专利名称：肽甲硫氨酸亚砜还原酶的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白酶的新用途，特别涉及肽甲硫氨酸亚砜还原酶的新用途。
背景技术：
蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式。甲硫氨酸(Met)被氧化则变为甲硫氨酸亚砜(Met(O))，它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失。
肽甲硫氨酸亚砜还原酶(Peptide methionine sulfoxide reductase，MsrA)是一种高度保守的蛋白酶，它能够催化多肽链中或细胞中自由的甲硫氨酸亚砜还原成甲硫氨酸，从而修复氧化损伤的蛋白。同时MsrA可以作为体内的关键调节酶，通过蛋白中甲硫氨酸的氧化还原来调节蛋白的生理活性；还可以作为抗氧化酶，通过体内甲硫氨酸的氧化还原循环而清除活性氧。
蛋白错误折叠能够导致阿尔兹海默氏症、传播性海绵状脑病和肌萎缩性(脊髓)侧索硬化等许多疾病。因此抑制蛋白错误折叠，阻止蛋白聚集与变性是防止这些蛋白错误折叠病的有效方法。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)为氧自由基的天然清除剂，具有防止细胞过度氧化，延缓生命衰老的生理功能。SOD是一种金属酶类，根据所含金属辅基不同，分为Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD和Ni-SOD四类。
在肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)患者体内发现大量人Cu/Zn-SOD突变体。目前认为这些突变蛋白在体内形成蛋白聚集而产生的毒性是导致肌萎缩性(脊髓)侧索硬化的主要原因。
柠檬酸合成酶是三羧酸循环中的一个关键酶，但该蛋白热稳定性极低。体外在43℃会很快变性聚集进而沉淀。其聚集过程可以用光散射的变化反映出来。
酵母Sup35蛋白是导致疯牛病朊病毒的模型蛋白，这类蛋白在动物和人体内能够导致Creutzfeldt-Jacob疾病、牛海绵状脑病、羊搔痒病。Sup35蛋白很容易错误折叠而形成纤维，其纤维形成可以通过工荧光发射的变化来检测。
发明创造内容本发明的目的是提供肽甲硫氨酸亚砜还原酶的新用途。
研究表明，甲硫氨酸亚砜还原酶具有防止蛋白质聚集、蛋白质变性以及蛋白质错误折叠的功能。
其中，在防止蛋白质变性中，所述变性可由物理因素和/或化学因素引起。所述物理因素包括热，紫外线照射，高压和表面张力等。所述化学因素包括有机溶剂，脲、胍，酸和碱等。
实验证明，MsrA在体内能够有效防止人Cu/Zn-SOD的聚集，因而阻止人Cu/Zn-SOD形成蛋白聚集、减少毒性产生，从而防止肌萎缩性(脊髓)侧索硬化的发生；MsrA防止柠檬酸合成酶不被热变性，减缓正常蛋白的热变性过程，因而保护体内蛋白正常生理功能的发挥；MsrA具有很强的抑制酵母Sup35蛋白纤维形成的能力，表明MsrA在防止和治疗人疯牛病中具有应用前景。本发明为肽甲硫氨酸亚砜还原酶的进一步开发利用提供了更加广阔的空间。
图1为MsrA对人Cu/Zn-SOD聚集的抑制曲线图2为不同浓度MsrA对人Cu/Zn-SOD聚集的抑制作用曲线图3为MsrA对柠檬酸合成酶热变性的抑制作用曲线图4为不同浓度MsrA对柠檬酸合成酶热变性的抑制作用柱状5为MsrA对Sup35蛋白纤维形成的抑制作用柱状图具体实施方式
实施例1、体外表达和纯化MsrA通过常规PCR方法从含有MsrA基因的质粒pQE30L/MsrA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997，949585-9589)中扩增该基因。其中，所用的引物为上游引物为5’GTCGAATTCTCGTCGCTTATTTCAAAAACCA 3’(序列表中的序列1；带下划线部分的碱基为EcoRI酶切位点)，下游引物为5’GGCGTCGACTTA CTA CATTTCT CTCAGATAAT GAGTA 3’(序列表中序列2；带下划线部分的碱基为SalI酶切位点)。PCR体系为50μl，其中，质粒模板10ng，两种引物浓度为50pmol，95℃变性5分钟后加入2.5U Taq PlusDNA聚合酶，95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30循环后于72延伸10分钟。利用常规分子克隆方法，将得到的PCR扩增产物用EcoRI和SalI双酶切后连接入pGEX-4T-1原核表达载体中，得到重组表达载体pGEX-4T-1/MsrA。将该重组表达载体通过CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)。取单菌落在LB培养基内37℃培养12小时后，1∶100转接至新鲜培养基放大培养，当菌液在600nm下OD值为0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.25mM诱导蛋白表达，继续在25℃培养6-8小时，离心收集菌体，菌体用缓冲液A(10mM Tris-HCl，10mM β-巯基乙醇，pH7.4)重悬，并用超声仪于冰上超声裂解。裂解液于4℃下27,000×g离心20min，上清液以Glutathione Sepharose 4B柱纯化。SDS-PAGE检测纯化的MsrA蛋白，结果表明得到纯化的MsrA蛋白。蛋白浓度采用Edelhoch方法检测(Biochemistry，1967，61948-1954)。
实施例2、MsrA体外防止人Cu/Zn-SOD的聚集在含有8-25％的TFE(Trifluroethanol)，25μM ThT(thioflavin T)，50mM Mes[2-(N-吗啉代)乙磺酸]的pH5.4的醋酸缓冲液中，同时加入终浓度为0.2mg/ml的人Cu/Zn-SOD和终浓度为0.1、0.25、0.5和1μM的MsrA，并设不加MsrA的对照，立即检测人Cu/Zn-SOD蛋白的聚集。蛋白聚集采用ThT荧光激发发射光谱来检测，激发波长为440，发射波长为482nm。结果如图1和图2所示，表明人Cu/Zn-SOD的聚集速度比对照减慢，在473nm处，加入0.5μM MsrA后，荧光强度只为对照的50％；且抑制效果随着MsrA浓度的增加而增加，当MsrA达到0.5μM其抑制率进入平台期。
实施例3、MsrA保护正常蛋白不被热变性在40mM HEPES缓冲液中加入终浓度为0.15μM柠檬酸合成酶，于43℃加热200秒内就开始发生聚集，以荧光仪FL4500(日立公司)检测到光散射信号的增加，在20分钟内增加达到13倍。荧光仪检测参数为激发光波长500nm，发射光波长500nm。狭缝宽度2.5nm。
在40mM HEPES缓冲液中，同时加入终浓度为0.15μM柠檬酸合成酶和0、0.1、0.25和0.5μM MsrA后，以荧光仪FL4500(日立公司)检测光散射信号。结果如图3和图4所示，表明热变性聚集明显变少；在反应20分钟时，蛋白聚集抑制率达35％；且抑制效果随着MsrA浓度的增加而增加，在反应至20分钟时，当MsrA浓度增加至0.25μM时抑制率增加至51.9％，当MsrA浓度增加至0.5μM时抑制率增加到74.4％。
实施例4、MsrA防止蛋白质形成纤维，于体外防止蛋白质的错误折叠酵母Sup35蛋白是导致人疯牛病朊病毒的模型蛋白。将含有10μM Sup35蛋白和0、0.25、5μM MsrA的磷酸缓冲液(5mMKH2PO4，150mM NaCl，pH7.4)与等体积的25μM ThT(溶于50mM甘氨酸缓冲液，pH8.0)，在25℃下孵育120小时后，以日立FL-4500型荧光仪检测荧光光谱信号，激发波长442nm，发射波长485nm。所得结果减去缓冲液中ThT和不同浓度的MsrA背景信号。结果如图5所示，表明加入5μM MsrA体系的蛋白荧光相对强度较对照减少了63.8％。表明MsrA具有很强的抑制蛋白纤维形成的能力。
序列表<160>2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gtcgaattct cgtcgcttat ttcaaaaacc a 31<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggcgtcgact tactacattt ctctcagata atgagta 3权利要求
1.肽甲硫氨酸亚砜还原酶在防止蛋白质聚集中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述蛋白质为Cu/Zn-SOD及其突变体。
3.肽甲硫氨酸亚砜还原酶在防止蛋白质变性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述蛋白质为柠檬酸合成酶。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述变性由物理因素和/或化学因素引起。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述物理因素包括热，紫外线照射，高压和表面张力。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述化学因素包括有机溶剂，脲、胍，酸和碱。
8.肽甲硫氨酸亚砜还原酶在防止蛋白质错误折叠中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述蛋白质为酵母Sup35蛋白。
全文摘要
本发明公开了肽甲硫氨酸亚砜还原酶的新用途。本发明的研究表明，肽甲硫氨酸亚砜还原酶具有防止蛋白质聚集、蛋白质变性以及蛋白质错误折叠的功能，为肽甲硫氨酸亚砜还原酶的进一步开发利用提供了更加广阔的空间。
文档编号C12N9/02GK1587397SQ20041005853
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者王义华, 罗永章 申请人:清华大学