专利名称：实时定量pcr检测血液样品中癌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本发明涉及一种新的检测血液中微量癌细胞的方法及其试剂盒。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前全球每年至少有700万人死于恶性肿瘤，其中我国约130万，恶性肿瘤已成为继心脑血管病之后人类因疾病死亡的第二位原因。恶性肿瘤中90％以上属于上皮来源的实体肿瘤(俗称癌症，如肺癌、肝癌、胃癌等)，这些恶性实体肿瘤(以下简称肿瘤)致死的主要原因是转移，尤其是全身转移。临床观察到，对病理检查无淋巴结转移的早期肿瘤患者，根治性手术后仍有相当一部分因全身转移而最终死亡，提示在手术时体内已经存在少量癌细胞全身播散但应用现有的诊断手段(如影像学和核医学等)尚无法发现，这类隐匿性的转移(OccultMetastasis，或称微转移，Micrometastasis)是患者术后肿瘤复发转移的一个重要根源。动物实验揭示，当瘤重达到1克(直径≥1cm)时，每天约有106癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液，这些癌细胞在血液中很少死亡，它们通过血液循环转运到各器官后很快穿越血管内皮屏障进入组织，其中98％的癌细胞在组织内凋亡并被机体清除，但仍有2％的癌细胞存活下来并发展成为转移病灶。德国学者曾对骨髓中的微转移癌细胞进行培养，证明此类癌细胞能够在体外生长，并且癌细胞活跃生长者生存期短。因此，血液中出现癌细胞是肿瘤转移的一项早期预警指标，预示转移的风险增高。
建立肿瘤转移的早期预警系统在临床上具有广泛的应用价值，因为该系统不仅有助于对患者进行预后评估，而且更重要的是可以对术后转移进行早期诊断和及时治疗，以期巩固疗效和改善预后。此外，检测血液中癌细胞还可以作为评估晚期肿瘤化疗疗效的一项分子标志，文献报道，化疗后血液中癌细胞消失者预后好、生存期长。因此近十年来从血液中检测癌细胞受到了国内外学者的普遍关注。随着现代免疫学和分子生物学技术的发展，目前已经能够对血液中的微量癌细胞进行检测，表1列举了近年来对6种常见肿瘤患者血液中癌细胞检测的若干结果，上述报道中有6篇附有2年以上的随访结果，证明血液中检出癌细胞与患者预后呈负相关。根据上海市肿瘤研究所的最新统计资料，这些肿瘤的发病率居上海市区恶性肿瘤的前10位，占恶性肿瘤总发病率的70％以上。
表1恶性实体肿瘤患者血液中微量癌细胞检测结果
注CEA癌胚抗原；CK细胞角蛋白；S5A肺癌特异性单抗识别的抗原；MAGE黑色素瘤抗原；EPCAM上皮细胞粘附分子。RT-PCR逆转录-多聚酶链反应；FCM流式细胞仪检测；IHC免疫组化。
但是，目前血液中癌细胞的检测技术还不完善，存在许多问题，一是检测方法不统一，包括各家采用的检测技术和肿瘤标志不一致，研究结果很难相互比较；二是敏感性较低，通常只能从105正常血细胞中检出1个癌细胞，其检测极限相当于40-100个癌细胞/ml全血(按每毫升血含4-10×106白细胞计算)，可能会有一部分患者漏诊；三是大部分肿瘤标志基因在正常白细胞中有“非法表达”(Illegitimate Expression)现象，如采用RT-PCR检测CK-19 mRNA在一部分健康人外周血中可能出现“假阳性”。
因此，本领域中迫切需要建立一种敏感性高、特异性好、适用面广的检测方法。
发明内容
为达到上述目的，本发明第一方面提供了一种体外检测样品中端粒酶逆转录酶的方法，所述方法包括以下步骤在端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制备标准品；根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计引物及Tagman探针；用Taqman技术对端粒酶逆转录酶mRNA的拷贝数进行定量分析。
本发明第二方面还提供了一种体外实时定量检测血液样品中癌细胞的方法，它包括以下步骤用磁性分选技术从血液样品中分离上皮细胞粘附分子阳性细胞；从上述细胞中抽提RNA并获得cDNA；在端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制备标准品；根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计引物及Tagman探针；用Taqman技术对端粒酶逆转录酶mRNA的拷贝数进行定量分析。
本发明第三方面提供了一种用于定量检测血液样品中癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含引物，DNA标准品和Taqman探针，其中所述引物及探针是根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计得到，所述DNA标准品根据端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制得。
本发明的方法通过免疫磁性分选技术从血液中分离上皮细胞粘附分子(EPCAM)阳性细胞后，采用单个细胞实时定量PCR检测俘获的上皮细胞中端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达，从而对血液中的癌细胞作出诊断。本发明的优点是一，可用于几乎所有上皮性恶性肿瘤的检测，适用面广；二，可以对每毫升仅含1个癌细胞的血液样本进行检测，具有较高的特异性和敏感性。
附图简述
图1显示了hTERT基因表达的常规PCR分析结果。
图2显示了hTERT基因表达值经对数转换后的细胞数量与检测结果呈线性关系。
图3A和图3B显示了hTERT基因表达的实时定量PCR检测的结果。
图4A和图4B显示了GAPDH基因表达的实时定量PCR检测的结果。
具体实施方案针对本领域中所存在的上述问题，本发明提出了一套新的解决方案。
首先，本发明选择上皮细胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EPCAM)和人端粒酶逆转录酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)作为区分癌细胞、正常上皮细胞和血液中白细胞的分子标志，从而提供了能够适用所有实体肿瘤的检测技术。
EPCAM是二十世纪七十年代研究肿瘤特异性单克隆抗体时发现的一种胃肠道肿瘤抗原，近二十余年来的研究显示该抗原是实体肿瘤的一种共同抗原，在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌和肾细胞癌等实体肿瘤中均呈高表达。EPCAM属于分子量约40KD的细胞膜糖蛋白，其主要功能是作为细胞膜的离子通道并涉及细胞之间的同源性粘附，并且EPCAM过表达抑制了上皮细胞钙粘蛋白(E-Cadherin)介导的细胞粘附，从而有利于癌细胞转移，因而活跃增殖的高转移癌细胞其抗原表达较高。临床研究表明，EPCAM过表达者容易转移、预后较差。但EPCAM在正常上皮细胞表面也有表达，因而该抗原作为肿瘤标志的特异性不够理想。
肿瘤细胞的一个基本特征是无限制增殖，该特征与hTERT mRNA异常表达有关。目前已知细胞增殖受染色体末端的DNA序列控制，这段DNA由TTAGGG重复序列组成，称为端粒。当细胞每次分裂后，端粒就丢失约150个碱基长度的DNA片段，因此随着细胞的不断增殖，其端粒DNA长度不断缩短，但端粒DNA缩短到一定程度时，细胞就停止生长进入老化期死亡。恶性肿瘤细胞通过启动端粒酶基因表达逃脱上述控制。端粒酶是人体细胞内的一种逆转录酶，由端粒RNA、端粒酶相关蛋白(TEP1)和端粒酶逆转录酶hTERT组成，当TEP1与DNA末端的端粒序列结合时，hTERT就能够以端粒RNA为模板复制端粒DNA，从而使得癌细胞维持恒定的端粒长度，有利于癌细胞无限制生长。由于成年人体内绝大部分细胞，除了原始的干细胞、生殖细胞和活化的淋巴细胞外，均缺乏端粒酶活性，也不表达hTERT mRNA，而85％以上的肿瘤中均可以检测到端粒酶活性和hTERT mRNA，这一特性使得hTERT成为肿瘤细胞的一种理想标志。
因此，将EPCAM与hTERT组合可以鉴别正常上皮细胞和癌细胞，正常上皮细胞的表型为EPCAM+hTERT-，而癌细胞为EPCAM+hTERT+。
第二，在血液中正常白细胞与癌细胞的鉴别也是一个十分棘手的问题。由于血液中癌细胞含量甚少，采用病理形态观察无法找到癌细胞。目前普遍采用RT-PCR等高度敏感的分子检测技术进行分析，但由于正常白细胞存在肿瘤标志基因的非法表达现象，假阳性问题很难排除。通过使用免疫磁性分选技术，可以排除检测过程中正常白细胞的干扰、消除假阳性和提高癌细胞诊断率。
第三，采用磁性分选技术从血液中分离获得的EPCAM+细胞多数是肿瘤细胞，但其中含有少量正常上皮细胞的可能性还不能完全排除，因此尚需进一步鉴别。但经过磁性分选后得到的细胞数量很少，必须采用高度敏感的检测技术才能分析。目前国外已有采用RT-PCR或IHC等技术分析俘获的上皮细胞中癌细胞成分的成功报道，但这些分析方法的敏感性还可以进一步提高，例如，采用实时定量PCR技术至少能够使检测的敏感性提高100倍以上。
实时定量PCR是根据Taqman技术发展起来的一项新颖的基因检测方法，其原理是将靶基因特异性的一组引物和荧光标记探针与模板cDNA进行杂交，然后在多聚酶链反应过程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探针3’-端的荧光淬灭基团，获得荧光激发信号，后者与模板量呈正相关。应用这一技术可以从1-10pg RNA中检测到靶基因mRNA的表达，由于1个细胞中至少含有10pg RNA，因而实时定量PCR的检测极限可以达到1个细胞/样本。
本发明提供了一种单个细胞实时定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)技术，用于检测hTERT基因表达，其检测极限达到1个细胞/样本，与常规PCR比较敏感性提高了100倍。
本发明另一方面还提供了一套PCR引物及探针，能够特异性地扩增hTERT和内参照基因GAPDH的mRNA。具体而言，发明者根据Genbank数据库中公开发表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美国赛百盛公司提供的引物设计软件，根据端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间和第1657-1787位核苷酸区间分别设计了2组引物和探针，建立了hTERT和GAPDH的实时定量PCR检测方法。
然而，本领域技术人员应当能够理解，列举上述具体的两组引物和探针仅仅是为了描述本发明，它们并不起任何限制性的作用。本领域技术人员在阅读了本说明书后，能够采用常规的手段在端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间内通过适当选择其他引物来合成DNA标准品，也能够在端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间内选择其它合适的引物和探针来达到本发明的目的。
实时定量PCR通常分为相对定量和绝对定量二类。相对定量分析以靶基因阳性表达的细胞作为标准，通过分析靶基因与内参照基因(如GAPDH等)的比值，获得待测样本中靶基因表达的相对值。这种方法的优点是容易开发，但所得的数值受阳性标准细胞的影响，不同的实验室若采用不同的阳性细胞作为标准，则结果难以相互比较。绝对定量是采用拷贝数已知的DNA片段作为标准，该片段可采用基因克隆或PCR扩增获得。由于绝对定量检测是以一种可以标准化的DNA参照物作为基准，因而不同实验室的检测结果具有可比性。绝对定量PCR检测技术是定量PCR的发展方向，近年来已被越来越多的研究者所采用。目前国外多采用相对定量PCR检测癌细胞中hTERT mRNA表达，其局限性已被大家所认识。本发明采用绝对定量PCR方法较好地解决了上述问题。
癌细胞稀释试验显示，该方法的检测极限达到1个癌细胞/样本，因而发明者将该技术称为单个细胞实时定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)。将该方法与常规PCR进行了比较，证明实时定量PCR检测的敏感性可以提高100倍。此外，发明者应用该方法对10例正常肺组织和55例肺癌组织中hTERT mRNA含量进行了分析，确定了正常肺组织中hTERT基因表达的标准值。按此标准，肺癌组织中hTERT阳性表达率为69.1％。
另外，发明者对27例健康人和60例晚期肺癌病人血液中癌细胞进行了分析，结果显示健康人血液经EPCAM特异性免疫磁性分选后未能检出癌细胞，肺癌病人血液中癌细胞检测阳性率为71.7％。说明本申请具有高度的特异性和敏感性，可以对血液中存在的微量癌细胞进行检测。
以下借助非限制性实施例详细描述本发明。
实施例1单个细胞实时定量PCR检测技术1.1材料与方法人体肺癌细胞株H460由美国德州大学MD Anderson癌症中心Paul J Chiao教授惠赠。胎牛血清及DMEM培养液为GIBCO公司产品。Trizol RNA抽提试剂盒购自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒购自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技术有限责任公司合成。荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。
根据Genbank数据库中公开发表的hTERT(AF015950)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美国赛百盛公司提供的引物设计软件，分别设计了2组引物(表2)。
表2 PCR引物及探针序列
选择活跃增殖期细胞按试剂盒要求抽提总RNA，采用紫外分光光度计(Biophotometer，德国Eppendorf公司)测定A260及A280。
取2μg RNA按试剂盒要求合成cDNA，反应体积为20μl。
(1)实时定量PCR检测(a)DNA标准品制备应用引物1对cDNA进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化试剂盒(购自上海申能博彩公司)纯化后采用紫外分光光度计测定双链DNA含量，纯化产物中的基因拷贝数按下述公式计算基因拷贝数/μl＝A260/13.2×片断长度(kb)]×6.02×1011
(b)定量PCR反应母液10×PCR反应缓冲液2.5μl，250mM MgCl20.75μl，100mM上游及下游引物2各0.1μl(400nM)，50μM荧光素标记探针0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，热启动Taq酶(TaKaRa Ex Taq HS)0.25μl(1.25U)，加DEPC-H20至23μl。上述反应母液保存于-70℃。
(c)定量PCR反应液23μl反应母液中加入2μl cDNA。
(d)定量PCR反应条件50℃预热300秒；95℃变性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40个循环，60℃检测；37℃30秒。
定量PCR仪为LightCycler(瑞士Roche公司)。
(2)常规PCR检测PCR反应混合液与定量PCR同，不含荧光素标记探针，加石腊油30μl覆盖。
PCR反应条件为95℃变性5min；95℃30s，60℃45s，72℃72s，35个循环；72℃延伸7min。
PCR产物经1.6％琼脂糖电泳100V 30min，RB染色摄片。
1.2结果A、实时定量PCR的标准曲线在基因拷贝数为105-108范围内，应用实时定量PCR检测能够给出线性结果，其标准曲线的相关系数R均＞0.999(见图3和图4)。此外，反应母液保存于-70℃条件下在6个月内非常稳定，不同实验间误差≤5％。
B、实时定量PCR与常规PCR结果比较将H460细胞稀释至2×102/ml-2×107/ml，分别取50μl(内含10-100万个癌细胞)抽提RNA并全部用于合成cDNA。取cDNA产物的1/10(2μl)进行常规PCR及定量PCR分析，比较二者的检测敏感性。
图1显示了常规PCR的分析结果，表明该方法在100个癌细胞/样本时可以观察到产物条带。
表3为采用定量PCR的分析结果，2次重复实验显示，在1-105细胞范围内，hTERT基因表达值与细胞数量呈正相关(图3)，检测极限为1个癌细胞/反应。因而定量PCR的检测敏感性较常规PCR提高100倍。
表3 H460细胞系列稀释后定量PCR检测hTERT基因表达
*hTERT mRNA拷贝数/反应实施例2肺癌组织hTERT基因表达的定量PCR分析2.1材料与方法55例非小细胞肺癌，男性42例，女性13例。所有肿瘤组织均经病理检查证实，组织类型为腺癌22例，鳞癌20例，腺鳞癌13例。病理分期为I期18例，II期12例，III期25例。
10例正常肺组织取自距离肺癌病灶5cm以上的手术切除肺叶，经病理检查不含癌组织。
实验所用试剂及方法详见实施例1。
2.2结果10例正常肺组织中hTERT表达值为4.33±2.41(单位拷贝数/103GAPDH拷贝)。55例肺癌组织中hTERT表达值为45.82±159.11。以正常肺组织hTERT均数+2标准差(10.0)作为阳性标准，则肺癌中hTERT阳性率为69.1％(38/55例)。
实施例3肺癌病人外周血微转移癌细胞中hTERT基因表达的定量PCR分析3.1材料与方法60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，组织类型为腺癌55例，肺泡细胞癌5例，其中42例未接受过手术治疗，20例为术后复发。
27例健康志愿者，男性20例，女性7例，均为在校大学生。
所有人员均在知情同意下采集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。
血液样本经1500rpm离心10min后去血浆，用生理盐水加至5ml，然后每样本中加入50μl EPCAM抗体交联的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室温下以30rpm转速颠倒混匀2小时，按试剂盒要求分离阳性细胞组分。-70℃保存待测。
实验所用试剂及方法详见实施例1。
3.2结果27例健康人血液样本中20例未检测到GAPDH mRNA，表明经磁性分选后未获得上皮细胞。7例样本检测到GAPDH基因表达，但hTERT mRNA低于阳性标准，说明所得的上皮细胞中不含癌细胞。
60例肺癌血液样本11例未检测到GAPDH mRNA表达，49例检测到GAPDH基因表达，其中6例hTERT含量在阳性标准以下，其余43例中hTERT含量高于阳性标准，癌细胞检测阳性率为71.7％(43/60例)。
表4列举了肿瘤原发组织和外周血癌细胞中hTERT基因表达的检测结果。实验结果揭示，hTERT的阳性检出率在二者间基本相同。说明本申请具有高度的特异性和敏感性，可以对血液中存在的微量癌细胞进行检测。
表4肺癌原发组织和外周血癌细胞hTERT基因表达分析
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。
序列表<110>董，强刚<120>实时定量PCR检测血液样品中癌细胞的方法<130>041070<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cacatcgctc agacaccatg 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>探针<400>10ggccaagttc ctgcactggc tga 2权利要求
1.一种体外检测样品中端粒酶逆转录酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤在端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制备标准品；根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计引物及Tagman探针；用Taqman技术对端粒酶逆转录酶mRNA的拷贝数进行定量分析。
2.一种体外实时定量检测血液样品中癌细胞的方法，其特征在于，它包括以下步骤用磁性分选技术从血液样品中分离上皮细胞粘附分子阳性细胞；从上述细胞中抽提RNA并获得cDNA；在端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制备标准品；根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计引物及Tagman探针；用Taqman技术对端粒酶逆转录酶mRNA的拷贝数进行定量分析。
3.用于定量检测血液样品中癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物，DNA标准品和Taqman探针，其中所述引物及探针是根据端粒酶逆转录酶基因第1657-1787位核苷酸区间设计得到，所述DNA标准品根据端粒酶逆转录酶基因第1521-1819位核苷酸区间制得。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述引物具有SEQ ID NO8、9所示的序列。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述探针具有SEQ ID NO10所示的序列，且其5′端与荧光报告基团相连，3′端与荧光淬灭基团相连。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述DNA标准品用具有SEQ ID NO6和7所示序列的引物扩增获得。
全文摘要
本发明提供了一种体外定量检测血液样品中癌细胞的方法，它包括以下步骤用磁性分选技术从血液样品中分离上皮细胞粘附分子阳性细胞；从上述细胞中抽提RNA并获得cDNA；在端粒酶逆转录酶基因第1521－1819位核苷酸区间制备DNA标准品，在端粒酶逆转录酶基因第1657－1787位核苷酸区间设计引物及Tagman探针，用Taqman技术对端粒酶逆转录酶mRNA的拷贝数进行定量分析。本发明还提供了在体外检测样品中端粒酶逆转录酶的方法以及用于定量检测血液样品中癌细胞的试剂盒。
文档编号C12Q1/25GK1673387SQ200410017149
公开日2005年9月28日 申请日期2004年3月24日 优先权日2004年3月24日
发明者董强刚 申请人:董强刚