专利名称：新多抗菌素及制备方法和所产生的农作物病害防治药物的制作方法
技术领域：
本发明属于新抗生素及其制备和应用，尤其是属于一种新多抗菌素及其制备方法，以及以该抗生素为有效成份的园艺和农作物病害的防治药物。
背景技术：
长期以来，化学农药的使用对人体、土壤、植物及环境所造成的污染危害及残留问题已引起人们的高度重视。随着农用抗生素的应用已取得了一定的效果。本发明为了寻找出新的有效的农用抗生素，从以往已知微生物菌种中筛选并改进了发酵培养及提取分离方法，然后对这些抗生素分别进行精制、鉴定和开发应用，以增加在作物病害防治中可选择的生物农药的新种类。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以链霉菌属的微生物为产生菌的新抗菌素及其培养、分离、制取的方法，进而开发出一种对植物多种病害有效、低毒、低残留，并能促进作物正常生长的生物农药。
使用的微生物本发明使用的微生物属不吸水链霉菌(S.ahygroscopicus Yan ea al.1962)。该菌种在中国科学院微生物研究所和浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所均有保存并能获得。
使用菌种的性质形态特征基内菌丝体呈分枝状，在合成培养基上孢子丝为单搓分枝，起初为直状后波曲，成熟后形成不同圈数的螺旋，孢子大小不等，近圆形至长方形，3.5～6.5×0.8～1.1微米，孢子表面有短刺。
培养特征在合成培养基上气生菌丝浅褐色至褐灰色，孢子呈绒粉状有时为堆粉状，基内菌丝为浅黄褐色，逐步加深呈黄褐色或葵黄色，在马铃薯培养基上能产生茶褐色的可溶性色素。
生理生化特性菌种能使牛奶胨化，使明胶液化，尤其是分解淀粉的能力强，但不分解纤维素，不产生硫化氢和黑色素。有药香味。
碳源利用特点在碳源利用方面，淀粉的利用能力强，也能利用果糖、半乳糖、肌醇、饴糖和七叶苷等。对蔗糖利用可疑，不能利用乳糖、棉子糖、鼠李糖和山梨糖等。
细胞壁成分分析特征(1)氨基酸分析 以2，6-二氨基庚二酸和甘氨酸为对照，以菌种细胞壁的水解物进行氨基酸分析，结果含有2，6-二氨基庚二酸和甘氨酸，所以该菌的细胞壁类型属于细胞壁I型。
(2)糖份分析 菌种细胞壁的水解物进行糖份分析，结果证明细胞含有葡萄糖，未发现有半乳糖、阿拉伯糖、马杜拉糖和木糖等有特征性的糖成份，表明该菌细胞壁属糖C型，根据细胞壁的成份分析，该菌属链霉菌。
使用菌种的发酵培养方法可以采用常规设备发酵生产，也可以采用电脑程控系统进行发酵生产。为了有利工业化生产，通常可以采用液体培养，将该菌种的孢子悬浮液或菌丝体进行接种，在发酵过程中要求进行通气搅拌。
发酵所采用的培养基，可由碳源、氮源以及其他营养成份和矿物元素等配制而成。其中碳源可用甘油、糊精、饴糖、淀粉、肌醇、半乳糖和七叶苷等；氮源可为花生饼粉、豆饼粉、蛋白胨、米糠、麸皮、铵盐、硝酸盐、尿素、硫酸铵等；其它无机元素，适当加入钙、磷、锰、锌、铁、铅和钴等；同时为了防止发酵泡沫还可以加入一定量的动、植、矿物油等作为消泡剂。若受设备条件限制，也可采用固体培养发酵，培养基主要成份同液体培养基。
对菌种的培养温度、时间、通气量以及发酵周期并无严格的限制，以在不同的生产条件下，菌种能正常生长为准，对其各种发酵条件可以作适当的调整。例如，培养基的pH范围可为5～9，培养温度宜在25～35℃，通气量在1∶0.2～1∶1.5。
新多抗菌素的分离、提纯新多抗菌素的分离菌种的发酵产物经过酸化后，进行固液分离，含有多抗菌素的液体通过吸附法或用732等树脂进行分离，用不同浓度的NH4OH洗脱，也可用其他稀碱液洗脱，浓缩，然后用硅胶柱进一步提纯，即以异丙醇装柱、湿法上样，用异丙醇∶水分级梯度洗脱，分部收集，通过检测以富含新多抗菌素的254nm～282nm部分合并浓缩，可得含量较高的新多抗菌素的粗品。
新多抗菌素的纯化新多抗菌素正相制备薄层层析法，以粗品上样，用异丙醇∶水加少量碱为展开剂，自铺硅胶板(16克硅胶加40毫升0.5％CMC-Na双蒸水，铺20×20cm硅胶板3-4块，室温干燥)，展开4小时后刮取新多抗菌素部分，用异丙醇洗脱，浓缩获得粗晶品干燥备用。
结晶的取得将上述粗晶品以乙醚洗涤，干燥后加少量的异丙醇溶解，滴入乙酸乙酯，静置，即可以慢慢地析出结晶，抽滤去母液可得脱色结晶。
用反相色谱提纯上述结晶物，以极少量的双蒸水溶解，然后加入到反相制备色谱柱中，以2-5％的甲醇溶液洗脱，以紫外260nm检测之，分部收集，挥去甲醇溶液就可以得到多抗菌素的纯品，进行光谱分析。
新多抗菌素理化特性、光谱特征1、具有典型的脲核苷酸的紫外吸收峰(220～320nm之间)，λmax(in MeOH)min为261.8±1nm和207.6±1nm为脲嘧啶类核苷酸所特有的吸收峰。
2、从1HNMR谱和1H-1Hcosy看在5.7-5.9ppm处一个异头质子峰，为碱基和糖戊甙的质子峰，从偶合常数判断为α构型，在3.8-4.4ppm间五个典型的糖环质子，并通过1H-1Hcosy光谱可以看出之间相互联接，和已知的五碳糖比较它是属于呋喃环的糖。
3、从光谱分析特征来看，其红外光谱和紫外光谱和多氧霉素有相似之处，因为有类似的碱基，但从1HNMR光谱、1H-1Hcosy光谱以及ESI-MS光谱发现和多氧霉素有区别。
4、从已经新建立的新多抗菌素分离流程，可以得到纯度为99％以上的新多抗菌素。其稳定性试验表明新多抗菌素对热、对光均稳定，可以结晶，结晶为针状或白色粉末，易溶于水，少量溶于乙醇、甲醇、丙酮中，不溶于苯、乙酸乙酯、石油醚、正己烷等有机溶剂。对酸稳定在pH2-3之间，可保存2-3年，但对碱不稳定。
5、从其ESI-MS、1HNMR、13CNMR、1H-1Hcosy光谱以及红外光谱、紫外光谱等，确定其分子量为243.06±1，分子式为C9H10O6N2，化学结构为一新的多氧嘧啶核苷类物质。
6、推定结构式 新多抗菌素的加工配制本发明在用作瓜果蔬菜以及粮、棉、油等作物作抗菌剂时，可同样使用该技术领域中已知农药所通用的液相，固相载体及乳化分散剂等助剂。并可以配制成液剂、颗粒剂、粉剂、乳油、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂等任意的剂型。这些载体中固相载体可以是粘土、高岭土、皂土、酸性土、硅藻土、硝化纤维素、淀粉、阿拉伯胶等，液相载体可以是水、含水乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇等，也可以是甲基甲酰胺、乙二醇、二甲苯等。同时，在制剂中一般可以适当添加一些助剂，如高级醇的硫酸脂、聚氧化乙烯、烷基烯丙基醚、烷基烯丙基、乙二醇醚、烷基烯丙基无水山梨糖醇、月桂酸脂、烷基烯丙基磺酸盐、季胺盐、聚烯化氧等，通常在各种制剂中有效成分的配比，在乳剂及可湿性粉剂中为1～90％，在液体剂型中为1～20％，油剂中为0.1～10％，还可以根据不同的使用目的而适当加以增减。
另外，本发明的制剂还可以和其他杀菌剂，尤其和多抗灵生物农药在一起防治效果更显著，其次还可和除草剂、杀虫剂、肥料物质、土壤改良剂等配合使用，但与碱性农药如波尔多液、石硫合剂等不能混配。
本发明的有益效果是，以不吸水链霉菌(S.ahygroscopicus Yan et al.1962)为产生菌，经培养发酵所产生的新多抗菌素，对园艺、蔬菜、农作物的立枯病、炭疽病、霜霉病、白粉病、纹枯病及枯萎病等多种真菌性病害有显著的防效；在防治作物病害的同时，兼有促进作物生长的作用；此外，该抗菌素对使用环境和人、畜均较为安全。
图1为新多抗菌素UV(紫外光谱)图谱图2为新多抗菌素IR(红外光谱)图谱图3为新多抗菌素ESI-MS(质谱)图谱图4为新多抗菌素1HNMR(氢谱)图谱图5为新多抗菌素13CHNMR(碳谱)图谱图6为新多抗菌素1H-1Hcosy(二维核磁共振)图谱。
具体实施例方式
以下，就本发明的制造实施、试验事例做具体的说明，但这并不是意味着对本发明有所限定。
制造例按淀粉7％、蛹粉1.5％、饼粉2％、NaCl 0.15％、KH2PO40.05％、MgSO40.005％、余量为水的重量比配制成25吨发酵罐装量为60-70％的培养基，pH为6～9。将新多抗菌素生产菌种不吸水链霉菌接种到经过常规方法灭菌并冷却到28～30℃的发酵罐培养基中，29℃经过60小时通气搅拌发酵，通气量1∶0.4～1∶1.5。发酵产品固液分离，再经过真空薄膜浓缩可以制成1％-20％的液体剂型，也可以通过上述的精制方法提取结晶，制成乳剂、油剂等，也可以通过固相载体制成粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、片剂等。
实施例1液体剂型将发酵产物通过板框压滤进行固液分离，所得液以酸性水为液相载体，经加工配制后用真空薄膜浓缩器浓缩。通过发酵效价检测分别可以控制制成1％、2％、3％、5％到20％的液体产品，装瓶，封口即成。
实施例2粉剂及精品发酵液通过上述新多抗菌素的精制方法制成粗晶，以高岭土为固相载体，分别配制成有效成份含量达到20-45％的粉剂，也可以精制成98％的精品。
实施例3可湿性粉剂将10份新多抗菌素的粗晶与5.8份十二烷基磺酸钠、2.2份二苯甲烷二磺酸钠甲醛聚合物及82分陶土混合，粉碎过200目即可得到100份制剂。
实施例4颗粒剂将10份新多抗菌素粗晶品加入16份硅藻土、72份皂土以及2份十二烷基硫酸混合，造粒即得100份制剂。
试验例药剂按实施例1制成的新多抗菌素的1％液体制剂，分别用水稀释50倍、100倍、150倍，另以60％百菌清500倍与20％粉锈宁800倍及清水作对照。
处理分别以感染有立枯病与白粉病的基质稀释液喷布于黄瓜植株叶和茎秆进行人工接种；每处理3次重复；接种后即喷药一次，间隔一周后再喷药一次。
调查发病程度分为6级，得出发病指数后分析防治效果见下表1 对黄瓜立枯病的防治试验结果处理 发病率％ 防治效果％清水CK100 --60％百菌清500倍 21.5 78.5新多抗菌素50倍 0100新多抗菌素100倍0100
表2 对黄瓜白粉病的防治试验结果处理 发病率％防治效果％清水CK 70 --20％粉锈宁800倍 15.1 84.9新多抗菌素50倍 0 100新多抗菌素100倍0 100新多抗菌素150倍 10 90表3 对感染立枯病黄瓜的防治及促生长作用稀释倍数株高mm 叶宽mm 备注CK 144 6050 387.080.7 结实率高100 377.590.2 结实率高150 341.576.0 结实率高表4 对感染白粉病黄瓜的防治及促生长作用稀释倍数株高mm 叶宽mm 备注CK 335.08550 618.5102.7 结实率高100 696.5108.88结实率高150 585.3110.8 结实率高田间防治试验结果表明，新多抗菌素能够防治多种农作物病害，并有促进农作物生长的作用。
权利要求
1.一种新多抗菌素，其特征在于该抗菌素的有效成分为新多氧嘧啶核苷类活性物质，具有专有光谱分析特征，其分子式为C9H10O6N2，分子量为243.06±1，结构式为
2.一种制备如权利要求1所述新多抗菌素的方法，包括以下步骤(1)菌种培养A、所用菌种属已知的不吸水链霉菌(S.ahygroscopicus Yan et al.)；B、培养基为常用碳源、氮源类，再加无机盐类；C、将孢子悬浮液或菌丝体培养液接种到培养基上，可用发酵罐液体通气搅拌培养或固体培养，温度为25～35℃，pH为5～9，经过40～96小时得到发酵液。(2)抗菌素的提取将发酵液固液分离，用常规离子交换、萃取和/或层析以及色谱分离技术，提取出抗菌素精品。
3.如权利要求2所述制备新多抗菌素的方法，其特征是所述新多抗菌素的色谱分离富集部分为254nm～282nm。
4.一种农作物病害的防治药物，其特征在于该药物的有效成分为权利要求1所述的新多抗菌素，并以通用的液相或固相载体为辅料，配制成任意的剂型，其有效成份抗菌素的重量百分比，在乳剂及可湿性粉剂中为1～90％，在液体剂型中为1～20％，油剂中为0.1～10％。
全文摘要
本发明公开了一种新多抗菌素及其制备方法和由此产生的农作物病害防治药物。该抗生素的产生菌为不吸水链霉菌(Sereptomyces ahygroscopicus)，分子式为C
文档编号C12P17/16GK1563000SQ200410032099
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者夏湛恩, 俞晓平, 吕仲贤, 陈建明, 郑许松, 徐红星, 陈列忠, 张珏锋, 吴文娟 申请人:浙江省农业科学院