专利名称：手术中的淋巴结检测的制作方法
背景技术：
本发明涉及分子诊断领域。
淋巴结增生在很多实体瘤中是最强的预后因素，而且淋巴结微转移的检测是病理学者和外科医生最为关注的。目前的淋巴结评估涉及H&E染色组织切片的微观检验，并有三个主要局限性(a)容易遗漏单个肿瘤细胞，或细胞的小病灶；(b)不能快速获得结果，意味着岗哨淋巴结分析的任何阳性结果需要另一个外科手术来切除腋淋巴结和(c)只研究了一个或两个组织切片，因此每个淋巴结的大部分没有被检验。连续切片有助于克服取样误差问题，而免疫组织化学(IHC)可用于鉴定单个肿瘤细胞。但是，这些方法的组合对于常规分析来说过于昂贵和费时，并仅限于特殊情况如岗哨淋巴结检验。
外科决定常常基于手术中的淋巴结冷冻切片分析；但是，这些方法的灵敏度相对较低，相当于标准H&E病理学的50-70％，导致过高的二次手术率。没有淋巴结增生的0期和I期乳癌患者的5年存活率分别为92％和87％。另一方面，有淋巴结增生的晚期乳癌患者的5年存活率显著降低。例如，II期乳癌的存活率只有75％，III期为46％，IV期为13％。尽管淋巴结阴性的乳癌患者有提高的存活率，但是20-30％组织学上结节阴性的患者疾病复发。这很可能是由于包括与结节取样相关问题的微转移检测现有技术的局限和检测单个肿瘤细胞或小肿瘤病灶的低灵敏度。
除了在乳癌结节中需要更准确和灵敏的微转移检测之外，在黑素瘤结节中以及更准确的确定外科手术的范围中也有一个快速和灵敏测试的相似需要，尤其是在手术中安排中。
聚合酶链式反应(PCR)是在这种安排中有用的分子生物领域中一个强有力的工具。这种技术可以将少量核苷酸片断复制/扩增到可被有效分析的数量。此外，随着实时定量RT-PCR(Q-PCR)的发展，这种技术变得更加可靠和适合于自动操作。Q-RT-PCR较少受到污染，并能够量化基因表达。这种量化可用于手术中淋巴结分析的微转移检测。除了优点，分子诊断中的PCR还有一些局限，使它难以用于典型的临床诊断安排，尤其是手术安排。
这种局限中的一个是进行PCR诊断通常所需时间。典型PCR反应需要数小时，而不是几分钟。如果这种技术将在手术中使用，那么减少进行一个PCR反应所需时间是必需的。更进一步的，尽管Q-RT-PCR能产生定量结果，至今还没有已知的关闭值，用于将基于这种技术的阳性结果从阴性结果中区别开，也是不清楚哪个核苷酸片断被最好检测并与微转移存在相关。扩增和检测核苷酸片断的其它方法也存在并且都遭遇相似的问题。
一种克服了现有困难的手术中的分子淋巴结检测将被医学界接受。
发明概述本发明是一种用于微转移的手术中淋巴结检测。外科医生在外科手术过程中根据已知方法确定岗哨淋巴结。如下所述切除和制备岗哨结节。然后从岗哨结节中快速提取核苷酸(如，RNA)。如果存在指示微转移的标记，就对其进行扩增和检测。外科医生然后根据该标记的检测结果采取行动。
这种检测优选基于一种快速PCR和RT-PCR方法，该方法能够在几分钟内完成整个PCR反应，从而允许在手术诊断中使用PCR来检测岗哨淋巴结的微转移。
本发明的一个方面，一种手术中的分子诊断方法包括在外科手术过程中采用下述步骤从患者获得组织样品；从该样品提取RNA，通过核苷酸扩增和检测分析样品；并确定是否存在一个或多个基因表达标记超过了关闭值。关闭值可能是绝对值或相对于对照基因的值。
本发明的另一个方面，基因表达标记是特定组织如乳腺组织的特异性核苷酸片断。
本发明的另一个方面，基因表达标记是恶性肿瘤的指示性核苷酸片断。
本发明的另一个方面，淋巴结样品被匀质的，然后被稀释以确保即使采用加速的提取方法也能提取到足够的RNA。
本发明的另一个方面，标记是乳腺珠蛋白(mammaglobin)(Seq.ID.No.17)和用于乳癌诊断的PIP(Seq.ID.No.18)，B305D(特别地，同种型C，Seq.ID.No.14)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No.-)，以及用于黑素瘤诊断的酪氨酸酶(Seq.ID.No.22)和MART 1(Seq.ID.No.21)。
本发明的另一个方面，微转移通过包括以下步骤的方法在手术中被检测从一个岗哨淋巴结获得RNA；实行一个特异于一个或多个关注基因的定量RT-PCR方法，并确定是否存在超过预定关闭的标记。关闭值可能是一个绝对值或一个相对于对照基因表达的值。
本发明的另一个方面，包含用于进行微转移的手术中淋巴结检测的试剂的试剂盒。
图1表明溶解产物的稀释对RNA回收的影响。
图2表明稀释的影响。
图3显示不同乳腺细胞类型中乳腺珠蛋白的表达。
图4显示不同乳腺细胞类型中B305D的表达。
图5显示不同乳腺细胞类型中乳腺珠蛋白和B305D的组合表达。
发明详述提供了手术中癌症诊断的方法的。这些方法采用从淋巴结提取核苷酸的快速方法，以及扩增和检测指示转移的核苷酸片断的方法(这种片断在此称作为“标记”)。
本发明方法的一个重要方面是快速扩增和检测指示某种基因表达的标记。只要能在手术中检测可接受的时期内进行(如不超过35分钟)，任何可靠的、灵敏的和特异性的方法都可以使用。这包括PCR方法，滚环扩增方法(RCA)，连接酶链式反应方法(LCR)，链置换扩增方法(SDA)，核苷酸序列基础扩增方法(NASBA)，和其它方法。涉及的快速分子诊断方法最优选定量PCR方法，包括QRT-PCR。
不考虑应用的扩增方法，从用于进行检测的组织中充分地取样是重要的。这包括正确的剪切和处理岗哨淋巴结，以及从中提取RNA。一旦获得结节，重要的是正确地处理以便存在的任何癌症细胞都能被检测出来。
多种方法能用于从组织样品提取核苷酸。每种情况中的标准操作是费时和困难的，即使使用为这种目的设计的商用试剂盒。典型的商用核苷酸提取试剂盒提取核苷酸至少需要15分钟。本发明的方法中，提取核苷酸的时间少于8分钟，优选的少于6分钟。这些快速提取方法是R.Belly，J.Toner，和J.Backus同期并题为“细胞和组织RNA的快速提取”专利申请的主题，在此合并用作参考。
完整RNA的成功分离一般包括四个步骤细胞和组织的有效裂解，核蛋白质复合物的变性，内源核糖核酸酶(RNAase)的失活以及杂质DNA和蛋白质的去除。用于灭活细胞提取物中的核糖核酸酶的硫氰酸胍盐(GTC)和B-巯基乙醇的破坏的和保护的特性，使它们成为第一步骤的优选试剂。当与表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)联合使用时，破坏核蛋白质复合物，使RNA释放到溶液中，并分离去除蛋白质。稀释存在高浓度的GTC的细胞提取物，导致了细胞蛋白质的选择性沉降但RNA仍保留在溶液中。离心可以分离被沉降蛋白质和细胞DNA的溶解产物，其优选的通过一个柱进行。这些柱可以剪切DNA并降低样品的粘性。RNA纯化优选通过一个含有硅和其它物质的螺旋柱进行。人工破坏细胞和组织可以通过US专利4,715,545中描述的一次性组织研磨机进行。均质时间在1到2分钟内，优选的是30-45秒。样品然后用一个撕碎柱(shredding column)(如，QIAshredder，QIAGEN Inc.，Valencia，CA，或合适的取代物)或一个RNA处理装置如可购自Omni International(Warrenton，VA)的PCR组织均质试剂盒处理，来降低其粘性。RNA通过上述的旋转柱沉降出来，而且离心时间不能超过30秒。当使用如Qiagen，Inc.的那些商业的RNA提取试剂盒时，除了柱干燥步骤外的所有步骤都使用过滤来取代离心。典型地，在过柱之前样品先用等体积的70％乙醇稀释。在过滤冲洗之后，通过离心干燥柱子，在去核糖核酸酶水中洗提RNA。RNA用乙醇选择性沉降出溶液，并结合到一个基质上(优选地，一个含硅的膜或过滤器)。RNA很快的结合到基质中是因为水分子被离液盐破坏，然后核苷酸顺利的吸收到硅中。结合的总RNA通过简单的冲洗步骤进一步从杂质盐，蛋白质和细胞杂质中纯化出来。最后，总RNA通过加入去核酶水从膜中洗提出来。这种快速方法的总时间少于8分钟，优选的少于6分钟。
总的来说，快速RNA提取方法包括以下步骤(a)获得一个来自生物系统的含有细胞的样品，(b)合适地，从样品中去除不含有所关注RNA的细胞，产生一个工作样品，(c)溶解含有所关注RNA的细胞，并制备其匀浆，(d)合适地，稀释该匀浆，(e)使该湿润的匀质工作样品与一个含有或粘附有RNA结合物质的基质接触，(f)使样品接合到基质上，(g)去除杂质和干扰物，(h)干燥基质，和(i)从基质洗提RNA；在使用离心的情况中，在步骤g，h，或i之后使用离心，真空/过滤优选用于提取步骤。
该快速提取过程中涉及的试剂是分析/接合缓冲液(优选地，4.5M胍盐-盐酸，100mM磷酸钠)，冲洗缓冲液I(优选地，5M胍盐-盐酸中37％乙醇，20mM Tris-HCl)，冲洗缓冲液II(优选地，20mM中80％乙醇，2mM Tris-HCl)，洗提缓冲液，和去核酶无菌双蒸馏水。
由于结节中的癌细胞的分布是不均衡的，优选从结节的多切片中采样。合适地，根据病理学研究一个或多个结节。对同一个结节样品分子检测和病理学检查的方法是将该结节切成用于病理学检查的外和内切片和用于分子测试的外和内切片的至少四个切片。由于组织中的转移和微转移在结节或其它组织中的分布是不均衡的，必须获得一个足够大的样品以便转移不被遗漏。解决本发明方法中的取样问题的方法是，匀质一个大的组织样品，然后稀释很好混合的匀质样品，用于后继的分子测试。
一个典型的PCR反应包括多个扩增步骤，或能选择性地扩增目标核苷酸种类的循环。一个典型的PCR反应包括三个步骤一个变性步骤，其中目标核苷酸被变性；一个退火步骤，其中一组PCR引物(正向和反向引物)与互补DNA链退火；和一个延伸步骤，其中一个热稳定性DNA聚合酶延伸引物。重复这个步骤多次，一个DNA片断被扩增并产生一个相应于目标DNA序列的扩增子。典型的PCR反应包括20或更多个循环的变性、退火和延伸。在很多情况中，退火和延伸步骤可以同时进行，在该情况中循环只包括两个步骤。
在该应用RT-PCR的创造性方法中，RT-PCR扩增反应在一个适于手术中诊断的时间内进行，这些步骤中每一个的长度可以在秒的范围内，而不是在分钟内。特别地，用几个能产生热倾斜速率为至少每秒约5℃的新热循环仪，使用RT-PCR扩增为30分钟或更少。更优选地，进行扩增少于25分钟。考虑到这个，PCR循环每个步骤接着的时间不包括倾斜的时间。变性步骤进行的时间为10秒或更少。实际上，一些热循环仪已经设定为“0秒”，其可能是变性步骤合适的持续时间。也就是说，它对热循环仪达到变性温度是足够的。每个退火和延伸步骤最优选都少于10秒，而且当在同一温度进行时，退火/延伸步骤的组合可以少于10秒。但是，一些同源探针检测方法要求一个单独的延伸步骤来实现最快速检测。为了最小化总扩增时间和非特异性副反应的形成，退火温度典型地高于50℃，更优选地，退火温度高于55℃。
由于一些原因没有试验者干涉的单个RT-PCR组合反应是渴望得到的(1)减少试验误差危险，(2)降低目标或产物杂质危害和(3)提高检测速度。该步骤可能包括一个或两个聚合酶。在两个聚合酶的情况中，这些酶中的一个典型是基于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)，一个是热稳定性的基于DNA的DNA聚合酶。为了最大化检测，优选对这两种酶使用一种“热启动”技术形式。US专利5,411,876和5,985,619提供了不同“热启动”方法的例子，在这里合并用作参考。优选方法包括使用一个或多个热活化方法，其隔绝一个或多个充分DNA聚合所需的成分。US专利5,550,044和5,413,924描述了制备用于这些方法的试剂的方法。US专利6,403,341描述了一个涉及化学该变PCR试剂成分之一的隔绝方法。这里都合并用于参考。一个最优选的方面，RNA和DNA依赖的聚合酶活性都位于单个酶中。充分扩增需要的其它成分包括核苷三磷酸，二价盐和缓冲成分。在一些例子中，非特异性核苷酸和酶稳定剂是有益的。
任何特定的基于扩增的分子诊断的特异性，严重地但不是专有地依赖于引物组的同一性。引物组是与目标DNA退火从而扩增目标序列的正向和反向寡核苷酸引物对，从而产生目标序列的特异性扩增子。引物必须能扩增所关注的疾病状态的标记。在本发明中，这些标记是指示乳癌和黑素瘤。
在乳癌的情况中，创造性方法涉及一个特异于乳组织或乳癌组织的组织标记的扩增。使用至少两种标记的组合，以便当淋巴结中存在乳和/或癌细胞时，能在临床上被显著和可靠地检测出。优选地，在一个反应容器中同时扩增和检测标记(如，它们是多元的)。最优选地，引物组与那些标记的特异核苷酸片断互补。标记包括乳腺珠蛋白(Seq.ID.No.17)和下述中的一个或多个(优选一个)B305D(Seq.ID.No.14)，PIP(Seq.ID.No.18)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No._)。组织特异性标记与癌特异性标记的组合提供了分别超过90％和95％的灵敏度和特异性。一些标记存在多种异构体，但这些异构体中的某种比其它异构体更特异于一种组织或癌。在B305D中，最优选的异构体是B305D异构体C。它也是与乳腺珠蛋白标记组合的标记中最优选的。
在黑素瘤中，创造性的方法涉及扩增特异于黑素瘤癌症的标记。这样，引物组与特异于那些标记的核苷酸片断互补。标记包括下述的一个或多个(优选两个或更多个)酪氨酸酶(Seq.ID No.22)和MART1(Seq.ID No.21)。这些标记的灵敏度和特异性超过90％。
反应必须还包含一些特异信号检测的手段。其优选地，通过使用一个检测来自所关注目标序列聚合的DNA序列区域的试剂来完成。当接合于关注的特异核苷酸序列时，检测的优选试剂提供了一个可检测的信号差异。常常，这些方法涉及当接合于所关注的序列时提供增加的荧光的核苷酸探针。创造性方法的PCR反应过程典型地通过分析每个PCR引物组扩增产物的相对速率来监控。监控扩增产物可以通过很多检测试剂和方法来实现，不限于荧光引物，与双链DNA相结合的荧光探针和荧光染料，分子信标，scorpins及其它。监控PCR反应的常用方法采用荧光5’核酸酶检测。这种方法使用某种热稳定性DNA聚合酶(如Taq或Tfl DNA聚合酶)的5’核酸酶活性在PCR过程中裂开一个寡聚探针。在延伸情况下，筛选低聚体来退火扩增的目标序列。探针典型的在其5’末端有一个荧光报告分子，在其3’末端有一个报告分子的荧光猝灭剂。只要低聚物是完整的，来自报告分子的荧光信号就被猝灭。但是，当低聚物在延伸过程中被消化时，荧光报告分子不再接近猝灭。特定扩增的无荧光标记分子的相对积累可以与一个对照样品和/或对照基因例如不限于β-肌动蛋白和PBDG(胆色素原脱氨酶)同样扩增的积累相比较，来决定RNA群中特定RNA的特定cDNA产物的相对丰度。荧光5’核酸酶检测的产物和试剂很容易购买得到，如购自AppliedBiosystems。
优选的检测试剂是常称作“scorpion”，描述于US专利6,326,145和5,525,494，在此合并用作参考。这些试剂包括一个或多个包含一个加尾引物和一个完整的信号系统的分子。该引物有一个模板结合区域与一个含有一个连接和一个目标结合区域的尾巴。在尾巴中的目标结合区域与引物的延伸产物的互补序列杂交。这种目标特异性杂交事件与一个信号系统结合，其中杂交导致一个可检测的改变。在PCR反应中，合理地安排目标结合区域与尾巴区域，以便使尾巴区域保持单链，即未拷贝的。这样，尾巴区域在PCR扩增产物中是不可扩增的。连接包括一个防止聚合酶介导的链在引物模板上延伸的阻断部分。
可以用于在PCR和QRT-PCR中控制和监控扩增积累的仪器和软件包括，购自Cepheid of Sunnyvale，California的Smart Cycle热循环仪，和购自AppliedBiosystem的ABI Prism 7700序列检测系统。
在优选的RT-PCR反应中，某种反转录酶和PCR反应成分的量是非典型的，是为了利用一些热循环仪较快的倾斜次数。尤其是当引物浓度很高时。
典型用于反转录酶反应的基因特异性引物浓度低于20nM。为了取得一个1到2分钟的快速反转录酶反应，反转录酶引物浓度升高到大于20nM，优选至少大约50nM，典型的大约100nM。标准的PCR引物浓度为100nM到300nM。在标准PCR反应中可以使用更高的浓度来补偿Tm的变异。但是，为了实现本发明目的，参考引物浓度用于不需要Tm补偿的情况。当需要或者期望进行Tm补偿时，可以根据经验确定并使用相应较高浓度的引物。为了实现快速PCR反应，PCR引物浓度典型的大于250nM，优选的大于300nM，典型的大约500nM。
商业上使用的诊断，优选使用一个或多个内部阳性对照，其确定进行一个阴性结果的特殊扩增反应。在一个RT-PCR反应中，必须被控制的导致假阴性结果的可能原因包括不充足的RNA量，RNA降解，RT和/或PCR抑制以及试验误差。在基因表达检测中，优选使用一个在所关注的组织中组成型表达的基因。由于几个原因，PBGD(Seq ID No.20)常用作内部对照的基因它在人体中没有假基因，在人体组织中组成型表达，它以相对较低的水平表达，因此不太可能引起所关注的目标序列扩增的抑制。用PBGD作为对照，最小化或消除了由假阴性结果的所有可能来源产生的错误结果。
商业化QRT-PCR用于检测特定核苷酸序列的试剂盒的所述方法是特别有用的。在一个实施例中，试剂盒包括扩增和检测标记的试剂。合适地，试剂盒包括从淋巴结组织提取核苷酸的样品制备试剂和/或制品(如试管)。试剂盒也可以包括最小化样品杂质危害的制品(如淋巴结解剖和制备中的一次性解剖刀和表面)。
在一个优选的试剂盒中，包括上述的一个管的QRT-PCR过程所必需的试剂，如反转录酶，一个反转录酶引物，一个相应的PCR引物组(优选用于标记和对照)，一个热稳定性DNA聚合酶如Taq聚合酶，和一个合适的检测试剂，例如，但不限于一个scorpion探针，一个荧光5’核酶检测探针，一个分子信标探针，一个双链DNA特异性的单染料引物或荧光染料，如溴乙锭。引物的量优选能产生上述高浓度。热稳定性DNA聚合酶是常用的并可购自多个制造商。试剂盒中的附加物质可包括合适的反应试管或小管，一个屏障组合物，典型地有一个蜡珠，合适地包括镁；反转录和PCR阶段的反应混合物(典型地10X)，包括必需的缓冲液和试剂如dNTPs；去核酶或RNA酶的水；RNA酶抑制剂；对照核苷酸和/或任何附加缓冲液，化合物，协作因子(co-factor)，离子成分，蛋白质和酶，聚合物，以及可用于反转录和/或QRT-PCR反应PCR阶段的类似物。合适地，试剂盒包括核苷酸提取试剂和物质。
下面的非限制性实施例有助于更进一步描述本发明。
实施例实时PCR本发明的实施例是基于实时PCR的使用。在实时PCR中，聚合酶链式反应的产物在PCR指数期实时监控而不是在终点进行测量。因此，DNA和RNA的量准确得多，而且是可重复的。荧光值在每个循环中都记录，并代表在扩增反应中那个点的扩增产物的量。反应开始时存在的模板量越多，达到其中荧光信号首次被记作统计学上显著于背景的某个点所需要的循环数就越少，其被定义为Ct值。使用基于荧光的RT-PCR，阈值循环(Ct)概念产生准确的和可重复的量。PCR产物的同源测定优选的基于下述进行(a)双链接合染料(例如SYBRGreen)，(b)荧光探针(例如Taq Man探针，分子信标)，和(c)直接标记引物(例如Amplifluor引物)。
实施例1使用Taqman检测，比较用快速方法与用基于实时PCR的现有技术方法提取的RNA总共16个H&E阳性结节和15个H&E阴性乳结节样品购自GenomicsCollaborative。从每个结节取两个30mg的组织切片。
部分I(现有技术).一个30mg组织切片处理如下加入600μl的RLT缓冲液，样品用一个一次性组织研磨机(cat 15704-126，VWR Scientific，West Chester，PA)手工均质20-40秒。试管在Eppendorf型5415C微型离心机以最大速度离心3分钟。上清液转移到一个新管中，加入1倍体积的70％乙醇。
样品(700μl)加到一个置于QIA vac24真空歧管上的RNeasy小型柱，并用真空。RWI缓冲液(700μl)用于过滤通过该柱。RPE缓冲液(500μl)被滴加柱中并过滤通过。另一个500μl的RPE缓冲液被加入到柱中并过滤通过。RNeasy柱放到一个2ml的收集管中，并在一个微型离心机中以最大速度离心1分钟。然后通过转移RNeasy柱到一个新的1.5ml收集管柱，加入50μl去RNA酶水并以8000X.g离心1分钟，将RNA从柱中被洗提出来。
部分II(快速提取)第二个30mg的乳结节组织切片通过下述方案处理(1)组织切片加入600μl的RLT缓冲液，并用一次性组织研磨机手工均质20到40秒。(2)匀浆用一个QIAshredder柱以最大速度离心30秒。(3)加入1倍体积的70％乙醇到溶解产物中并吹打混合。(4)样品(700μl)然后置于QIA vac24真空歧管上的Rneasy小型柱，并用真空。(5)700μl RWI缓冲液加入到柱中并过滤通过该柱。(6)500μl RPE缓冲液加入柱中并可以过滤通过。(7)把柱转移到一个2ml的收集管中，并以10,000rpm离心30秒。(8)加入25μl去RNA酶水到膜上，柱子以10,000rpm离心30秒来洗提RNA。快速方案中的所有离心步骤在10MVSS VWR型离心机上进行。
提取的RNA被反转录，RNA和cDNA如前所述的进行定量。
为了进行Taqman检测，Taqman Core试剂盒，Gene Amp 10X PCR缓冲液1，Amp Erase Uracil N-糖苷酶，和Ampli Taq金聚合酶都购自Applied Biosystems，Forster City，CA。其它的所有试剂来自如实施例1所述的商业来源。甘油购自SigmaChemical Co(St.Louis，Mo.)，Tween 20 购自Eastman OrganicChemicals(Rochester，NY)。
乳腺珠蛋白引物(Seq ID No.3和Seq ID No.4)由Invitrogen Crop.(Carlsbad，CA)合成，乳腺珠蛋白Taqman探针(Seq ID No.7)来自Epoch Bioscience(SanDiego，CA)。PBGD引物(Seq ID No.8和Seq ID No.9)由QIAGEN Operon(Alameda，CA)合成，探针(Seq ID No.23)由SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)合成。B305D引物(Seq ID No.11和Seq ID No.12)在Invitrogen Corp合成，探针(Seq ID No.13)由Applied Biosystems，Inc.合成，对于所有的Taqman探针，羧基荧光素(FAM)和羧基四甲基玫瑰精(TAMRA)用作染料和促灭对(quencherpair)。
SEQ ID NO.3 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGASEQ ID NO.4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG.CAGASEQ ID NO.7 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTCTTTGTG-TAMRA
SEQ ID NO.8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGGSEQ ID NO.9 CATCTTCATG CTGGGCAGGGSEQ ID NO.23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAG TGT-TAMRASEQ ID NO.11TCTGATAAAG GCCGTACAAT GSEQ ID NO.12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TCSEQ ID NO.13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA为了进行Taqman检测，一个主要混合物通过加入10μl的10X PCR缓冲液#1，14μl的25mM MgCl2，8μl 10mM各种dNTP，1μl的AmpErase UNG(1U/μl)，16μl甘油，1μl 1％w/v Tween 20，0.75μl AmpliTaq Gold(5U/μl)，来自一个5μM母液的每个引物各6μl，0.4μl的一个10μM的探针母液，和水达到一个96μl的终体积来制备。主要混合物(48μl)和2μl来自每个结节样品的cDNA被加入到每个光学反应微量滴定板小孔中。盖上光学盖子后，该板置于一个ABI Prism 7900HT序列测定系统(Applied Biosystems，Inc.，ForsterCity，CA)中进行处理。商业试剂，和Taqman B-actin测定试剂购自AppliedBiosystems，(Forster City，CA)，测定根据制造商建议的方案进行。一个0.02的阈值用于乳腺珠蛋白检测的分析，0.03用于B305D检测，0.08用于B-actin检测，0.1用于PBDG检测。Taqman检测的三次测定的平均值如图1和2所示。
在15个H&E阴性结节样品和16个H&E阳性结节与两个对照cDNA样品中的管家基因B-肌动蛋白与PBDG实时测定的比较如表1所示。这些试验的结果表明本发明的快速方法与标准商业方法(QIAGEN)获得的Ct值一致性较好，说明用快速RNA提取方案提取的RNA与根据一个标准商业方案提取的RNA能进行反转录和RNA扩增到一个相似的程度。
表2基于乳癌标记乳腺珠蛋白和B305D的Ct值，用表1所评估的相同乳癌结节样品比较了基因表达结果。为了确定是否基于实时PCR结果的H&E阳性和H&E阴性乳癌结节样品之间有一个相关，测定了H&E阴性结节样品中的每个标记乳腺珠蛋白和B305DH&E的最低Ct值。任意地，但保守地，H&E阴性样品值低于这个最低值的2.5Ct值的关闭用于H&E阳性样品。在表2中为阴影的样品较高地表达两个乳癌标记，因为Ct值至少比在H&E阴性样品中观察到的Ct值低2.5Ct。使用本发明的快速方法和商业制造商推荐的方案(QIAGEN)测定的这些标记的表达间有一个相关。
使用乳腺珠蛋白作为标记，本发明的快速方法与QIAGEN RNA提取方案的15个H&E结节样品的两个样品的Ct值之间没有严格的相关。这些样品中的GCLNC-24中，Ct值的差异是0.4，其在试验误差的范围之内。第二个样品显示了一个大的Ct值差异。乳腺珠蛋白与B305D中较大的Ct值差异可能是由于在这些样品中难于进行光谱RNA定量以及已确定的淋巴结中转移非均衡分布导致可能取样问题。(Cserni.1999.通过彻底的组织病理学分析确定乳腺癌在腋窝岗哨淋巴结节中转移(Metastases in axillary sentinel lymph nodes in breast cancer asdetected by intensive histopathological work up.)临床病理学杂志(J.ClinPathol)，520922-924.)
表1使用Tapman测试测量看家基因B-肌动蛋白和PBDG，比较用快速方法与现有技术的方法提取的RNA
关闭值 33.7 37.5 36.136.1
表2通过Taqman测试测量癌症基因乳腺珠蛋白与B305D，比较用快速方法与现有技术的方法提取的RNA
关闭值＝ 33.7 37.5 36.1 36.1
实施例2.QIAshredder柱评估这个实施例的目的是为了证实在淋巴结细织均质后使用QIAshredder柱，并离心匀浆仅30秒就可以产生可接受的RNA提取物。
从Genomics Collabrative(Cambridge，MA)获得了一个H&E阴性乳腋结节。一个490mg的组织切片于5.5ml的缓冲液RLT中混合，均质结节。600微升的匀浆被移走，RNA用实施例1中所述的快速提取进行提取。作为对照，另一个600μl的匀浆，除其中3分钟的离心替换QIAshredder柱外，使用同样的快速RNA提取方法处理。对每个反应得到的RNA如实施例1所述进行反转录和定量。使用Taqman探针进行实时PCR。
这些研究的结果表明，包含QIAshredder方法的方案与离心方案有相似的RNA产量，分别为0.31μg/μl和0.34μg/μl。在两个样品中获得了显示高质量RNA的同样的2.1的260/280nm比值。实时RNA检测也表明了，与离心方法相比，用QIAshredder柱提取的RNA具有相似的乳腺珠蛋白Ct值(22.5对2.0)，以及B305D(26.7对26.6)，看家基因PBDG(29.1对29.0)和B-肌动蛋白(SEQ IDNO19，18.5对18.2)。
总的来说，这个试验具有与在均质后用含有QLAshredder代替一个3分钟离心步骤的方法相似的RNA产量、质量和实时PCR扩增结果。这使进行RNA提取所需的时间减少了2.5分钟，其在开发适于手术中和其中需要影响患者治疗的快速结果的其它应用的方案中是重要的。
实施例3.溶解产物的稀释对RNA产量和精确度的影响下面的实施例阐述了溶解产物的稀释对RNA产量和RNA回收(recovery)精度的影响。在这个实施例中，切取20mg，10mg或5mg的冷冻猪结节组织。组织用50ml组织研磨机研磨30秒，并搅拌样品。对于每个结节称重重复三次。将1ml各个溶解产物转移到一个1.7ml微型离心机的离心管中，然后在Eppendorf微型超速离心机中以最大速度(14,000RPM)离心30秒钟。700μL样品通过QIA切碎筒离心，以最大速度离心30秒钟。然后如先前在实施例2的第I部分步骤4-8所述，洗涤该柱、干燥和洗提RNA。通过Gene Spec II定量RNA。这些试验的结果显示于表5中，说明与含有10mg和20mg的重量较大的样品相比，在600ml均质缓冲液中均质的重2.5mg的初始结节组织具有优良的精确度。这些结果表明在较低结节重量时能获得改进的RNA回收精确度。同时，可以预期较稀的匀浆可以更快地滤过柱，并且将更不易存在过滤器堵塞的问题。
实施例4.淋巴结样品RNA的Taqman测试反转录由20μg总RNA于42℃在一个250μl的反应液中反应60分钟合成cDNA，该反应液含有50mM Tris-Cl pH8.3，7.5mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，2000U上标(Superscript)，400U Rnasin，2μg寡dT引物，0.08mg/mlBSA和ACT，CTP，GTP和TTP各0.2mM。生成的cDNA与水以1∶8稀释。
PCR扩增稀释的cDNA各2μl以每孔50ml的总体积在Applied Biosystems7900中进行扩增。扩增按以下方案进行50℃ 2min，95℃ 10min，然后进行(95℃ 15sec，60℃ 1min(B276为58℃)，68℃ 1min)40个循环。反应混合成分和终浓度如下1X Taqman缓冲液A(ABI)，3.5mM MgCl2，0.2mM dGTP，dCTP和cATP，0.4mM dUTP(ABI)，0.01U/μl AmpErase UNG(ABI)，0.375U/μl AmpliTaqGold(ABI)，8％甘油(Sigma)，0.01％Tween 20(Kodak)，引物各0.3μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)，40nM 5’-FAM，3’-TAMRA寡核苷酸探针(Synthegen)。在由PCR产物增加引起荧光强度增加的对数线性范围内，相对于内比染料(ROX)的信号阈值赋予各个引物/探针组。结果的Ct值用于确定所有测试样品基因的相对表达。
所用的引物乳腺珠蛋白引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA探针，SEQ ID NO 7-FAM-TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG-TAMRAB305D引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC探针，SEQ ID NO 24-FAM ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC
PBGD引物1，SEQ ID NO 25-CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA引物2，SEQ ID NO 26-CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA探针，SEQ ID NO 23-FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRAPIP引物1，SEQ ID NO 27-GCTTGGTGGTTAAAACTTACC引物2，SEQ ID NO 28，-TGAACAGTTCTGTTGGTGTA探针，SEQ ID NO 29-FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-TAMRAGABA引物1，SEQ ID NO 30-CAATTTTGGTGGAGAACCCG引物2，SEQ ID NO 31-GCTGTCGGAGGTATATGGTG探针，SEQ ID NO 32-FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACATAMRAB726引物1，SEQ ID NO 33-GCAAGTGCCAATGATCAGAGG引物2，SEQ ID NO 34-ATATAGACTCAGGTATACACACT探针，SEQ ID NO 35-FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG结果附表包含获得的11个组织学阴性和24个组织学阳性淋巴结的Ct值。通过从组织学阳性样品观察到的最小Ct值减去2.5个循环来确定每个标记的阳性关闭。阳性样品用阴影表示。基于这些标准，确定单个标记的检测速率。乳腺珠蛋白与B305DA/C组合检测23/24个组织学阳性样品，获得最佳互补。乳腺珠蛋白，B305D和GABA的组合检测所有的24个样品。见表3。
表3 cutoff 33.8 32.3 33.333.6 37.5检测的阳性样品 19/24 17/24 21/24 10/24 11/24
实施例5.多标记反转录由20μg总RNA于42℃在一个100μl的反应液中利用锚定寡dT引物反应60分钟合成cDNA。稀释的cDNA各20ng以每孔50ml的总体积在AppliedBiosystems7900中进行扩增。扩增按以下方案进行94℃ 2min，然后进行(94℃ 15sec，62℃ 15sec及72℃ 45sec)50个循环。反应混合成分和终浓度如下1X PCR缓冲液(ABI)，2.5Mm终MgCl2，0.05mM dGTP，dCTP，cATP和TTP，0.05U/μl含有一个超过5-20X的2种抗-Taq抗体(TP4-9和TP1-12)的Taq聚合酶，引物各0.2μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)和一个SYBRGreen母液(Sigma)的1∶20000的稀释液。扩增引物序列与那些用于淋巴结的TaqMan测试的一致。一个275荧光单位常用的阈值用于测定Ct值。Ct值然后转换为定量基因表达并相对于一个假定为从背景表达区分淋巴结所需的基因表达的最小水平的关闭值进行划分。
所用的引物乳腺珠蛋白引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGAB305D引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC图3-5中显示的数据表明了组合基因乳腺珠蛋白与B305D信号对获得大量的乳癌样品的平均值的作用。
实施例5纯化的RNA的快速RT-PCR将乳腺珠蛋白体外转录RNA(100,000拷贝)稀释到20ng白血细胞RNA中，并在一个Cepheid Smart CyclerII中于一个含有下述成分的反应液中进行一步RT-PCR扩增50mM N-二(羟乙基)甘氨酸/氢氧化钾，pH 8.2，115mM醋酸钾，8％v/v甘油，0.2mg/mlBSA，150mM海藻糖，0.2％v/v Tween20，0.2mM Tris-HClpH8，3.5mM硫酸锰，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTTP，100U/ml Tth，20μg/ml抗体TP6-25.3，0.45μM乳腺珠蛋白Scorpion和0.5μM乳腺珠蛋白引物。
PCR反应条件如下(星号表明其中荧光被测定的循环部分)条件A-95℃ 3sec，60℃ 7min，70℃ 2min，然后40个循环(95℃ 3sec，54℃6sec*，68℃ 6sec)-总时间＝34min条件B-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40个循环(95℃ 3sec，54℃ 6sec*，68℃6sec)-总时间＝29min条件C-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40个循环(95℃ 3sec，58℃ 6sec*，68℃6sec)-总时间＝26min这个检测的结果如下表所示
从数据可以看出，把反转录步骤由9min减少到3min对检测没有可观察到的影响。把退火温度升高到58℃对扩增只有最小的影响，并把总的RT-PCR时间减少到了26min。可以通过引物和探针结构和较高的最佳检测温度来进一步减少循环的时间。
实施例6检测淋巴结转移的快速多元RT-PCR检测(预后的)在这个实施例中，纯化的淋巴结RNA(每100μl反应液中≥100ng总RNA用于减少产生阳性结果所需的循环数)在一个Cepheid Smart Cycler II中进行一步RT-PCR扩增。反应液含有下述成分50mM N-二(羟乙基)甘氨酸/氢氧化钾，pH8.2，115mM醋酸钾，8％v/v甘油，0.2mg/ml BSA，150mM海藻糖，0.2％v/v Tween20，0.2mM Tris-Cl，pH 8，3.5mM硫酸锰或醋酸锰，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTTP，100U/ml Tth，20μg/ml抗体TP6-25.3，Scorpion和引物各0.4-0.8μM。Scorpion和引物序列设计成使非特异性引物事件最小化，而且与具有下述的快速RT-PCR模式的多元扩增/检测谐调95℃ 3sec，60℃ 3min，然后32个循环95℃ 1sec，65℃ 6sec*，72℃ 3sec)-总扩增时间＝16min。
描述的快速样品制备方法需要≤4min完成(参考申请中的样品制备实施例)，结果总的检测时间≤20min。
为了检测乳癌转移到淋巴结，扩增了下述基因乳腺珠蛋白，B305D和PBGD。乳腺珠蛋白和/或B305D信号指示转移，而PBGD用作一个看家基因。该实施例中，癌症阳性淋巴结的Ct值范围为乳腺珠蛋白的是12-30，B305D的是12-28-在该Ct范围内检测任一基因都能指示一个癌症阳性淋巴结。该实施例中，对照基因PBGD的Ct值必须落在24-30个循环的范围内，以使一个癌症阴性结果被认为是有效的。
为了检测黑素瘤转移到淋巴结，利用同样的条件，除了下述以外(1)处理怀疑含有黑素瘤的淋巴结和(2)扩增以下基因MART，酪氨酸酶和PBGD。MART1和/或酪氨酸酶信号指示黑素瘤转移到淋巴结，而PBGD用作一个看家基因。该实施例中，癌症阳性淋巴结的Ct值范围为酪氨酸酶的是18-30，MART1的是12-27-在该范围内检测任一基因都能指示一个癌症阳性淋巴结。该实施例中，对照基因PBGD的Ct值必须落在24-30个循环的范围内，以使一个癌症阴性结果被认为是有效的。
序列表CPCH0461241<110>Johnson & JohnsonAtkins，DavidBackus，JohnBelly，RobertRosen，StevenWhite，Robert<120>手术中淋巴结检测<130>CDS 5009<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>1atgactgcct tgcctcctca gta23<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>2ggctgttgct tggacttctc taaaga 26<210>3<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>3caaacggatg aaactctgag caatgttga 29<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>4tctgtgagcc aaaggtcttg caga 24<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>5ggccaacaaa gctcaggaca aca23<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>6gcagtgactt cgtcatttgg acgta 25
<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>7tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg 36<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>8ctgaggcacc tggaaggagg20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>9catcttcatg ctgggcaggg20<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物
<400>10ctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgt 29<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>11tctgataaag gccgtacaat g 21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>12tcacgacttg ctgtttttgc tc 22<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>13atcaaaaaac aagcatggcc tacacc 26<210>14<211>1155<212>DNA
<213>人类的<400>14atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc 60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg480ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac 1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140accagaaata aataa1155
<210>15<211>3865<212>DNA<213>人类的<400>15tccgagctga ttacagacac caaggaagat gctgtaaaga gtcagcagcc acagccctgg 60ctagctggcc ctgtgggcat ttattagtaa agttttaatg acaaaagctt tgagtcaaca120cacccgtggg taattaacct ggtcatcccc accctggaga gccatcctgc ccatgggtga180tcaaagaagg aacatctgca ggaacacctg atgaggctgc acccttggcg gaaagaacac240ctgacacagc tgaaagcttg gtggaaaaaa cacctgatga ggctgcaccc ttggtggaaa300gaacacctga cacggctgaa agcttggtgg aaaaaacacc tgatgaggct gcatccttgg360tggagggaac atctgacaaa attcaatgtt tggagaaagc gacatctgga aagttcgaac420agtcagcaga agaaacacct agggaaatta cgagtcctgc aaaagaaaca tctgagaaat480ttacgtggcc agcaaaagga agacctagga agatcgcatg ggagaaaaaa gaagacacac540ctagggaaat tatgagtccc gcaaaagaaa catctgagaa atttacgtgg gcagcaaaag600gaagacctag gaagatcgca tgggagaaaa aagaaacacc tgtaaagact ggatgcgtgg660caagagtaac atctaataaa actaaagttt tggaaaaagg aagatctaag atgattgcat720gtcctacaaa agaatcatct acaaaagcaa gtgccaatga tcagaggttc ccatcagaat780ccaaacaaga ggaagatgaa gaatattctt gtgattctcg gagtctcttt gagagttctg840caaagattca agtgtgtata cctgagtcta tatatcaaaa agtaatggag ataaatagag900aagtagaaga gcctcctaag aagccatctg ccttcaagcc tgccattgaa atgcaaaact960ctgttccaaa taaagccttt gaattgaaga atgaacaaac attgagagca gatccgatgt 1020tcccaccaga atccaaacaa aaggactatg aagaaaattc ttgggattct gagagtctct 1080gtgagactgt ttcacagaag gatgtgtgtt tacccaaggc tacacatcaa aaagaaatag 1140
ataaaataaa tggaaaatta gaagagtctc ctaataaaga tggtcttctg aaggctacct 1200gcggaatgaa agtttctatt ccaactaaag ccttagaatt gaaggacatg caaactttca 1260aagcagagcc tccggggaag ccatctgcct tcgagcctgc cactgaaatg caaaagtctg 1320tcccaaataa agccttggaa ttgaaaaatg aacaaacatt gagagcagat gagatactcc 1380catcagaatc caaacaaaag gactatgaag aaagttcttg ggattctgag agtctctgtg 1440agactgtttc acagaaggat gtgtgtttac ccaaggctrc rcatcaaaaa gaaatagata 1500aaataaatgg aaaattagaa gggtctcctg ttaaagatgg tcttctgaag gctaactgcg 1560gaatgaaagt ttctattcca actaaagcct tagaattgat ggacatgcaa actttcaaag 1620cagagcctcc cgagaagcca tctgccttcg agcctgccat tgaaatgcaa aagtctgttc 1680caaataaagc cttggaattg aagaatgaac aaacattgag agcagatgag atactcccat 1740cagaatccaa acaaaaggac tatgaagaaa gttcttggga ttctgagagt ctctgtgaga 1800ctgtttcaca gaaggatgtg tgtttaccca aggctrcrca tcaaaaagaa atagataaaa 1860taaatggaaa attagaagag tctcctgata atgatggttt tctgaaggct ccctgcagaa 1920tgaaagtttc tattccaact aaagccttag aattgatgga catgcaaact ttcaaagcag 1980agcctcccga gaagccatct gccttcgagc ctgccattga aatgcaaaag tctgttccaa 2040ataaagcctt ggaattgaag aatgaacaaa cattgagagc agatcagatg ttcccttcag 2100aatcaaaaca aaagaasgtt gaagaaaatt cttgggattc tgagagtctc cgtgagactg 2160tttcacagaa ggatgtgtgt gtacccaagg ctacacatca aaaagaaatg gataaaataa 2220gtggaaaatt agaagattca actagcctat caaaaatctt ggatacagtt cattcttgtg 2280aaagagcaag ggaacttcaa aaagatcact gtgaacaacg tacaggaaaa atggaacaaa 2340tgaaaaagaa gttttgtgta ctgaaaaaga aactgtcaga agcaaaagaa ataaaatcac 2400agttagagaa ccaaaaagtt aaatgggaac aagagctctg cagtgtgaga ttgactttaa 2460
accaagaaga agagaagaga agaaatgccg atatattaaa tgaaaaaatt agggaagaat 2520taggaagaat cgaagagcag cataggaaag agttagaagt gaaacaacaa cttgaacagg 2580ctctcagaat acaagatata gaattgaaga gtgtagaaag taatttgaat caggtttctc 2640acactcatga aaatgaaaat tatctcttac atgaaaattg catgttgaaa aaggaaattg 2700ccatgctaaa actggaaata gccacactga aacaccaata ccaggaaaag gaaaataaat 2760actttgagga cattaagatt ttaaaagaaa agaatgctga acttcagatg accctaaaac 2820tgaaagagga atcattaact aaaagggcat ctcaatatag tgggcagctt aaagttctga 2880tagctgagaa cacaatgctc acttctaaat tgaaggaaaa acaagacaaa gaaatactag 2940aggcagaaat tgaatcacac catcctagac tggcttctgc tgtacaagac catgatcaaa 3000ttgtgacatc aagaaaaagt caagaacctg ctttccacat tgcaggagat gcttgtttgc 3060aaagaaaaat gaatgttgat gtgagtagta cgatatataa caatgaggtg ctccatcaac 3120cactttctga agctcaaagg aaatccaaaa gcctaaaaat taatctcaat tatgcmggag 3180atgctctaag agaaaataca ttggtttcag aacatgcaca aagagaccaa cgtgaaacac 3240agtgtcaaat gaaggaagct gaacacatgt atcaaaacga acaagataat gtgaacaaac 3300acactgaaca gcaggagtct ctagatcaga aattatttca actacaaagc aaaaatatgt 3360ggcttcaaca gcaattagtt catgcacata agaaagctga caacaaaagc aagataacaa 3420ttgatattca ttttcttgag aggaaaatgc aacatcatct cctaaaagag aaaaatgagg 3480agatatttaa ttacaataac catttaaaaa accgtatata tcaatatgaa aaagagaaag 3540cagaaacaga aaactcatga gagacaagca gtaagaaact tcttttggag aaacaacaga 3600ccagatcttt actcacaact catgctagga ggccagtcct agcatcacct tatgttgaaa 3660atcttaccaa tagtctgtgt caacagaata cttattttag aagaaaaatt catgatttct 3720tcctgaagcc tacagacata aaataacagt gtgaagaatt acttgttcac gaattgcata 3780
aagctgcaca ggattcccat ctaccctgat gatgcagcag acatcattca atccaaccag 3840aatctcgctc tgtcactcag gctgg 3865<210>16<211>3282<212>DNA<213>人类的<400>16gggacagggc tgaggatgag gagaaccctg gggacccaga agaccgtgcc ttgcccggaa 60gtcctgcctg taggcctgaa ggacttgccc taacagagcc tcaacaacta cctggtgatt120cctacttcag ccccttggtg tgagcagctt ctcaacatga actacagcct ccacttggcc180ttcgtgtgtc tgagtctctt cactgagagg atgtgcatcc aggggagtca gttcaacgtc240gaggtcggca gaagtgacaa gctttccctg cctggctttg agaacctcac agcaggatat300aacaaatttc tcaggcccaa ttttggtgga gaacccgtac agatagcgct gactctggac360attgcaagta tctctagcat ttcagagagt aacatggact acacagccac catatacctc420cgacagcgct ggatggacca gcggctggtg tttgaaggca acaagagctt cactctggat480gcccgcctcg tggagttcct ctgggtgcca gatacttaca ttgtggagtc caagaagtcc540ttcctccatg aagtcactgt gggaaacagg ctcatccgcc tcttctccaa tggcacggtc600ctgtatgccc tcagaatcac gacaactgtt gcatgtaaca tggatctgtc taaatacccc660atggacacac agacatgcaa gttgcagctg gaaagctggg gctatgatgg aaatgatgtg720gagttcacct ggctgagagg gaacgactct gtgcgtggac tggaacacct gcggcttgct780cagtacacca tagagcggta tttcacctta gtcaccagat cgcagcagga gacaggaaat840tacactagat tggtcttaca gtttgagctt cggaggaatg ttctgtattt cattttggaa900acctacgttc cttccacttt cctggtggtg ttgtcctggg tttcattttg gatctctctc960gattcagtcc ctgcaagaac ctgcattgga gtgacgaccg tgttatcaat gaccacactg 1020
atgatcgggt cccgcacttc tcttcccaac accaactgct tcatcaaggc catcgatgtg 1080tacctgggga tctgctttag ctttgtgttt ggggccttgc tagaatatgc agttgctcac 1140tacagttcct tacagcagat ggcagccaaa gataggggga caacaaagga agtagaagaa 1200gtcagtatta ctaatatcat caacagctcc atctccagct ttaaacggaa gatcagcttt 1260gccagcattg aaatttccag cgacaacgtt gactacagtg acttgacaat gaaaaccagc 1320gacaagttca agtttgtctt ccgagaaaag atgggcagga ttgttgatta tttcacaatt 1380caaaacccca gtaatgttga tcactattcc aaactactgt ttcctttgat ttttatgcta 1440gccaatgtat tttactgggc atactacatg tatttttgag tcaatgttaa atttcttgca 1500tgccataggt cttcaacagg acaagataat gatgtaaatg gtattttagg ccaagtgtgc 1560acccacatcc aatggtgcta caagtgactg aaataatatt tgagtctttc tgctcaaaga 1620atgaagctcc aaccattgtt ctaagctgtg tagaagtcct agcattatag gatcttgtaa 1680tagaaacatc agtccattcc tctttcatct taatcaagga cattcccatg gagcccaaga 1740ttacaaatgt actcagggct gtttattcgg tggctccctg gtttgcattt acctcatata 1800aagaatggga aggagaccat tgggtaaccc tcaagtgtca gaagttgttt ctaaagtaac 1860tatacatgtt ttttactaaa tctctgcagt gcttataaaa tacattgttg cctatttagg 1920gagtaacatt ttctagtttt tgtttctggt taaaatgaaa tatgggctta tgtcaattca 1980ttggaagtca atgcactaac tcaataccaa gatgagtttt taaataatga atattattta 2040ataccacaac agaattatcc ccaatttcca ataagtccta tcattgaaaa ttcaaatata 2100agtgaagaaa aaattagtag atcaacaatc taaacaaatc cctcggttct aagatacaat 2160ggattcccca tactggaagg actctgaggc tttattcccc cactatgcat atcttatcat 2220tttattatta tacacacatc catcctaaac tatactaaag cccttttccc atgcatggat 2280ggaaatggaa gatttttttg taacttgttc tagaagtctt aatatgggct gttgccatga 2340
aggcttgcag aattgagtcc attttctagc tgcctttatt cacatagtga tggggtacta 2400aaagtactgg gttgactcag agagtcgctg tcattctgtc attgctgcta ctctaacact 2460gagcaacact ctcccagtgg cagatcccct gtatcattcc aagaggagca ttcatccctt 2520tgctctaatg atcaggaatg atgcttatta gaaaacaaac tgcttgaccc aggaacaagt 2580ggcttagctt aagtaaactt ggctttgctc agatccctga tccttccagc tggtctgctc 2640tgagtggctt atcccgcatg agcaggagcg tgctggccct gagtactgaa ctttctgagt 2700aacaatgaga cacgttacag aacctatgtt caggttgcgg gtgagctgcc ctctccaaat 2760ccagccagag atgcacattc ctcggccagt ctcagccaac agtaccaaaa gtgatttttg 2820agtgtgccag ggtaaaggct tccagttcag cctcagttat tttagacaat ctcgccatct 2880ttaatttctt agcttcctgt tctaataaat gcacggcttt acctttcctg tcagaaataa 2940accaaggctc taaaagatga tttcccttct gtaactccct agagccacag gttctcattc 3000cttttcccat tatacttctc acaattcagt ttctatgagt ttgatcacct gattttttta 3060acaaaatatt tctaacggga atgggtggga gtgctggtga aaagagatga aatgtggttg 3120tatgagccaa tcatatttgt gattttttaa aaaaagttta aaaggaaata tctgttctga 3180aaccccactt aagcattgtt tttatataaa aacaatgata aagatgtgaa ctgtgaaata 3240aatataccat attagctacc caccaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3282<210>17<211>503<212>DNA<213>人类的<400>17gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct120
ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact180gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat240gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt300atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg360gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt420ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg480tttattttaa taaattgatg gca503<210>18<211>503<212>DNA<213>人类的<400>18gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct120ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact180gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat240gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt300atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg360gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt420ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg480tttattttaa taaattgatg gca503<210>19<211>1793<212>DNA<213>人类的
<400>19cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat120gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg180gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga240cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt300caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt360ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg420cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat480ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg540tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct600gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg660cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct720gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct780ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg840ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga900aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa960cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1020gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1080gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1140gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1200ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1260
acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1320tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1380gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1440ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1500ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1560tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1620acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1680gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1740agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tta 1793<210>20<211>1377<212>DNA<213>人类的<400>20cacacagcct actttccaag cggagccatg tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60gaagaaaaca gcccaaagat gagagtgatt cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct120cgcatacaga cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt180gaaatcattg ctatgtccac cacaggggac aagattcttg atactgcact ctctaagatt240ggagagaaaa gcctgtttac caaggagctt gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac300ctggttgttc actccttgaa ggacctgccc actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga360gccatctgca agcgggaaaa ccctcatgat gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg420aagaccctag aaaccctgcc agagaagagt gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca480gcccagctgc agagaaagtt cccgcatctg gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac540acccggcttc ggaagctgga cgagcagcag gagttcagtg ccatcatcct agcaacagct600
ggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccgg gtggggcaga tcctgcaccc tgagaaatgc660atgtatgctg tgggccaggg ggccttgggc gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc720ttggatctgg tgggtgtgct gcacgatccc gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg780gccttcctga ggcacctgga aggaggctgc agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg840aaggatgggc aactgtacct gactggagga gtctggagtc tagacggctc agatagcata900caagagacca tgcaggctac catccatgtc cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat960gacccacagt tggtaggcat cactgctcgt aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020cagaacttgg gcatcagcct ggccaacttg ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080gatgttgcac ggcagcttaa cgatgcccat taactggttt gtggggcaca gatgcctggg 1140ttgctgctgt ccagtgccta catcccgggc ctcagtgccc cattctcact gctatctggg 1200gagtgattac cccgggagac tgaactgcag ggttcaagcc ttccagggat ttgcctcacc 1260ttggggcctt gatgactgcc ttgcctcctc agtatgtggg ggcttcatct ctttagagaa 1320gtccaagcaa cagcctttga atgtaaccaa tcctactaat aaaccagttc tgaaggt 1377<210>21<211>1524<212>DNA<213>人类的<400>21agcagacaga ggactctcat taaggaaggt gtcctgtgcc ctgaccctac aagatgccaa 60gagaagatgc tcacttcatc tatggttacc ccaagaaggg gcacggccac tcttacacca120cggctgaaga ggccgctggg atcggcatcc tgacagtgat cctgggagtc ttactgctca180tcggctgttg gtattgtaga agacgaaatg gatacagagc cttgatggat aaaagtcttc240atgttggcac tcaatgtgcc ttaacaagaa gatgcccaca agaagggttt gatcatcggg300
acagcaaagt gtctcttcaa gagaaaaact gtgaacctgt ggttcccaat gctccacctg360cttatgagaa actctctgca gaacagtcac caccacctta ttcaccttaa gagccagcga420gacacctgag acatgctgaa attatttctc tcacactttt gcttgaattt aatacagaca480tctaatgttc tcctttggaa tggtgtagga aaaatgcaag ccatctctaa taataagtca540gtgttaaaat tttagtaggt ccgctagcag tactaatcat gtgaggaaat gatgagaaat600attaaattgg gaaaactcca tcaataaatg ttgcaatgca tgatactatc tgtgccagag660gtaatgttag taaatccatg gtgttatttt ctgagagaca gaattcaagt gggtattctg720gggccatcca atttctcttt acttgaaatt tggctaataa caaactagtc aggttttcga780accttgaccg acatgaactg tacacagaat tgttccagta ctatggagtg ctcacaaagg840atacttttac aggttaagac aaagggttga ctggcctatt tatctgatca agaacatgtc900agcaatgtct ctttgtgctc taaaattcta ttatactaca ataatatatt gtaaagatcc960tatagctctt tttttttgag atggagtttc gcttttgttg cccaggctgg agtgcaatgg 1020cgcgatcttg gctcaccata acctccgcct cccaggttca agcaattctc ctgccttagc 1080ctcctgagta gctgggatta caggcgtgcg ccactatgcc tgactaattt tgtagtttta 1140gtagagacgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat 1200ctgcccgcct cagcctccca aagtgctgga attacaggcg tgagccacca cgcctggctg 1260gatcctatat cttaggtaag acatataacg cagtctaatt acatttcact tcaaggctca 1320atgctattct aactaatgac aagtattttc tactaaacca gaaattggta gaaggattta 1380aataagtaaa agctactatg tactgcctta gtgctgatgc ctgtgtactg ccttaaatgt 1440acctatggca atttagctct cttgggttcc caaatccctc tcacaagaat gtgcagaaga 1500aatcataaag gatcagagat tctg 1524<210>22
<211>2384<212>DNA<213>人类的<400>22tattgagttc ttcaaacatt gtagcctctt tatggtctct gagaaataac taccttaaac 60ccataatctt taatacttcc taaactttct taataagaga agctctattc ctgacactac120ctctcatttg caaggtcaaa tcatcattag ttttgtagtc tattaactgg gtttgcttag180gtcaggcatt attattacta accttattgt taatattcta accataagaa ttaaactatt240aatggtgaat agagtttttc actttaacat aggcctatcc cactggtggg atacgagcca300attcgaaaga aaagtcagtc atgtgctttt cagaggatga aagcttaaga taaagactaa360aagtgtttga tgctggaggt gggagtggta ttatataggt ctcagccaag acatgtgata420atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccag ttcctgcaga480ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgc tgtggagttt540ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa600ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg660ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg720ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg780caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac840agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa900attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat960agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta 1020tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga 1080aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact 1140cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat 1200
tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg 1260aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca 1320gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc 1380cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggctccc 1440ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga 1500taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg 1560gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac 1620aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt 1680tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga 1740agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttcctttta taccactgta 1800cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca 1860agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg 1920gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc 1980agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc 2040actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta 2100ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc 2160ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac 2220aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac 2280tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta 2340atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta tttt2384<210>23<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>23cctgaggcac ctggaaggag gctgcagtgt 30<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的一个探针<400>24atcaaaaaac aagcatggcc tcacacc27<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>25ctgcttcgct gcatcgctga aa 22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>26cagactcctc cagtcaggta ca 22
<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>27gcttggtggt taaaacttac c 21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>28tgaacagttc tgttggtgta20<210>29<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>29ctgcctgcct atgtgacgac aatccgg27<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>30caattttggt ggagaacccg20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>31gctgtcggag gtatatggtg20<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>32catttcagag agtaacatgg actacaca 28<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>33gcaagtgcca atgatcagag g 21<210>34<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>34atatagactc aggtatacac act23<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一个探针<400>35tcccatcaga atccaaacaa gaggaag2权利要求
1.一种进行手术中分子诊断检测的方法，包括的步骤为从患者获得一个淋巴结组织样品；通过核苷酸扩增和检测分析样品；并确定是否存在超过关闭值的多个标记。
2.用于检测微转移的权利要求1的方法。
3.用于检测乳腺癌微转移的权利要求1的方法。
4.用于检测黑素瘤微转移权利要求1的方法。
5.权利要求1的方法，其中所述的标记检测相应于Seq ID 17的基因和选自Seq ID Nos14-16和Seq ID No 18中的一个或多个基因的表达。
6.权利要求1的方法，其中所述所有步骤在一个外科手术程序过程中进行。
7.权利要求1的方法，其中所述的核苷酸扩增和检测通过PCR进行。
8.用于检测微转移的权利要求7的方法。
9.用于检测乳癌微转移的权利要求7的方法。
10.用于检测黑素瘤微转移的权利要求7的方法。
11.权利要求10的方法，其中所述的标记是Seq ID No 21和Seq ID No 22。
12.权利要求7的方法，其中所述的PCR是RT-PCR。
13.权利要求12的方法，其中反转录反应进行少于9分钟。
14.权利要求13的方法，其中反转录反应进行约3分钟。
15.权利要求12的方法，其中一个或多个内对照试剂被加入到反转录反应中。
16.权利要求1的方法，其中通过以下步骤从淋巴结中提取RNA(a)溶解含有感兴趣RNA的细胞，并使其成为匀浆，(b)任选地，稀释该匀浆，(c)使该湿的匀质工作样品与基质接触，其中所述基质含有或粘附有与RNA结合的物质，(d)使样品与基质接合，(e)去除杂质和干扰物，(f)干燥基质，和(g)从基质质上洗提RNA；并在提取步骤中应用过滤。
17.一种进行手术中淋巴结检测的试剂盒，包括核苷酸扩增和检测试剂。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述的试剂包括具有检测存在选自Seq IDNo.14-18和Seq ID No21-22的标记的序列的引物。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述的引物选自包括Seq ID No1-6，8-12，25-28和33-35。
20.权利要求17的试剂盒还包括RT-PCR试剂。
21.一种方法，包括进行手术中分子诊断检测和根据这种检测的结果治疗患者，其中该检测包括以下步骤从患者获得一个淋巴结组织样品；通过核苷酸扩增和检测分析样品；并确定是否存在超过关闭值的多个标记。
全文摘要
在一个微转移的手术中淋巴结检测中，外科医生根据已知的方法在外科手术中确定岗哨淋巴结。岗哨结节被切除并准备用于核苷酸的提取。然后从岗哨结节中快速提取核苷酸(如RNA)。指示微转移的标记，如果存在，然后被扩增和检测。
文档编号C12N15/09GK1618987SQ20041005952
公开日2005年5月25日 申请日期2004年4月30日 优先权日2003年5月1日
发明者D·阿特金斯, J·巴库斯, R·贝利, S·罗森, R·怀特 申请人:维里德克斯有限责任公司