佐剂免疫2位患者。Scheibenbogen等“Vaccination with Tyrosinase peptides and GM-CSF in MetastaticMelanomaa Phase II Trial，”[摘要1680]，American Society of ClinicalOncology 35thAnnual Meeting，亚特兰大(1999)。在4/15患者中，其中2位用佐剂免疫和2位有肿瘤退化迹象的患者中观测到增强的CTL活性。如在Cebon等的试验中，患有进行性疾病(progressive disease)的患者未显示增强的免疫性。尽管到此为止花了各种努力来产生有效的抗癌疫苗，仍未开发出该组合物。
抗病毒疫苗保护免患病毒病的疫苗策略已经取得许多成功。或许这些中最显著的是对抗疾病天花已取得的进步，天花已经被灭绝。脊髓灰质炎疫苗的成功具有类似的重要性。
可将病毒疫苗分为三类活减毒病毒疫苗，如对于天花的牛痘，萨宾脊髓灰质炎病毒疫苗，和麻疹流行性腮腺炎和风疹；完全杀死或灭活的病毒疫苗，如索尔克脊髓灰质炎病毒疫苗，甲型肝炎病毒疫苗和典型流感病毒疫苗；和亚单位疫苗，如乙型肝炎。由于它们缺乏完整的病毒基因组，亚单位疫苗比基于完整病毒的那些提供更大程度的安全性。
成功的亚单位疫苗的范例是基于病毒包膜蛋白的重组乙型肝炎疫苗。尽管许多学术者对将超越单个蛋白质的还原论者亚单位概念推至单独表位感兴趣，但该努力尚未产生许多成果。病毒疫苗研究也已集中在诱导抗体应答，尽管也发生细胞应答。然而，许多亚单位制剂在产生CTL应答方面特别差。
发明概述引发专职抗原呈递细胞(pAPCs)展示靶细胞表位的先前方法已经简单依赖于使pAPCs表达靶相关抗原(TAAs)，或那些被认为具有对MHC I类分子高亲和力的抗原的表位。然而，这类抗原的蛋白酶体加工导致在pAPC上呈递的表位与靶细胞上的表位不相对应。
利用有效的细胞免疫应答要求pAPCs呈递相同的由靶细胞呈递的表位的知识，本发明提供具有对MHC I高亲和力，并且与在周围细胞中活跃的管家蛋白酶体的加工特异性相对应的表位。这些表位因此与在靶细胞上呈递的那些相对应。将这类表位用于组合物，例如疫苗和其它免疫原性组合物(包括药物组合物和免疫治疗性组合物)可以激活细胞免疫应答来识别正确加工的TAA并可导致去除呈递这类表位的靶细胞。在一些实施方案中，这里提供的管家表位可与免疫表位结合使用，产生细胞免疫应答，其在干扰素诱导之前和之后都能够攻击靶细胞。在其它实施方案中将该表位用于诊断和监测靶相关疾病和用于生产针对这类目的的免疫试剂。
本发明的实施方案涉及分离的(isolated)表位、抗原和/或多肽。分离的抗原和/或多肽可以包括表位。优选的实施方案包括具有表1A或1B中公开序列的表位或抗原。其它实施方案可包括一种包含来自表1A或1B的多肽的表位聚簇。此外，多个实施方案包括一种与已经提及的表位、多肽，抗原或聚簇实质上类似的多肽。其它优选的实施方案包括一种与上述的任何一种功能相似的多肽。还有另外的实施方案涉及一种编码来自表1A或1B和这里提及的所述表位、聚簇、抗原和多肽中任何一种的多肽的核酸。
为了本发明的其它实施方案的下列总结和讨论的目的，参考“表位”、“多种表位”或“来自表1A或1B的表位”可以包括，不限于所有前述形式的表位，其包括具有表中或本文其它处所述序列的表位，包含这种表位或多个表位的聚簇，与那些表位或聚簇具有实质上或功能相似性的多肽，等等。
多肽或表位可以是免疫活性的。包含表位的多肽长度可以小于大约30个氨基酸，更优选地，例如，多肽长度为8-10个氨基酸。物质(substantial)或功能的相似性可包括例如增加至少一个氨基酸，和至少一个附加的氨基酸可以是在多肽的N-末端。物质或功能的相似性可以包括替代至少一个氨基酸。
表位，聚簇或包含它的多肽可具有对HLA-A2分子的亲和力。该亲和力可以通过结合试验，表位识别限制性试验，预测算法等测定。表位，聚簇或包含它的多肽可具有对HLA-B7，HLA-B51分子等的亲和力。
在优选的实施方案中，多肽可以是一种管家表位。该表位或多肽可对应于在肿瘤细胞上展示的表位，对应于在新脉管系统(neovasculature)细胞上展示的表位等。该表位或多肽可以是免疫表位。该表位，聚簇和/或多肽可以是核酸。该表位，聚簇和/或多肽可以由核酸编码。
其它实施方案涉及组合物，包括药物组合物或免疫原性组合物，其包含包括来源于表1A或1B的表位，聚簇，或包含它的多肽的多种多肽，和药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。所述佐剂可以是多核苷酸。该多核苷酸可包括二核苷酸，其例如可以是CpG。所述佐剂可以为一种多核苷酸所编码。该佐剂可以是一种细胞因子，所述细胞因子例如可以是GM-CSF。
药物组合物可另外包括一种专职抗原呈递细胞(pAPC)。pAPC例如可以是树突细胞。药物组合物可另外包括第二表位。第二表位可以是多肽，核酸，管家表位，免疫表位等。
还有另外的实施方案涉及组合物，包括药物组合物和免疫原性组合物，其包括这里讨论的任何核酸，包括编码包含来自表1A或1B的表位或抗原的多肽的那些核酸。这类组合物可包括药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
其它实施方案涉及包括如这里所描述的这种核酸的重组构建体，其包括编码包含来自表1A或1B的表位或抗原的多肽的那些核酸。构建体可另外包括质粒，病毒载体，人工染色体等。构建体可另外包括一种序列，其编码至少一种特征(feature)，例如，第二表位，IRES，ISS，NIS，遍在蛋白质等。
另外的实施方案涉及纯化的抗体，其与至少一种表1A或1B中的表位特异性结合。其它实施方案涉及与一种肽-MHC蛋白质复合体特异性结合的纯化抗体，所述肽-MHC蛋白质复合体包含一种表1A或1B中公开的表位或任何其它适当的表位。来源于任何实施方案的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
还有其它实施方案涉及多聚体MHC-肽复合体，其包括一种表位，如，例如一种表1A或1B中公开的表位。同样，考虑对复合体特异性的抗体。
多种实施方案涉及表达对MHC-肽复合体特异性的T细胞受体的分离的T细胞。所述复合体可包括一种表位，如，例如表1A或1B中公开的表位。T细胞可以通过体外免疫生产并且可以从免疫动物中分离。多种实施方案涉及T细胞克隆，包括克隆的T细胞，如上面讨论的那些。多种实施方案还涉及T细胞的多克隆群体。该群体可包括例如如上所述的T细胞。
还有另外的实施方案涉及组合物，包括药物组合物和免疫原性组合物，其包括例如如上所述的那些的T细胞和药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
本发明的多种实施方案涉及分离的蛋白质分子，其包含对MHC-肽复合体特异性的T细胞受体的结合域。复合体可包括表1A或1B公开的表位。蛋白质可以是多价体。其它实施方案涉及编码该蛋白质的分离的核酸。还有另外的实施方案涉及包括该核酸的重组构建体。
本发明的其它实施方案涉及表达如在上和本文其它处所述的重组构建体的宿主细胞，所述宿主细胞可以包括编码表位、聚簇或包含所述表位或所述聚簇的多肽的构建体。表位或表位聚簇可以是例如那些公开于表1A或1B中的一种或多种，和如另外所定义。宿主细胞可以是树突细胞，巨噬细胞，肿瘤细胞，肿瘤衍生的细胞，细菌，真菌，原生动物等。多种实施方案还涉及组合物，包括药物组合物和免疫原性组合物，其包括一种宿主细胞，如在这里讨论的那些，和一种药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等。
还有其它实施方案涉及组合物，其包括免疫原性组合物，如例如疫苗或免疫治疗组合物。该组合物包括至少一种组分，例如表1A或1B中公开或在这里另外描述的表位；包括该表位的聚簇，包括该表位的抗原或多肽；如上面和在这里描述的组合物；如上面和在这里描述的构建体，T细胞，包含编码对MHC-肽复合物特异的T细胞受体结合结构域的核酸的构建体和包括其的组合物，或如上面和在这里描述的宿主细胞，和包含其的组合物。
另外的实施方案涉及治疗动物的方法。方法可包括对动物给药一种组合物，包括药物组合物和免疫原性组合物，例如一种疫苗或免疫治疗组合物，其包括如上面和在这里公开的那些。给药步骤可包括一种送递方式，如，例如，经皮的，结节内的(intranodal)，结节周围的(perinodal)，口服的，静脉内的，皮内的，肌内的，腹膜内的，粘膜的，气溶胶吸入，滴注等。该方法可另外包括一测定步骤以测定一种靶细胞或多种靶细胞状态的特征表现。方法可包括第一测定步骤和第二测定步骤，其中第一测定步骤在给药步骤之前，并且其中第二测定步骤在给药步骤之后。方法可另外包括一个比较第一测定步骤中测定的特性与第二测定步骤中测定的特性以获得一个结果的步骤。该结果可以是例如免疫应答的迹象，靶细胞数量的减小，包含靶细胞的肿瘤的质量或尺寸的减小，感染靶细胞的胞内寄生物数量和浓度的减小等。
多种实施方案涉及评估组合物的免疫原性，所述组合物包括疫苗或免疫治疗组合物。该方法可包括对动物给药一种疫苗或免疫治疗，如上面和在这里别处描述的那些，和基于动物一种特性评估免疫原性。动物可以是MHC-转基因的动物。
其它实施方案涉及评估免疫原性的方法，其包括用疫苗或免疫治疗组合物，如上面和在这里别处描述的那些，体外刺激T细胞，和基于T细胞的一种特性评估免疫原性。刺激可以是原发刺激(primary stimulation)。
还有另外的实施方案涉及进行被动/过继免疫治疗的方法。该方法可以包括将T细胞或宿主细胞，如上面和在这里别处描述的那些，与药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等结合。
其它实施方案涉及测定特异性T细胞频率的方法，并可以包括将T细胞与MHC-肽复合体或包含含有这样一种表位的聚簇或抗原的复合体接触的步骤，所述MHC-肽复合体包含表1A或1B中公开的表位。接触步骤可包含至少一种特征，例如，免疫，再刺激(restimulation)，检测，计数等。该方法可另外包括ELISPOT分析，有限稀释分析，流式细胞计量术，原位杂交，聚合酶链反应，它们的任何组合等。
多种实施方案涉及评估免疫应答的方法。该方法可包括在免疫步骤之前和之后实行的测定特异性T细胞频率的上述方法。
其它实施方案涉及评估免疫应答的方法。该方法可包括在用MHC-肽复合体刺激之前和之后测定T细胞的频率，细胞因子产生量或溶细胞活性，所述MHC-肽复合体包含一种表位，例如来自表1A或1B的表位，包含该表位的聚簇或多肽。
另外的实施方案涉及诊断疾病的方法。方法包括将受试者组织与至少一种组分接触，所述组分包括，例如T细胞，宿主细胞，抗体，蛋白质，其包括上面和在这里别处描述的那些；和基于组织或组分的一种特征诊断疾病。接触步骤可以例如在体内或体外发生。
还有其它实施方案涉及制备组合物包括例如疫苗的方法。方法可以包括将至少一种组分与药用佐剂，载体，稀释剂，赋形剂等结合，例如组分可以是表位，组合物，构建体，T细胞，宿主细胞；其包括上面和在这里别处描述的那些中的任何一种，。
多种实施方案涉及其上已经记录SEQ ID NOS108-610中任何一种序列的计算机可读介质，其是在一种具有计算含有所述序列的分子的物理，生物化学，免疫学，分子遗传特性的硬件或软件等的机器中。
还有其它实施方案涉及治疗动物的方法。方法可以包括结合治疗动物的方法，其包括对动物给药一种疫苗或免疫治疗组合物，例如上面和在这里别处所描述的，与至少一种治疗方式结合，所述治疗方式包括例如放射治疗，化学疗法，生物化学疗法(biochemotherapy)，外科手术等。
另外的实施方案涉及包括一种表位聚簇的分离的多肽。在优选的实施方案中，该聚簇可以是来自含有如表68-73任何一个中所公开的序列的靶相关抗原，其中氨基酸序列包括至多约80％的抗原氨基酸序列。
其它实施方案涉及免疫原性组合物，包括疫苗或免疫治疗产品，其包括如上面和在这里别处描述的分离的肽。还有其它实施方案涉及一种分离的的多核苷酸，其编码如上面和在这里别处描述的多肽。其它实施方案涉及包括这些多核苷酸的疫苗或免疫治疗产品。该多核苷酸可以是DNA，RNA等。
还有其它的实施方案涉及包含一种递送装置的试剂盒和任何在上面和在这里别处提及的实施方案。所述递送装置可以是导管，注射器，内泵或外泵，贮器，吸入器，微量注射器，膜片(patch)和适合任何递送途径的任何其它类似装置。如上所述，除了递送装置之外试剂盒还包括在这里公开的实施方案中的任一种。例如，无限制地，试剂盒可以包括分离的表位，多肽，聚簇，核酸，抗原，包括前述任何一种的药用组合物，抗体，T细胞，T细胞受体，表位-MHC复合体，疫苗，免疫治疗剂等。试剂盒还可包括物品如详细的使用说明书和其它任何类似的物品。
附图简述

图1A-1C是NY-ESO-1与几个相似蛋白质序列的序列对比。
图2图示用于递送核酸编码的表位的质粒疫苗主链。
图3A和3B是显示酪氨酸酶207-215和酪氨酸酶208-216HLA-A2结合试验结果的FACS曲线。
图3C显示通过体外免疫诱导的人CTL针对酪氨酸酶表位的溶细胞活性。
图4是由蛋白酶体切割SSX-231-68产生片段T＝120min时刻的质谱。
图5显示HLA-A2SSX-241-49与对照的结合曲线。
图6显示来源于SSX-241-49免疫的HLA-A2转基因小鼠的CTL对SSX-241-49-脉冲目标的特异性溶解。
图7A，B和C显示T＝60min时刻PSMA163-192蛋白酶体消化的等分部分N-末端池测序(pool sequencing)的结果。
图8显示HLA-A2PSMA168-177和HLA-A2PSMA288-297与对照的结合曲线。
图9显示T＝60min时刻PSMA281-310蛋白酶体消化的等分部分N-末端池测序的结果。
图10显示HLA-A2:PSMA461-469，HLA-A2:PSMA460-469和HLA-A2:PSMA663-671与对照的结合曲线。
图11显示检测PSMA463-471-反应性HLA-A1+CD8+T细胞的基于γ-IFN的ELISPOT试验结果。
图12显示用抗-HLA-A1mAb封闭在图10中使用的T细胞的活性，其显示HLA-A1-限制性识别。
图13显示HLA-A2:PSMA663-671与对照的结合曲线。
图14显示HLA-A2:PSMA662-671与对照的结合曲线。
图15.比较在用不同剂量DNA通过不同注射途径免疫后的抗-肽CTL应答。
图16.移植的gp33表达肿瘤在通过淋巴结内注射表达gp33表位的或对照，质粒而免疫的小鼠中的生长。
图17.分别在淋巴结内和肌内注射后的不同时间通过实时PCR检测的在注射或引流(draining)淋巴节中质粒DNA的量。
图18-70是描述来自在指示的底物序列上的消化物的质谱峰图谱的蛋白酶体消化图谱。
优选实施方案的详述定义除非另外从使用这里的术语的上下文中清楚得知，为了本描述的目的下面列出的术语应该通常具有指明的含义。
专职抗原呈递细胞(pAPC)-具有T细胞共刺激分子并能够诱导T细胞应答的细胞。完全表征的pAPCs包括树突细胞，B细胞和巨噬细胞。
周围细胞——不是pAPC的细胞。
管家蛋白酶体——通常在周围细胞中活跃的蛋白酶体，通常在pAPCs中不存在或没有强活性。
免疫蛋白酶体——通常在pAPCs中活跃的蛋白酶体；免疫蛋白酶体在感染组织的一些周围细胞中也是活跃的。
表位——能够刺激免疫应答的分子或物质。在优选的实施方案中，按照本定义的表位包括但不一定限于一种多肽和一种编码多肽的核酸，其中所述多肽能够刺激免疫应答。在其它优选的实施方案中，按照本定义的表位包括但不一定限于存在细胞表面的肽，所述肽非共价键地与I类MHC的结合裂缝结合，这样它们可以与T细胞受体(TCR)相互作用。由I类MHC提呈的表位可以是未成熟或成熟的形式。“成熟”是指区别于任何前体(“未成熟的”)MHC表位，其可以包括或基本上由管家表位组成，还包括通过加工去除的初级翻译产物中的其它序列，所述加工包括，但不限于单独或任何联合地蛋白酶体消化，N-末端修剪(trimming)或外源酶活性的作用。因此，成熟表位可以分别以被嵌入稍微更长多肽中的形式提供，其免疫效能归因于，至少部分归因于嵌入的表位；或为其最终形式，其在将被TCR识别的MHC结合裂缝中结合。
MHC表位——对哺乳动物I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)分子具有已知或预测结合亲和力的多肽。
管家表位——在一个优选的实施方案中，将管家表位定义为一种多肽片段，其是一种MHC表位，并且展示在其中管家蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将管家表位定义为一种含有按照前述定义的管家表位的多肽，其侧邻一个至几个附加的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将管家表位定义为一种编码按照前述定义的管家表位的核酸。
免疫表位——在一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种多肽片段，其是一种MHC表位，并且展示在其中免疫蛋白酶体活性突出的细胞上。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种含有按照前述定义的免疫表位的多肽，其侧邻一个至几个附加的氨基酸。在另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种包括一个表位聚簇序列，含有至少两个对I类MHC具有已知或预测亲和力的多肽序列的多肽。在还有的另一个优选实施方案中，将免疫表位定义为一种编码按照上述定义中任何一种的免疫表位的核酸。
靶细胞——被疫苗和本发明方法所靶向的细胞。按照本定义的靶细胞的实例包括但不一定限于赘生性细胞和含有胞内寄生物的细胞，所述寄生物例如病毒，细菌或原生动物。
靶相关抗原(TAA)-在靶细胞中存在的蛋白质或多肽。
肿瘤相关抗原(TuAA)-TAA，其中靶细胞是赘生性细胞。
HLA表位——对人I类或II类HLA复合体分子具有已知或预测结合亲和力的多肽。
抗体——多克隆或单克隆天然免疫球蛋白(Ig)，或任何完全或部分由Ig结合域组成的分子，不管生物化学衍生的或通过使用重组DNA得到。实施例包括，尤其是F(ab)，单链Fv和Ig可变区-噬菌体外被蛋白融合。
编码——可扩充的(open-ended)术语以致编码特定氨基酸序列的核酸可由确定那个(多)肽的密码子组成，但还可包含附加的序列，其是可译的或用于控制转录，翻译或复制，或便于操作一些宿主的核酸构建体。
物质相似性——该术语用来指如通过检查序列判断以间接的方式不同于参考序列的序列。尽管在简并位置的差异或在长度或任何非编码区组成上的适度差异，编码相同氨基酸序列的核酸序列基本上相似。只是通过保守置换或小的长度变化而相异的氨基酸序列基本上是相似的。另外，包含在N-末端侧翼残基数量不同的管家表位，或在任一末端侧翼残基数量不同的免疫表位和表位聚簇的氨基酸序列基本上是相似的。编码实质上相似的氨基酸序列的核酸它们自己也实质上相似。
功能相似性——该术语用于指如通过检测生物或生物化学特性判断以无意义的方式不同于参考序列的序列，尽管序列可能不是基本上相似。例如，可将两种核酸用作针对相同序列但编码不同氨基酸序列的杂交探针。即使它们通过非保守氨基酸置换而相异(因此不符合物质相似性的定义)，诱导交叉反应性CTL应答的两种肽在功能上相似。识别相同表位的成对抗体或TCRs可以是在功能上彼此相似，尽管存在任何结构差异。在检验免疫原性的功能相似性中，通常用“改变的”抗原免疫个体并检验引发应答(Ab，CTL，细胞因子产生等)识别靶抗原的能力。因此，可以设计在某些方面不同而保持相同功能的两种序列。该设计的序列变体在本发明的实施方案中。
疫苗——该术语用于指那些免疫原性组合物，其能激发预防、治愈或改善疾病的预防性和/或治疗性应答。
免疫原性组合物——该术语用于指能诱导免疫应答、反应、效果和/或事件的组合物。在一些实施方案中，该应答、反应、效果和/或事件可以在例如体外或体内诱导。在这些实施方案中包括的是例如在细胞介导的免疫中涉及的细胞的诱导、活化或扩展。这类细胞的一个实例是细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。疫苗是一种类型的免疫原性组合物。这种组合物的其它实例是体外诱导、活化或扩展CTLs的组合物。其它实例包括药物组合物等。
表1A.包括实施例1-7，13，14中的表位的SEQ ID NOS.*
表1B.包括实施例15-67中的表位的SEQ ID NOS.*
*SEQ ID NOS.108-602的任何一个可以用作本发明各种实施方案中任一种中的表位。SEQ ID NOS.603-610的任一个可以用作含有表位或表位聚簇的序列，如本发明各实施方案中所述。
**这里和从头到尾使用的所有登记号可以通过NCBI数据库访问，例如通过万维网上的Entrez搜索和检索系统。
注意下列讨论阐明发明人对本发明操作的理解。然而，不意图用本讨论将本专利限制于在后附权利要求中未阐明的任何具体操作理论。
在进行表位疫苗开发中，其他人已经产生基于MHC结合基序的预测表位列表。这类肽可以是免疫原性的，但可能不对应任何天然产生的抗原片段。因此，整个抗原将不引发类似的应答或使靶细胞对通过CTL的细胞溶解敏感。因此该列表不区分可以用作疫苗的那些序列和不可以用作疫苗的那些序列。测定这些预测表位中的哪些实际上是天然产生的努力已经经常依赖于筛选它们与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的反应性。然而，尽管肿瘤(和慢性感染细胞)将通常呈递管家表位，但TIL强烈偏向于识别免疫表位。因此，除非表位是由管家和免疫蛋白酶体两者生产，靶细胞将通常不为用TIL-鉴定的表位诱导的CTL所识别。相反，本发明的表位是通过特定蛋白酶体的作用产生，表明可以天然生产它们，并赋予它们适当的用途。在PCT出版物WO 01/82963A2中更充分地阐明了管家和免疫表位之间的差别对于疫苗设计的重要意义。考虑将在所述PCT出版物中公开的教导和实施方案作为与本发明有关和关于本发明有用的支持原理和实施方案。
本发明的表位包括或编码TAAs的多肽片段，其是通过管家或免疫蛋白酶体进行蛋白酶体切割的前体或产物，并含有或包括对至少一个MHC I等位基因具有已知或预测亲和力的序列。在一些实施方案中，所述表位包括或编码长度约为6-25个氨基酸的多肽，其优选长度约为7-20个氨基酸，更优选长度约为8-15个氨基酸，还更优选长度约为9或10个氨基酸。然而，应当理解只要N-末端修剪可以产生MHC表位或它们不含有导致多肽被引导远离蛋白酶体或被蛋白酶体破坏的序列，所述多肽可以更大。对于免疫表位，如果更大的肽不含有这类序列，它们可以在pAPC中为免疫蛋白酶体所加工。如果通过免疫蛋白酶体作用序列适合于促进表位C-末端的释放，也可将管家表位内嵌于更长的序列中。上述讨论已经假定更长表位的加工通过pAPC免疫蛋白酶体的作用进行。然而，加工还可以通过设计一些其它机制来完成，如提供外源蛋白酶活性和适应的序列结果蛋白酶的作用释放MHC表位。可以对这些表位序列进行计算机分析以计算物理，生物化学，免疫学或分子遗传特性，如质量，等电点，预测电泳迁移率，预测与其它MHC分子的结合，核酸探针的解链温度，反向翻译，与其它序列的相似性或同源性等。
在构建编码本发明多肽表位的多核苷酸中，可以使用相关TAA的基因序列，或者多核苷酸可以由任何对应的密码子组装。对于10个氨基酸的表位，这可以组成大约106种不同序列，其取决于具体的氨基酸组成。尽管大，这是一种相异(distinct)的和容易定义的集合，其表示＞1018该长度可能的多核苷酸中的一个很小部分，因此在一些实施方案中，在这里公开的具体序列的等价物包括在列表序列上的这类相异的和容易定义的变异。在选择这些序列中的具体一个用于疫苗过程中，如对于本领域技术人员将是明显的，可以利用条件如密码子使用，自身互补性，限制位点，化学稳定性等。
本发明意图生产肽表位。具体地，这些表位来源于AA序列，并对至少一个MHC I等位基因具有已知或预测的亲和力。这类表位典型地与在靶细胞或pAPCs上产生的那些相同。
包含活性表位的组合物本发明的实施方案提供多肽组合物，其包括疫苗，治疗法，诊断学，药理学和药物组合物。各种组合物包括新鉴定的TAAs的表位以及这些表位的变体。本发明的其它实施方案提供编码本发明多肽表位的多核苷酸。本发明另外提供用于表达适于纯化的多肽表位的载体。另外，本发明提供用作抗肿瘤疫苗的在APC中表达多肽表位的载体。可以使用来源于表1的任何表位或抗原，或编码它的核酸。其它实施方案涉及生产和使用各种组合物的方法。
可以描述I类MHC-结合表位的总体结构，其在Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13587-622，1995中已经被更全面地综述。许多结合能产生于MHC分子中的保守残基与肽的N-和C-末端之间的主链接触。产生另外的主链接触但在MHC等位基因中不同。序列特异性是由所谓的锚定残基的侧链与又在MHC等位基因中变化的口袋接触所赋予的。可以将锚定残基分为主要的(primary)和次要的(secondary)。主要锚定位点显示强烈优选相对严格定义的氨基酸残基组。次要位点显示较弱和/或较少严格定义的优选残基，所述严格定义的优选可经常根据较少优选而不是较多优选来更好地描述。另外，一些次要锚定位点中的残基根本不是总被定位与MHC分子上的口袋接触。因此，存在一种肽亚型，其与特定的MHC分子结合并在正在讨论中的位点处存在侧链-口袋接触，并且存在另一种亚型，其显示与相同MHC分子的结合，所述结合不依赖于肽在MHC分子肽-结合沟中呈现的构象。C-末端残基(PΩ；ω)优选是主要锚定残基。对于许多研究更好的HLA分子(例如A2，A68，B27，B7，B35和B53)第二位置(P2)也是一个锚定残基。然而，也已经观察到中央锚定残基，其包括HLA-B8中的P3和P5，以及分别在鼠MHC分子H-2Db和H-2Kb中的P5和PΩ(ω)-3。因为更稳定的结合通常将改善免疫原性，不管它们的位置，在设计变体中优选锚定残基是保守的或最优化的。
由于锚定残基通常是位于表位末端附近，肽向上弯曲而到肽-结合沟以外，其允许长度上的一些变化。对于HLA-A68已经发现8-11个氨基酸的表位，对于HLA A2高达13个氨基酸。除锚定位置之间的长度变化之外，已经报道单个残基平截和延伸并且分别在N-和C-末端。在非锚定残基中，一些突出到沟以外，不与MHC分子发生接触但可以用来与TCR接触，对于HLA-A2最经常是P1，P4和PΩ(ω)-1。其它非锚定残基可以变成插入肽结合沟上边缘和TCR之间，与两者接触。这些侧链残基的精确定位，和如此它们对结合，MHC精细构象和最终免疫原性的影响是高度依赖序列的。对于高度免疫原性的表位，它必须不仅促进对于发生激活稳定的足够的TCR结合，而且TCR还必须具有足够高的脱离速率(off-rate)以便多个TCR分子可以顺序与相同的肽-MHC复合体相互作用(Kalergis，A.M.等，Nature Immunol.2229-234，2001)。因此，在没有关于三元复合体另外信息的情况下，当设计变体时，在这些位置的保守和非保守置换都值得考虑。
例如使用任何用于保守和非保守突变的技术和指南可以产生多肽表位变体。变体可以衍生于与天然序列比较的一个或多个氨基酸的置换，缺失或插入。氨基酸置换可以是用另一个具有相似结构和/或化学特性的氨基酸置换一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸置换苏氨酸。该置换被称为保守氨基酸置换，并且所有适当的保守氨基酸置换被认为是一种发明的实施方案。插入或缺失可以任选为大约1-4，优选1-2个氨基酸。通常优选保持肽的“锚定位点”，其负责与正在讨论中的MHC分子结合。确实，在许多情形中通过在锚定位点置换更多的优选残基可以改善肽的免疫原性(Franco，等，Nature Immunology，1(2)145-150，2000)。在保持与原表位充分的交叉反应性以构成有效疫苗的同时，通过用更大体积的氨基酸取代在非锚定位点发现的小氨基酸也经常可以改善肽的免疫原性。通过常规插入，缺失或置换序列中的氨基酸和检验产生的变体通过多肽表位显示的活性可以测定允许的变异。由于多肽表位经常是9个氨基酸，优选对最短的活性表位进行置换，例如9个氨基酸的表位。
还可以通过将任何序列加至多肽表位变体的N末端产生变体。这类N-末端增加可以是从1个氨基酸直至至少25个氨基酸。因为肽表位经常被pAPC中活泼的N-末端外肽酶修剪，必须理解所增加序列中的变异可以对表位活性没有影响。在优选实施方案中，末尾的上游蛋白酶体切割位点与MHC表位N-末端之间的氨基酸残基不包括脯氨酸残基。Serwold，T.等，Nature Immunol.2644-651，2001。因此，可以从比优选9-链节(9-mer)I类基序更大的前体产生有效表位。
通常，就它们对应于在靶细胞或pACP表面上由MHC I实际展示的表位而言肽是有效的。单个的肽对不同MHC分子可具有不同亲和力，与一些结合良好，有些适当结合，还有些一点也不结合(表2)。传统上已将MHC等位基因按照血清学反应性分类，所述血清学反应性不反映在相同类型的等位基因中可以不同的肽-结合沟的结构。类似地，跨越类型(acrosstype)可以共享结合特性；已经将基于共享结合特性的类群称为超类型(supertype)。在人种群中存在许多MHC I等位基因；基于患者的基因型可以选择对某些等位基因特异性的表位。
表2酪氨酸酶207-216(SEQ ID NO.1)与各种MHC类型的预测结合
*HLA肽结合预测(万维网超文本传输协议“访问bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bin”)。
在本发明的另外实施方案中，可以将作为肽或编码多核苷酸的所述表位作为药物组合物给药，例如，疫苗或免疫原性组合物，单独或与各种佐剂，载体或赋形剂结合。应当指出，尽管术语疫苗可以贯穿这里的讨论中使用，该概念可以与包括在这里提及的那些的任何其它药物组合物一起施用或使用。特别有利的佐剂包括各种细胞因子和包含免疫刺激序列的寡核苷酸(如在这里参考的同时待审的申请中所更详细地阐明)。另外，可将编码表位的多核苷酸包含于病毒(例如牛痘或腺病毒)中或微生物宿主细胞(例如沙门氏菌属(Salmonella)或单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes))中，其随后被用作多核苷酸的载体(Dietrich，G.等Nat.Biotech.16181-185，1998)。备选地，可以离体转化pAPC以表达所述表位，或用肽表位脉冲以其自身作为疫苗给药。为了提高这些方法的效率，可以用病毒或细菌载体携带编码的表位，或者与pAPC上发现的受体的配体络合。类似地，肽表位可以与pAPC配体络合或偶联。一种疫苗可以包括多于一个单个表位。
在PCT
发明者约翰·J·L·西马德, 戴维·C·戴蒙德, 刘利平, 刘征 申请人:曼康公司