用血管抑制素协同加强腺伴随病毒介导的b7.1免疫接种以根除扩散的肝转移性肿瘤的制作方法

专利名称：：用血管抑制素协同加强腺伴随病毒介导的b7.1免疫接种以根除扩散的肝转移性肿瘤的制作方法本申请要求享有2003年1月7日申请的美国临时申请60/438,449的权益，在此完全引入该申请作为参考。1.引言本发明涉及一种治疗剂以及使用所述治疗剂预防、治疗、控制或改善所有类型的肿瘤和/或癌症的方法，所述肿瘤和/或癌症包括但不是限于转移性肝癌。特别地，本发明提供一种包括被可操作地连接到编码血管抑制素蛋白质和/或共刺激分子B7.1的序列上的腺伴随病毒(AAV)载体的核酸分子。特别地，本发明涉及可用于治疗肝转移性肿瘤的编码共刺激分子B7.1的AAV载体(“AAVB7.1载体”)。AAV-B7.1还可以单独地或者顺序地或同时地与编码血管抑制素(angiostatin)的第二个AAV载体(“AAV-血管抑制素载体”)组合地被施用给受治疗者，优选为人。本发明还涉及编码共刺激分子B7.1和血管抑制素的AAV载体(″AAV-B7.1/血管抑制素载体″)。本发明还包括包含AAV-B7.1载体，AAV-血管抑制素载体，和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体的药物组合物和疫苗。还描述了制造和使用AAV载体、药物组合物和疫苗的方法。特别地，该发明指向通过施用有效量的AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体来治疗和预防癌症的方法。在其它的实施方案中，该方法进一步提供与外科手术、标准的和试验性的化学疗法、激素治疗、生物学治疗、免疫疗法、放射线治疗、栓塞术(embolization)和/或化学栓塞治疗组合的治疗，用于治疗或预防癌症。2.发明背景2.1转移性的肝癌肝脏是发生血液负责的转移的最频繁部位，并且与所有癌症的大约三分之一有关，包括最常发生的癌症类型(FidlerI.J.等人.Theimplicationsofangiogenesisforthebiologyandtherapyofcancermetastasis.Cell1994；79185-8；Weinstat-SaslowD等人.Angiogenesisandcolonizationinthetumormetastaticprocessbasicandappliedadvances.994；8401-7)。转移性肝癌的预后很差，并且缺乏有效的治疗方法。尽管对新的治疗方法进行了广泛的探索，但是还没有治疗肝脏肿瘤转移的有效治疗方法。大多数患者在诊断之后的一年内死亡。化学疗法和栓塞术最多起缓和作用，而不影响存活或寿命。肝脏转移切除构成唯一的祛病疗法，但是该方法仅仅对于10％病人来说是可行的，并且肿瘤切除后的复发率仍然很高。因此，急需探寻用于治疗转移性肝脏恶性肿瘤的可能治疗策略。2.2抗血管发生的治疗尽管已经发现了许多内源性的血管发生抑制剂，但是对这些试剂的临床评价已经受到高剂量需要、制造限制以及相应的重组蛋白相对不稳定的阻碍。当中止用血管抑制素进行治疗时，退化的肿瘤会再生。通过数轮的治疗可以实现延长的肿瘤休眠(HolmgrenL等人，1995，同上文；O’ReillyM.S等人，1996，同上文)。迄今为止，血管抑制素的治疗效果仍然是受到争议的，部分是由于血管抑制素的循环周期非常短，并且血管抑制素的局部浓度不足以满足治疗的要求。尽管有研究表明，在施用纯化的蛋白质之后，血流中的另一种抗血管生成的药物内抑制素(endostatin)的浓度可以达到400μg/ml(BlezingerP.等人.Systemicinhibitionoftumorgrowthandtumormetastasesbyintramuscularadministrationoftheendostatingene.NatureBiotechnol.1999；17343-348)，还难以原位确定这种蛋白质的局部浓度有多高。因此，在基因治疗中，血管抑制素基因被呈递给肿瘤及其附近，并且稳定地表达一长段时间，这种基因治疗方法变得越来越有吸引力。急需一种用于癌症基因治疗的理想载体，该载体产生比现行试剂更大的功效，并且毒性较低。2.3腺伴随病毒表达载体腺伴随病毒(AAV)是细小病毒家族的非致病性的、依赖于辅助病毒的成员，具有几个主要优点，例如稳定整合、低免疫原性、长期表达以及能够感染分化的和未分化的细胞。本发明人已经建立了一种由腺伴随病毒诱导的快速而持续的表达系统。先前已经证明，采用这种系统，在门静脉内注射编码血管生成抑制剂的AAV表达载体，会引起局限在肝细胞内的高水平、长期(6个月)而持续地转基因表达血管抑制素，并且显著地抑制已经在肝脏中建立的结节和分散的转移EL-4淋巴瘤的生长(参见2003年2月7日申请的美国临时申请60/438,449；和XuR.等人.Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60，在此完全引入作为参考)。2.4共刺激分子B7.1实现肿瘤特异性免疫反应的两个主要障碍包括(1)克服外周T细胞对肿瘤自身抗原(Ags)的耐受和(2)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其有效地消除分散的肿瘤转移，并随后维持持续的预防肿瘤复发的免疫记忆。诱导肿瘤特异性的CTL需要至少两种信号(a)由抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性复合物(MHC)的I型和/或II型分子所加工和呈递的肿瘤抗原；和(b)肿瘤细胞或其它APC上的足够水平的共刺激分子(MuellerD.L.等人.ClonalexpansionversusfunctionalclonalinactivationaconstimulatorysignallingpathwaydeterminestheoutcomeofTcellantigen.AnnuRevImmunol.1989；7445-80)。膜蛋白的B7家族是最有效的共刺激分子，能够与T细胞表面上的CD28和CTLA-4相互作用(Galea-LauriJ.等人.Novelcostimulatorsintheimmunegenetherapyofcancer.CancerGeneTher.1996；3202-14)。优化的包括B7.1的多种T细胞共刺激细胞附着分子(CAM)的基因转移，会引起肿瘤特异性的T细胞增殖和细胞毒性以及抵抗亲本肿瘤攻击的保护性免疫。但是，CAM介导的免疫治疗的问题在于，其对大肿瘤无效，并且产生微弱的抗肿瘤的系统性免疫(KanwarJ.R.等人.Takinglessonsfromdendriticcellsmultiplexenogeneicligandsforleukocyteintegrinshavethepotentialtostimulateanti-tumourimmunity.GeneTherapy1999；61835-1844)。因此，急需一种更加有效的治疗方法。3.发明概述本发明部分地基于本发明人的观察结果新的腺伴随病毒(AAV)载体在肠上皮细胞和肝细胞中都引起持久稳定地(＞6个月)表达转基因，导致在糖尿病动物模型中的长期的表型恢复(XuRA.等人，Perarollytransductionofdiffusecellsandhepatocyteinsulinleadingtoeuglycemiaindiabeticrats.MolTher.2001；3S180；DuringM.J.等人.Perarollygenetherapyoflactoseintoleranceusinganadeno-associatedvirusvector.NatureMed.1998；41131-1135；DuringM.J.等人.AnoralvaccineagainstNMDAR1withefficacyinexperimentalstrokeandepilepsy.Science2000；2871453-1460)。为了克服癌症治疗中存在的问题，本发明人发现，仅当免疫治疗与以肿瘤的存活、防卫和攻击的武器为对象的治疗策略结合时，免疫系统才可以被用作一种有力的武器来抗击癌症。如果癌症细胞的生长被阻止，癌细胞将不能生成免疫逃逸变体。在探索更加有效地利用和加强CAM介导的免疫治疗的抗肿瘤活性的过程中，本发明人构建了一种编码T细胞共刺激B7.1的新重组的AAV载体。此外，本发明人已经开发出一种新的免疫-基因治疗方法，通过施用B7.1与抗血管发生试剂如血管抑制素来处理癌症(SunX.等人，CancerGeneTher.2001；8719-727，在此完全引入作为参考)。本发明人还开发出一种治疗癌症的新的免疫-基因治疗方法，通过施用血管抑制素、B7.1和/或反义的组织缺氧诱导因子1(SunX.等人.Genetransferofantisensehypoxiainduciblefactor-1enhancesthetherapeuticefficacyofcancerimmunotherapy.GeneTher.2001；8638-645，在此完全引入作为参考)。试剂的这种特定组合在治疗癌症中起协同作用。特别地，本发明表明，组合治疗克服了肿瘤的免疫抗性，引起完全而快速地消除大肿瘤，这种大肿瘤难以用血管抑制素或者反义组织缺氧诱导因子1或者B7.1的单一治疗来消除。因此，本发明提供一种用于预防、治疗、控制或改善各种肿瘤和/或癌症的治疗剂，该肿瘤和/或癌症包括但是不限于肝癌。特别地，本发明提供用于通过基因治疗来治疗肝癌，特别是分散的转移性肝癌的治疗剂。在一个特定的实施方案中，本发明的治疗剂包括一种核酸分子，其包含腺伴随病毒载体、β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒增强子和土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，被可操作地连接到编码血管抑制素蛋白和/或共刺激分子B7.1的序列上。在一个特定的实施方案中，AAV载体编码共刺激分子B7.1(″AAV-B7.1载体″)。在另一个特定实施方案中，AAV载体编码血管抑制素(″AAV-血管抑制素载体″)。在还有另一个特定的实施方案中，本发明还涉及编码共刺激分子B7.1和血管抑制素的AAV载体(″AAV-B7.1/血管抑制素载体″)。本发明涉及单独地或者顺序或同时地与AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体组合，将AAV-B7.1载体施用给受治疗者，优选为人。AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和AAV-B7.1/血管抑制素载体可用于治疗或预防癌症，优选转移性肿瘤，更加优选肝脏转移性肿瘤。在某些实施方案中，本发明涉及包括AAV载体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子包括AAV载体和巨细胞病毒增强子以及β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)，该启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的核酸序列上。在特定的实施方案中，核酸分子包括AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到SEQIDNO1的核苷酸序列或者编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上。在另一个实施方案中，该核苷酸分子包括AAV和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到编码共刺激物B7.1的核酸序列上。在特定实施方案中，核酸分子包括AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到SEQIDNO3的核苷酸序列或者编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上。在其它特定实施方案中，核苷酸分子包括AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到SEQIDNO5的核苷酸序列或者编码SEQIDNO6的氨基酸序列的核苷酸序列上。在特定实施方案中，可被用在本发明中的编码B7.1的核苷酸序列包括那些存放在GenBank中，登录号为NM005191(SEQIDNO3)和X60958(SEQIDNO5)的序列。核酸分子还可以包括土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)。本发明还涉及包含上述核酸分子的载体。在特定实施方案中，所述载体是含有CAG启动子的AAV，该启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的核苷酸序列上。在另一个特定的实施方案中，所述载体是含有EGR-1启动子和靶特异性启动子白蛋白的AAV载体。在一个优选的实施方案中，该载体包含被可操作地连接到核苷酸序列上CAG启动子，该核苷酸编码具有SEQIDNO2的氨基酸序列的血管抑制素蛋白或其生物学的功能片段、类似物或其变体。在一个实施方案中，所述核苷酸序列具有SEQIDNO1的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列具有在如在此定义的严紧条件下杂交到SEQIDNO1的核苷酸序列的互补物上的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码蛋白质或多肽，其至少具有血管抑制素的一种结构特征和/或功能特征。在还有另一个实施方案中，所述核苷酸序列具有在严紧条件下杂交到第二条核苷酸序列的互补物上的第一条核苷酸序列，该第二条核苷酸序列编码SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，其中第一条核苷酸序列编码蛋白质或多肽，其至少具有血管抑制素的一种结构特征和/或功能特征。在另一个特定实施方案中，所述载体是含有CAG启动子的AAV，该启动子被可操作地连接到编码B7.1的核酸序列上。在另一个特定实施方案中，所述载体是含有EGR-1启动子和靶特异性启动子白蛋白的AAV载体。在一个优选实施方案中，该载体包含被可操作地连接到核苷酸序列上CAG启动子，该核苷酸编码具有SEQIDNO4或6的氨基酸序列的B7.1蛋白或其生物学的功能片段、类似物或其变体。在一个实施方案中，所述核苷酸序列具有SEQIDNO3或5的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列具有在如在此定义的严紧条件下杂交到SEQIDNO3或5的核苷酸序列的互补物上的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码蛋白质或多肽，至少具有B7.1的一种结构特征和/或功能特征。在还有另一个实施方案中，所述核苷酸序列具有在严紧条件下杂交到第二条核苷酸序列的互补物上的第一条核苷酸序列，该第二条核苷酸序列编码SEQIDNO4或6的氨基酸序列或其片段，其中第一条核苷酸序列编码蛋白质或多肽，至少具有B7.1的一种结构特征和/或功能特征。在某些其它实施方案中，核苷酸分子包含AAV载体和巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)，该启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的第一条核酸序列和编码B7.1的第二条核酸序列上。第二个核酸分子的表达可以由CAG启动子或不同的启动子来驱动。在特定的实施方案中，该核苷酸分子包括AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到包含SEQIDNO1的核苷酸序列或者编码SEQIDNO2的氨基酸序列的第一条多核苷酸以及包含SEQIDNO3的核苷酸序列或者编码SEQIDNO4的氨基酸序列的第二条多核苷酸上。在另一个特定实施方案中，核酸分子包含AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到包含SEQIDNO1的核苷酸序列或者编码SEQIDNO2的氨基酸序列的第一条多核苷酸以及包含SEQIDNO5的核苷酸序列或者编码SEQIDNO6的氨基酸序列的第二条多核苷酸上。本发明还包括包含载体的宿主细胞。本发明还涉及包含核酸分子和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供用于分离和纯化B7.1蛋白或其片段、变体或衍生物的方法。本发明还提供用于分离和纯化血管抑制素蛋白或其片段、变体或衍生物的方法。本发明还涉及治疗或预防受治疗者中的癌症的方法，通过给该受治疗者施用治疗性或预防性有效量的一种或多种核酸分子，其包含本发明的AAV-B7.1载体和/或AAV-血管抑制素载体。特别地，本发明提供用于治疗转移性肿瘤的组合治疗方法，包括通过门静脉内或肌肉路径给受治疗者施用AAV-B7.1载体，接着通过门静脉内或肌肉注射施用AAV-血管抑制素载体。在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗转移性肿瘤的方法，包括给受治疗者施用一种或多种AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体。在一个特定实施方案中，可以通过门静脉内或肌肉注射施用第一种AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体，接着通过门静脉内或肌肉注射施用第二种AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体。在特定的实施方案中，所述的癌症为肝癌。在更特别的实施方案中，肝癌是转移性的。可以将AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体通过静脉内注射或者灌注到受治疗者体内，优选通过门静脉。本发明还提供一种包含本发明的治疗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。此外，本发明提供制备用于调节本发明的治疗剂的表达或活性的药物组合物的方法。这种方法包括将药学上可接受的载体与一种调节本发明的治疗剂的表达或活性的试剂一起配制。这种组合物还可以包括其它活性试剂。本发明的方法还包括一种或多种其它治疗方法，例如外科手术、标准的和实验性的化学治疗、激素治疗、生物学治疗、免疫治疗、放射治疗、栓塞术和/或化学栓塞治疗方法。此外，本发明提供预防、治疗、控制或改善受治疗者中的各种肿瘤和/或癌症的方法，包括但是不限于肝癌，包括给患者施用预防性或治疗性有效量的本发明的治疗剂。肿瘤和/或癌症可以是原发性的或转移性的。一个方面，本发明的治疗剂被系统性地施用给受治疗者，例如通过静脉内的、肌肉内的或皮下的注射或者口服施用。在另一个方面，治疗剂被局部施用给受治疗者，例如注射到受紊乱或疾病困扰的特定器官、组织或细胞供应血液的局部血管中，或者对受疾病困扰的机体部位进行喷雾或应用栓剂。在特定实施方案中，本发明的方法可以被用于预防、治疗、控制或改善肝癌，其中通过静脉注射、肌肉注射或口服路径来施用治疗剂。在优选实施方案中，通过门静脉注射来局部施用治疗剂。3.1定义如在此所用，术语“类似物”，特别是“血管抑制素类似物”是指一系列具有共同的生物学活性，包括抗原性/免疫原性和抗血管生成活性和/或结构性功能域并且具有在此定义的足够的氨基酸或核苷酸序列同一性的肽或核酸分子的任何成员。血管抑制素类似物可以来自相同或者不同种类的动物。类似地，B7.1类似物可以来自相同或者不同种类的动物。如在此所用的，术语“血管抑制素”或“血管抑制素蛋白”是指来自任何物种的血管抑制素蛋白、片段、变体或衍生物。血管抑制素可以来自灵长类包括人或非灵长类，包括猪、牛、小鼠、大鼠和鸡等。血管抑制素蛋白的一个例子包括SEQIDNO2的氨基酸序列。血管抑制素蛋白的另一个例子包括由SEQIDNO1的核苷酸序列或者在严紧条件下杂交到SEQIDNO1上的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。血管抑制素还指具有功能活性的血管抑制素蛋白(即具有通过下面第6节中描述的方法所评估的血管抑制素活性)及其片段、衍生物和类似物。可用于本发明的血管抑制素包括包含SEQIDNO2的氨基酸序列或者由SEQIDNO2的氨基酸序列组成的血管抑制素，或者具有相对于SEQIDNO2包含连续的或不连续的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基取代、缺失、置换或插入并且保留血管抑制素活性的氨基酸序列的血管抑制素；以及天然存在的小鼠血管抑制素的变体。特别有用的血管抑制素蛋白是人的血管抑制素。如在此所用，术语“B7.1”或者“B7.1蛋白”是指来自任何物种的B7.1共刺激分子或共刺激蛋白、片段、变体或衍生物。B7.1可以来自灵长类，包括人，或者非灵长类，包括猪、牛、小鼠、大鼠和鸡等。B7.1蛋白的一个例子包括SEQIDNO4或6的氨基酸序列。B7.1蛋白的另一个例子包括由SEQIDNO3或5的核苷酸序列或者在严紧条件下杂交到SEQIDNO3或5上的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。B7.1还指具有功能活性的B7.1蛋白(即具有通过下面第6节中描述的方法所评定的B7.1活性)及其片段、衍生物和类似物。可用于本发明的血管抑制素包括包含SEQIDNO4的氨基酸序列或者由SEQIDNO4的氨基酸序列组成的血管抑制素，或者具有相对于SEQIDNO4或6包含连续的或不连续的1个、2个、3个或更多个氨基酸残基替代、缺失、置换或插入并且保留血管抑制素活性的氨基酸序列的B7.1；以及天然存在的小鼠血管抑制素的变体。特别有用的B7.1蛋白是小鼠和人的B7.1。“保守性氨基酸替代”是其中氨基酸残基被具有类似电荷的侧链的氨基酸残基替代的替代。“非保守性氨基酸替代”是其中氨基酸残基被具有相反电荷的侧链的氨基酸残基替代的替代。在本领域中已经确定了具有类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族。遗传编码的氨基酸可以被分成四个家族(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)无电荷的极性的＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。类似地，氨基酸目录可以被分成(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)脂族的＝甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，而丝氨酸和苏氨酸可任选地被单独地分成脂族-羟基；(4)芳族＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺＝天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含硫的＝半胱氨酸和甲硫氨酸(参见例如Biochemistry，第4版，L.Stryer编辑，WHFreemanandCo.1995)。如在此所用的，术语“变体”是指给定肽的天然存在的等位基因变体或者特定肽或蛋白质的重组制备的变体，其中一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸替代、添加或缺失而被修饰。如在此所用的，术语“衍生物”是指给定肽或蛋白质的变体，其被另外地修饰，即通过将任何类型的分子共价连接到该肽或蛋白质上，该分子优选具有生物活性，包括非天然存在的氨酸。如在此所用的，术语“片段”包括一种优选具有血管抑制素或B7.1活性的多肽的氨基酸序列的至少5个连续的氨基酸残基，至少10个连续的氨基酸残基，至少15个连续的氨基酸残基，至少20个连续的氨基酸残基，至少25个连续的氨基酸残基，至少40个连续的氨基酸残基，至少50个连续的氨基酸残基，至少60个连续的氨基酸残基，至少70个连续的氨基酸残基，至少连续80个氨基酸残基，至少连续90个氨基酸残基，至少连续100个氨基酸残基，至少连续125个氨基酸残基，至少150个连续的氨基酸残基，至少连续175个氨基酸残基，至少连续200个氨基酸残基，至少连续250个氨基酸残基，至少300个氨基酸残基，至少350个氨基酸残基，至少400个氨基酸残基，至少450个氨基酸残基，至少500个氨基酸残基，至少550个氨基酸残基，至少600个氨基酸残基，至少650个氨基酸残基，至少700个氨基酸残基，至少750个氨基酸残基，至少800个氨基酸残基，至少850个氨基酸残基，至少900个氨基酸残基，或者它们中的多个的氨基酸序列的一种肽或多肽。如在此所用的，“分离的”核酸分子是从存在于该核酸分子的天然来源中的其它核酸分子中分离出来的分子。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，在通过重组技术生产时基本上不含有其它细胞物质或者培养基，或者当通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化学药品。在本发明的优选实施方案中，编码本发明的多肽/蛋白质的核酸分子是分离的或纯化的。术语“分离的”核酸分子不包括作为未从含有其它核酸分子的其它文库克隆中纯化掉的文库成员的核酸。如在此所用的，术语“组合”是指使用一种以上的预防性和/或治疗性试剂。如在此所用，术语“控制”(manage)、“控制”(managing)和“控制”(management)是指受治疗者从预防性或治疗性试剂中获得的有益作用，该作用不能治愈疾病或紊乱。在某些实施方案中，给受治疗者施用一种或多种预防性或治疗性试剂以“控制”疾病或紊乱，以防止疾病或紊乱的进展或恶化。如在此所用的，术语“预防”(prevent)、“预防”(preventing)和“预防”(prevention)是指施用预防性或治疗性试剂在受治疗者中产生的对疾病或紊乱的预防。如在此所用的，术语“预防性有效量”是指足以预防与细胞群体相关的疾病或紊乱的预防性试剂的含量，并且优选导致防止细胞增殖。预防性有效量可以指足以在患者中阻止细胞增殖的预防性试剂的含量。如在此所用的，术语“副作用”包括预防性或治疗性试剂的不期望的和不利的作用。不利作用通常是不期望的，但是不期望的作用不一定是不利的。由预防性的或治疗性的试剂产生的不利作用可能是有害的或令人难受的或危险的。化学治疗产生的副作用包括但是不限于胃肠道毒性例如，但是不限于早期和晚期形成的腹泻和肠胃气胀；恶心；呕吐；厌食；白血球减少症；贫血；嗜中性白血球减少症；虚弱；腹部痉挛；发烧；疼痛；体重下降；脱水；脱发；呼吸困难；失眠；眩晕；粘膜炎、口腔干燥和肾衰竭、便秘、神经和肌肉影响、对肾和膀胱的暂时性的或永久性损伤、流感样症状、体液潴留、暂时性的或永久性不育症。放射治疗的副作用包括但是不被限制在疲劳、口舌干燥、食欲不振和掉毛。其它的副作用包括胃肠毒性例如但是不限于，早期和晚期形成的腹泻和肠胃气胀；恶心；呕吐；厌食；白血球减少症；贫血；嗜中性白血球减少症；虚弱；腹部痉挛；发烧；疼痛；体重下降；脱水；脱发；呼吸困难；失眠；眩晕；粘膜炎；口舌干燥和肾衰竭。由生物治疗/免疫疗法产生的副作用包括但是不限于施用部位的皮疹或肿胀，流感样症状例如发烧、寒战和疲劳，消化道问题和过敏性反应。由激素治疗产生的副作用包括但是不限于恶心、生育问题、沮丧、食欲不振、视力问题、头痛和体重变化。患者通常所经历的其它不期望的作用还有许多，并且在本领域是已知的。许多作用被描述在Physicans’DeskReference(第56版)，2002)中。如在此所用的，术语“在严紧条件下”是指杂交和洗涤条件，在该条件下，相互之间具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％同一性的核苷酸序列彼此之间保持杂交。这种杂交条件被描述在，但是不限于，CurrentProtocolsinMolecularBiologyMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N6.3.6；BasicMethodsinMolecularBiology，ElsevierSciencePublishingCo.，Inc.，N.Y.(1986)，75-78，和84-87；以及MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.(1982)，387-389中，并且是本领域技术人员所熟知的。严紧杂交条件的一个优选的、非限制性的例子是在68℃下，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS中进行杂交，接着在室温下，在2XSSC、0.5％SDS中洗涤一次或多次。严紧杂交条件的另一个优选的、非限制性的例子是在约45℃下，在6xSSC中进行杂交，接着在约50-65℃下，在0.2XSSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。严紧杂交条件的还有一个优选的、非限制性的例子是在杂交过程中使用一种变性剂例如甲酰胺，例如在42℃下，使用50％(体积/体积)甲酰胺与0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，750mMNaCl，75mM柠檬酸钠；或者在42℃下，采用50％甲酰胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸钠，5XDenhardt溶液，超声波处理的鲑精DNA50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2XSSC和0.1％SDS中洗涤。如在此所用的，术语“受治疗者”和“患者”可互换地使用。如在此所用的，受治疗者优选为哺乳动物，例如非灵长类(例如，母牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如猴子和人)，最优选为人。如在此所用的，术语“治疗剂”是指可被用于预防、治疗、或控制与细胞群体有关的疾病或紊乱的任何试剂。术语“治疗剂”是指包含一种或多种编码血管抑制素或B7.1蛋白质的本发明的载体。如在此所用的，术语“治疗性有效量”是指足以治疗、控制或改善与细胞群体有关的疾病或紊乱的治疗剂的含量。治疗性有效量可以指足以降低细胞数目或者延迟或最小化细胞扩张(例如，降低或减缓原发性肿瘤的生长或降低或防止转移)的治疗剂的含量。治疗性有效量还可以指在治疗或控制与细胞群体有关的疾病或紊乱中产生治疗作用的治疗剂的含量。此外，对于本发明的治疗剂来说，治疗性有效量是指治疗剂单独地或者组合其它治疗方法在处理、控制或改善与靶细胞群体有关的疾病或紊乱中产生治疗作用的含量。如在此所用的，术语“治疗方法”和“疗法”是指可被用于预防、处理或控制与细胞群体有关的疾病或紊乱中的任何方案、方法和/或试剂。在某些实施方案中，术语“治疗方法”和“疗法”是指为本领域的技术熟练的内科医师所知的，可用于治疗癌症、传染病、自身免疫的和炎症性的疾病的癌症化学疗法、放射治疗、激素治疗、生物学治疗和/或其它治疗方法。如在此所用的，术语“处理”和“治疗”是指由施用一种或多种预防性或治疗性试剂产生的对与疾病或紊乱相关的细胞的杀死或抑制。附1A和1B分别显示小鼠血管抑制素的核苷酸序列(SEQIDNO1)和氨基酸序列(SEQIDNO2)。图2显示重组体AAV(rAAV)-血管抑制素构建体的示意图，其中CAG启动子、报导基因、编码小鼠血管抑制素的1.4kbcDNA(SEQIDNO1)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)和polyA序列被插入在反向末端重复(ITR)之间。图3A-3F显示在通过门静脉灌注rAAV-血管抑制素后，在肝细胞中血管抑制素的长期表达。通过免疫组织化学分析(A、B、C)和原位杂交分析(D、E、F)，在肝细胞中检测到血管抑制素的过度表达。在用空AAV处理(A，D)后14天、用AAV-血管抑制素处理后14天(B、E)或180天(C、F)，与抗血管抑制素的单克隆抗体(mAb)反应(染色为棕色)或者与地高辛(DIG)标记的反义cRNA杂交(100x放大；染色为绿色)，来制备代表性的肝脏切片。图4显示蛋白质印迹的结果，其中将来自灌注了rAAV-血管抑制素的小鼠的匀浆的肝脏细胞的提取物用抗血管抑制素抗体(Ab)或者抗β-肌动蛋白Ab(作为内部对照)进行免疫印迹。在AAV-血管抑制素灌注后的第2天(条带1)、14天(条带2)、28天(条带3)、60天(条带4)、90天(条带5)或者180天(条带6)，从小鼠中切取肝脏。图5A-5C显示通过门静脉基因转移rAAV-血管抑制素对结节形式和分散形式的肝脏转移性肿瘤的肿瘤体积；转移性肿瘤的相对面积；以及1％存活率的影响。(A)将2×105EL-4肿瘤注射到肝被膜下的左肝叶中，建立肝脏结节转移性肿瘤，接着门静脉内灌注3×1011rAAV-血管抑制素病毒颗粒。PBS和空AAV病毒作为对照。在操作后4周，从小鼠中切取肝脏，并测量肿瘤体积。每一个点代表一只小鼠。平均肿瘤体积用大十字指示(P＜0.01)。(B)通过脾脏内注射2×105EL-4肿瘤来建立分散的肝脏转移性肿瘤，接着进行门静脉内灌注处理。在该操作后6周，从所有小鼠中切取肝脏，低温保存肝脏样本，用西格玛图像软件测量肿瘤面积。肿瘤占据的平均相对面积用大十字指示(P＜0.01)。(C)通过脾脏内注射1×106EL-4肿瘤细胞来建立分散的肝脏转移性肿瘤的模型，接着随机门静脉内注射PBS、空AAV、或者rAAV-血管抑制素。每周观察小鼠两次。当通过预先建立的标准判定小鼠濒临死亡时，处死小鼠，绘制它们的存活曲线。图6A-6C显示通过rAAV-血管抑制素处理来抑制肿瘤血管化，该血管化不依赖于血管内皮生长因子(VEGF)。将EL-4肿瘤直接注射到肝被膜下的肝左叶中，接着通过门静脉灌注PBS(A)、空AAV(B)或AAV-血管抑制素(C)。处理后4周，从小鼠中切取肝脏。将肿瘤切开，冷冻，并用抗CD31的抗体染色。图7A-7C显示AAV-血管抑制素处理对肿瘤血管化(A和B)以及VEGF表达(C)的影响。在盲选的随机区域中计数用抗CD31mAb染色的血管，记录平均血管密度(A)，或者用同心圆的方法记录从排列点到最近的CD31标记的中值距离(B)。在用rAAV-血管抑制素处理的肿瘤与用PBS或空AAV病毒处理的肿瘤之间存在显著性差异(P＜0.01；用星号表示)。如使用VEGF特异性Ab的Western印迹(C)中所示，将rAAV-血管抑制素灌注到肝脏中对肿瘤细胞表达VEGF没有显著影响(条带1PBS；条带2空AAV和条带3rAAV-血管抑制素)。图8A-8C显示用TUNEL检测rAAV-血管抑制素的细胞凋亡作用。rAAV-血管抑制素处理导致肿瘤细胞凋亡，但是未引起正常肝细胞的凋亡。将EL-4肿瘤直接注射到肝被膜下的肝左叶中，接着通过门静脉灌注rAAV-血管抑制素病毒颗粒(C)、PBS(A)或者空AAV颗粒(B)。处理后4周，从小鼠中切取肝脏。水平切开肝脏肿瘤并冷冻。用TUNEL检查切片中的凋亡，而邻近的切片用苏木精/曙红染色，以比较凋亡指数(参见下文)。箭头指向肝脏中的肿瘤位置。图9显示凋亡指数(AI)[(凋亡细胞的数量/有核细胞的总数)×100]的比较。rAAV-血管抑制素的AI(用星号指示)显著高于PBS(P＜0.001)或rAAV-血管抑制素和空AAV组(P＜0.01)。图10A-10C显示AAV-B7.1的转染效率。将亲本EL-4细胞与AAV-B7.1一起培养6小时。图10A显示EL-4细胞表面上的B7.1蛋白的表达(粗线)以及用第二抗体(Abs)染色的背景(细线)。图10B显示EL-4细胞表面上的B7.1蛋白的表达，该EL-4细胞已经被转染了AAV-B7.1载体，接着用特定的抗B7.1单克隆抗体(mAb)和FITC-标记的第二抗体进行了免疫染色，随后通过荧光显微镜显示。与空AAV载体一起培养的细胞EL-4被用作对照。图10C证实在转染AAV-B7.1后表达了B7.1蛋白，这通过Western印迹分析得到验证。该印迹用抗β-肌动蛋白抗体染色，证明在各个泳道中加载了等量的蛋白质。图11A-E显示门静脉灌注AAV-血管抑制素会导致在肝细胞中长期和稳定地表达血管抑制素。图11A和11C显示在用空AAV处理后14天制备的肝脏切片。图11B和11D显示在用AAV-血管抑制素处理后14天制备的肝脏切片。图11A和11C分别显示，通过原位杂交和免疫组织化学分析测定，在用空AAV处理的肝细胞中，内源性血管抑制素含量低。图11B和11D分别显示，通过原位杂交和免疫组织化学分析测定，在用AAV-血管抑制素处理的肝细胞中，肝细胞中过度表达血管抑制素。用DIG-标记的反义cRNA将土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)RNA染色为蓝色(用箭头指示)。用抗血管抑制素特异的mAb将血管抑制素蛋白染色为棕色。图11E证实用抗血管抑制素mAb，通过Western印迹分析体内血管抑制素的表达。从在AAV-B7.1灌注后2天(泳道2)、14天(泳道3)、60天(泳道4)和180天(泳道5)切取肝脏的小鼠中制备肝脏匀浆。而在小鼠接受空AAV后60天制备的肝脏匀浆被用作为对照(泳道1)。图12A-12B显示AAV-B7.1转染的EL-4细胞刺激抗肿瘤免疫。图12A显示，通过门静脉内灌注用AAV-B7.1或空AAV转染的EL-4细胞攻击的小鼠的肝脏中，肿瘤占据的相对面积(％)。肿瘤占据的平均相对面积用大十字指示。图12B显示体外CTL杀死试验的结果，其中来自用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种的小鼠的脾细胞，不含有肝脏肿瘤，以100∶1、50∶1和10∶1的效应子与靶点(E∶T)的比例与用AAV-B7.1或空AAV转染的EL-4细胞混合。在存在抗-B7.1Ab时进行细胞毒性分析。*指示与用空AAV转染的亲本EL-4细胞的P＜0.01的显著性差别。图13A-13C显示由通过用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种产生的抗肿瘤免疫性可以被记忆。图13A显示在门静脉内注射AAV-B7.1转染的EL-4细胞后4周从无肿瘤小鼠中获得的脾细胞的抗肿瘤CTL活性相对于从接受了空AAV转染的EL-4细胞的小鼠中获得的脾细胞的抗肿瘤CTL活性被增强了。将百分细胞毒性相对于各种效应子与靶点(E∶T)的比例进行作图。图13B显示肿瘤在来自通过门静脉内注射EL-4细胞进行攻击的未被免疫接种的和被免疫接种的小鼠的肝脏中所占据的相对面积(％)。图13C显示肿瘤在来自通过门静脉内注射亲本EL-4细胞而再攻击的未被免疫接种的和被免疫接种的小鼠的肝脏中所占据的相对面积(％)。虽然被免疫接种的小鼠不能抵抗再攻击，但是转移到肝脏的肿瘤的生长被抑制。*和**分别指示以P＜0.01和P＜0.001显著地和极其显著地区别于对照组。图14A-14C显示，用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种和用AAV-血管抑制素治疗产生协同作用，消除了分散的转移性肝脏肿瘤并提高了小鼠的存活力。图14A显示肿瘤在来自用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)处理的未被免疫接种的小鼠和用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用空AAV病毒处理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用AAV-血管抑制素处理的小鼠(4)的肝脏中占据的相对面积(％)。图14B显示用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)处理的未被免疫接种的小鼠和用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用空AAV病毒处理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用AAV-血管抑制素处理的小鼠(4)的存活率。每周观察小鼠三次，并且在通过预先建立的标准确定濒临死亡时，处死小鼠。图14C显示来自用空AAV病毒(1)或AAV-血管抑制素(3)处理的未被免疫接种的小鼠和用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用空AAV病毒处理的小鼠(2)或者用AAV-B7.1转染的EL-4细胞免疫接种并用AAV-血管抑制素处理的小鼠(4)的具有转移性肿瘤的肝脏的代表性照片。箭头指向肝脏中的肿瘤。5.本发明的详细描述5.1载体的构建和蛋白质的表达本发明涉及包含编码血管抑制素或B7.1分子的序列的核酸分子。本发明涉及在合适的宿主细胞中编码和指导血管抑制素和B7.1分子表达的核酸分子。由于遗传密码的内在简并性，包括编码与血管抑制素或B7.1分子的相同的氨基酸序列的核苷酸序列的其它多核苷酸可以被用于实施本发明。这些核苷酸包括但是不限于包括血管抑制素编码区或B7.1基因的全部或部分的核苷酸序列，这些序列通过在序列中用编码相同氨基酸残基的不同密码子替代而被改变，从而产生沉默的改变。这种核酸分子包括在严紧条件下与编码血管抑制素和/或B7.1基因的序列或其互补序列杂交的核酸序列。在一个实施方案中，杂交到SEQIDNO1、3或5的互补物上的核酸分子包括其中的至少5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、100个、120个、130个、150个、170个、180个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1300个、1500个、2000个、2500个或其多倍的核苷酸。在某些实施方案中，核酸分子包括编码血管抑制素和共刺激分子B7.1的核酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包括AAV载体和巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子(CAG启动子)，该启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的核酸序列上。在特定实施方案中，核酸分子包括AAV载体和CAG启动子，该启动子被可操作地连接到SEQIDNO1的核苷酸序列上或者编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上。如在此所用的，短语“严紧条件”是指采用低离子强度和高洗涤温度的杂交条件，例如50℃下的0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS；或者在68℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS中杂交，接着在室温下在2XSSC，0.5％SDS中洗涤一次或多次；或者在约45℃下在6XSSC中杂交，接着在约50-65℃下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；(2)在杂交过程中使用一种变性剂例如甲酰胺，例如在42℃下，使用50％(体积/体积)甲酰胺与0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，750mMNaCl，75mM柠檬酸钠；或者(3)在42℃下，采用50％甲酰胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M焦磷酸钠，5XDenhardt溶液，超声波处理的鲑精DNA50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2XSSC和0.1％SDS中洗涤。可以将包含编码血管抑制素或B7.1分子的序列的核酸分子工程化，包括但是不限于，改变基因产物的加工和表达的变化。例如，改变糖基化模式或磷酸化等。在某些实施方案中，本发明的核酸分子包括编码血管抑制素和B7.1的核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，核酸分子包括包含SEQIDNO1和3的核苷酸序列的核苷酸序列。在特定的实施方案中，核酸分子包括包含SEQIDNO1和5的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个特定的实施方案中，核酸分子包括编码SEQIDNO2和4的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个特定的实施方案中，核酸分子包括编码SEQIDNO2和6的氨基酸序列的核苷酸序列。为了表达生物活性的血管抑制素或B7.1蛋白，编码血管抑制素或B7.1蛋白的核苷酸序列分别被插入到合适的表达载体中，即含有被插入核酸分子的转录和翻译所必需的元件的载体。基因产物以及用重组的表达载体转染或转化的宿主细胞或细胞系在本发明的保护范围内。可以用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码血管抑制素或B7.1分子的序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括DNA体外重组技术、合成技术和体内重组/基因重组。参见，例如，被描述在Sambrook等人，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，N.Y.和Ausubel等人，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.中的技术。可以用各种宿主表达载体系统来表达血管抑制素和/或B7.1分子。这些系统包括但是不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA转化的病毒、质粒DNA或粘粒DNA表达载体；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞；或者动物细胞系统。各种系统的表达元件的强度和特异性是不同的。根据所用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用大量合适的转录和翻译元件的任何一种，包括组成型和诱导型的启动子。例如，当在细菌系统中进行克隆时，可以使用诱导型启动子例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子；巨细胞病毒启动子；EGR-1启动子和靶向特定启动子的白蛋白)等；当在昆虫细胞系统中进行克隆时，可以使用启动子如杆状病毒多角体蛋白启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用来源于植物细胞基因组的启动子(例如热休克启动子；RUBISCO的小亚基的启动子；叶绿素α/β结合蛋白的启动子)或者来自植物病毒的启动子(CaMY的35SRNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中进行克隆时，可以使用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)、来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)或者来自鸟类细胞的启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子)；当生成的细胞系含有多拷贝的嵌合DNA时，可以与适当选择性标记一起使用SV40、BPV和EBV载体。在细菌系统中，可以有利地根据用于被表达的蛋白质的用途对大量的表达载体进行选择。例如当要生产大量蛋白质时，指导表达高水平的容易被纯化的蛋白质产物的载体是期望的。这种载体包括但是不限于pHL906载体(Fishman等人，Biochem.1994；336235-6243)、大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人.EMBOJ.1983；21791)，其中蛋白质编码序列可以与lacZ编码区一起被连接到载体的读框内，以生成杂合的AS-lacZ蛋白质；pIN载体(Inouye&Inouye.NucleicAcidsRes.1985；133101-3109；VanHeeke&；Schuster.JBiolChem.1989；2645503-5509)等。特定的起始信号也是本发明的核酸分子有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在将包括自身的起始密码子和邻近序列的整个基因插入到适当的表达载体中的情况下，不需要额外的翻译控制信号。但是，在血管抑制素或B7.1蛋白质编码序列不包括自身的起始密码子的情形下，必须提供外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与血管抑制素或B7.1蛋白编码序列的阅读框协调，以确保整个插入物的翻译。这些外源转录控制信号和起始密码子可以是各种来源的，可以是天然的和合成的。可以通过插入适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达效率(参见Bittner等人，MethodsinEnzymol.1987；153516-544)。此外，可以选择调节插入序列的表达或以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能来说是重要的。在血管抑制素或B7.1蛋白中存在一致的N-糖基化位点，可能需要针对最佳功能的正确修饰。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质翻译后加工和修饰的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统来确保正确地修饰和加工蛋白质。至此，可以使用具有正确加工原始转录物、血管抑制素或B7.1蛋白的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但是不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。为了长期、高产量地生产血管抑制素和B7.1蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达血管抑制素或B7.1蛋白的细胞系。比采用含有病毒性复制起始的表达载体更好的是，可以用受适当的表达控制元件控制的编码序列来转化宿主细胞，这些控制元件如启动子(例如，鸡β-肌动蛋白启动子、EGR-1启动子和靶特异性启动子白蛋白)、增强子(例如，CMV增强子)、转录终止子、转录后调控元件(例如，WPRE)、多腺苷酸位点等，以及一种可选择的标记。在插入外源DNA后，让工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择培养基中。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性，使得细胞能够稳定地将质粒整合到染色体上，生长形成转化灶，该转化灶随后被克隆和扩张到细胞系中。可以使用许多选择体系，包括但是不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell11223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)，并且腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell22817)基因可以分别被应用到tk-、hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代物抗性可以被用作选择dhfr的基础，dhfr赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)；用作选择gpt的基础，gpt赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)；用作选择neo的基础，neo赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501)；以及用作选择hygro的基础，hygro赋予对潮霉素基因的抗性(Santerre等人，1984，Gene30147)。其它的可选择基因已经被描述，即trpB，它使细胞利用吲哚替代色氨酸；hisD，它使细胞利用组氨醇替代组氨酸(Hartman&Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO的抗性(McConlogueL.，1987，InCurrentCommunicationsinMolecularBiology，ColdSpringHarborLaboratory编辑)。容易通过本领域熟知的方法来确定血管抑制素或B7.1分子的身份和功能活性。例如，可以用该蛋白质的抗体在Western印迹分析或组织的免疫组织化学染色中鉴定该蛋白质。5.2药物组合物本发明的治疗剂可以被掺入到适合施用的药物组合物中。这种组合物通常包括核酸分子；以及药学上可接受的载体。如在此所用，术语“药学上可接受的载体”是用以包括任何和所有的溶剂、分散媒介、包被、抗菌素和抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂等，适合于药学上施用。这些媒介和试剂用于药学活性物质的用途在本领域是已知的。除了在任何传统的媒介或试剂不与活性化合物相容的范围之外，可以期待其在组合物中的用途。辅助的活性化合物也可以被掺入到该组合物中。本发明包括用于制备包括本发明的核酸分子的药物组合物的方法。这种方法包括将药学上可接受的载体与本发明的治疗剂一起配制。这种组合物还可以包括其它活性试剂。因此，本发明还包括通过将药学上可接受的载体与本发明的核酸分子和一种或多种其它活性化合物一起配制来制备药物组合物的方法。配制本发明的药物组合物，以与其特定的施用路径相适应。施用路径的例子包括胃肠外的，例如动脉内的、门静脉内的、肌肉的、静脉内的、皮层内的、皮下的、经皮(局部)的、经粘膜的、关节内的、腹膜内的和胸膜内的以及口腔的、吸入的和直肠的施用。在一个优选实施方案中，施用路径是门静脉内的、例如通过门静脉的。在另一个优选实施方案中，施用路径是肌肉的，例如在三角肌部位、背侧臀肌部位、股外侧肌部位、腹侧臀肌部位。用于胃肠外的、皮层内的或皮下的应用的溶液或悬浮液可以包括如下成分无菌稀释液，如注射用水、盐溶液、不挥发的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌性试剂例如苯甲醇或羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸、柠檬酸或磷酸和用于调节渗透性的试剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠来调节pH。可以将胃肠外的制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。适合用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水)或者分散体和用于临时制备无菌水溶液或者分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF；Parsippany，NJ)或者磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的，具有一定程度的流动性，使得容易用注射器注射。在制造和贮存条件下必须稳定，必须抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是一种溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇等)，以及合适的它们的混合物。例如在分散体的情况下，可以通过使用一种包被，例如卵磷脂来维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来保持恰当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可以在组合物中含有延缓吸收的试剂例如单硬酯酸铝和明胶，来实现延缓可注射的组合物的吸收。在具有上面列举的成分的一种或多种组合的适当溶剂中掺入所需量的活性化合物(例如核酸分子)，如果需要，接着过滤灭菌，可以制备无菌的可注射溶液。一般地，将活性化合物掺入到含有基础分散介质和所需的来自上面列举的那些的其它成分的无菌载体来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从先前灭菌过滤的的溶液中得到活性成分加上任何其它期望成分的粉末。口服组合物通常包括惰性稀释剂和可食用的载体。它们被包裹在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂掺合，并以片剂、锭剂或者胶囊的形式使用。还可以用作为漱口水的液体载体来制备口服组合物，其中液体载体中的化合物被口服应用，漱口和吐出或咽下。药学上相容的粘合试剂和/或佐剂物质可以作为组合物的一部分被包括在内。片剂、药丸、胶囊、锭剂等可以含有任何的如下成分或具有相似特性的化合物粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；或者玉米淀粉；滑润剂，如硬酯酸镁或Sterotes；滑动剂(glidant)，如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者风味剂，例如薄荷油、甲基水杨酸盐或者橙调味品。对于通过吸入施用，从密闭容器中或者从含有合适的推进剂如二氧化碳的分配器或者从喷雾器中以气雾剂的形式递送化合物。还可以通过经粘膜的或经皮的方式进行系统性施用。对于经粘膜的或经皮的施用，在制剂中使用适合于将要穿透的障碍的渗透剂。这种渗透剂在本领域中是公知的，包括，例如，对于经粘膜施用来说，有去垢剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾或者栓剂来实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制到如本领域公知的油膏、药膏、凝胶体或者面霜中。该化合物还可以以栓剂(例如采用传统的栓剂基础如可可油和其它的甘油酯)或者用于直肠呈递的存留灌肠剂的形式制备。在一个实施方案中，将活性化合物与载体一起配制，该载体将防止化合物迅速从机体中消除，例如一种控制释放的制剂，包括植入物和微胶囊呈递系统。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯基酯聚合物、聚酐、聚乙醇酸、胶原质、聚正酯(polyorthoesters)和聚乳酸。用于制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是显然的。材料可以从AlzaCorporationandNovaPharmaceuticals，Inc购买得到。脂质体悬浮液(包括靶向具有抗病毒抗原的单克隆抗体的被感染细胞的脂质体)也可以被用作药学上可接受的载体。这些载体可以按照本领域技术人员已知的方法，例如，在美国专利4,522,811中描述的方法来制备。特别有利的是，以容易施用和剂量一致的剂量形式配制口服的或胃肠外的组合物。如在此所用的，剂量单位形式是指适合作为被治疗的受治疗者的单一剂量的物理上分散的单位；各个单位含有预先确定含量的活性化合物，该化合物的含量被计算以与所需的药物载体联合产生期望的治疗作用。本发明的剂量单位形式的规格受限于并且直接取决于活性化合物的特性和将要达到的特定治疗作用，以及本领域中混合这种活性化合物来处理个体的内在限制。从细胞培养分析和动物试验中获得的数据可以被用于配制用于人的剂量范围。这种化合物的剂量优选在包括毒性很低或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。该剂量可以在该范围内变化，取决于所采用的剂量形式和所用的施用路径。对于用于本发明的方法中的任何化合物来说，首先可以从细胞培养分析中估计治疗有效剂量。在细胞培养和动物模型中配制一种剂量，以获得包括在细胞培养中确定的IC50(获得对症状的半数最大抑制的被检测化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可以被用于更加精确地确定人中的有用剂量。可以测量血浆中的含量，如通过高效液相色谱测量。对于采用动物模型来确定最佳剂量，参见例如下文的第6.2节。熟练的操作人员将会意识到，某些因素将会影响有效治疗受治疗者所需的剂量，包括但是不限于疾病或紊乱的严重程度、先前的治疗、受治疗者的健康状况和/或年龄和存在的其它疾病。而且，用治疗有效量的治疗剂例如核酸分子治疗受治疗者，包括单次治疗或者，优选包括一系列治疗。还可以预期，用于治疗的有效量核酸分子在特定治疗过程中可能会增加或减少。可以从在此描述的诊断分析中得出剂量的变化并且是显然的。考虑到患者的症状，各个内科医生能够选择精确的配制方法、施用路径和剂量(参见，例如Fingl等人，1975，InThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第一章第1页)。本发明的核酸分子可以被插入到载体中，被用作基因治疗载体。将基因治疗载体呈递到受治疗者中的方法包括静脉内注射、局部施用(美国专利5,328,470)或者通过定向注射(参见，例如Chen，等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9130543057)。基因治疗载体的药物制剂可以在可接受的稀释剂中包括基因治疗载体或者可以包含包埋了基因呈递载体的缓释基质。可替代地，当从重组细胞中完整制备完整的基因呈递载体，如逆转录病毒载体时，药物制剂可以包括一种或多种产生基因呈递系统的细胞。至于基因治疗，参见第5.3.4节中的进一步讨论。5.3采用本发明的核酸分子的治疗性/预防性方法本发明还指向治疗或预防与特定细胞群体的异常活性相关的疾病或紊乱的治疗性或预防性的方法。这种疾病或紊乱可以通过减少细胞数量或者延缓或最小化细胞增殖来治疗或预防。本发明还提供防止肿瘤或癌症复发的方法。5.3.1癌症可以用本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症及相关紊乱包括但是不限于如下白血病例如但是不限于，急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病如成髓细胞的、原髓细胞的、骨髓单核细胞的、单核细胞的、红白血病和髓发育异常综合症，慢性白血病如但是不限于，慢性髓细胞的(粒细胞的)白血病，慢性淋巴细胞白血病，多毛细胞白血病；红血球增多症；淋巴瘤例如但是不限于Hodgkin病，非Hodgkin病；多发性骨髓瘤例如但是不限于多发性郁积骨髓瘤，非分泌性骨髓瘤，骨硬化骨髓瘤，浆细胞白血病，单浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；意义未确定的单克隆免疫球蛋白病(gammopathy)；良性的单克隆免疫球蛋白病；重链疾病；骨骼和结缔组织肉瘤例如但是不限于骨骼肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，Ewing肉瘤，恶性巨细胞肿瘤，骨骼纤维肉瘤，脊索瘤，骨膜肉瘤，软组织肉瘤，血管肉瘤(angiosarcoma)(血管肉瘤(hemangiosarcoma))，纤维肉瘤，Kaposi肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管肉瘤，神经鞘瘤(neurilemmoma)，横纹肌肉瘤，滑液肉瘤，脑瘤例如但是不限于，神经胶质瘤，星形细胞瘤，脑干神经胶质瘤，室鼓膜瘤，少突胶质细胞瘤，非神经胶质瘤，听神经瘤(acousticneurinoma)，颅咽管瘤，成神经管细胞瘤，脑膜成纤维细胞瘤，松果体区内肿瘤(pineocytoma)、成松果体细胞瘤，原发性脑淋巴瘤；乳腺癌包括但是不限于，腺癌，小叶(小细胞)癌，管内癌，髓质乳腺癌，粘膜乳腺癌，管状乳腺癌，乳突乳腺癌，Paget疾病和炎症性乳腺癌；肾癌例如但是不限于嗜铬细胞瘤(pheochromocytom)和肾上腺皮质癌；甲状腺癌例如但是不限于乳突的或甲状腺癌，髓质的甲状腺癌和整形的甲状腺癌；胰腺癌例如但是不限于胰岛细胞癌，促胃液素瘤，胰升血糖素瘤，VIP肿瘤(vipoma)，抑生长素-分泌肿瘤和良性肿瘤的或胰岛细胞瘤；垂体癌例如但是不限于Cushing病，催乳激素-分泌肿瘤，肢端肥大症和尿崩症；眼癌例如但是不限于，眼黑素瘤例如虹膜黑素瘤，脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤和眼癌；阴道癌例如鳞状细胞癌，腺癌和黑素瘤；阴门癌例如鳞状细胞癌，黑素瘤，腺癌，基细胞癌，肉瘤和Paget病；宫颈癌例如但是不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌例如但是不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌例如但是不限于，卵巢上皮细胞癌，边缘肿瘤，生殖细胞瘤和基质瘤；食管癌例如但是不限于，鳞状癌，腺癌，腺样囊样癌，粘液表皮样癌，腺鳞状癌，肉瘤，黑素瘤，浆细胞癌，疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌例如但是不限于，腺癌，真菌状生长的(息肉状的)、溃烂的、表面伸展的、广泛伸展的恶性淋巴瘤，脂肪肉瘤纤维肉瘤和恶性肉瘤；直肠癌；肝癌例如但是不限于肝细胞癌和肝成纤维癌，胆囊癌例如腺癌；胆囊癌(cholangiocarcinomas)例如但是不限于，乳突的、结节的和扩散的；肺癌例如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌(鳞状细胞癌)，腺癌，大的细胞癌和小的细胞肺癌；阴囊癌例如但是不限于，幼芽的肿瘤，睾丸精原细胞瘤，整形手术的、典型的(独特的)、精细胞的、非精原细胞瘤，胚胎性癌，畸胎瘤，绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌例如但是不限于，腺癌，平滑肌肉瘤和阴茎癌；口腔癌例如但是不限于鳞状细胞癌；基癌(basalcancers)；唾液腺癌例如但是不限于，腺癌，粘液表皮样癌，和腺状囊状癌；咽癌例如但是不限于，鳞状上皮细胞癌，疣的；皮肤癌例如但是不限于基细胞癌，鳞状细胞癌和黑素瘤，表面伸展的黑素瘤，结节的黑素瘤，雀斑状痣恶性黑素瘤，acral雀斑黑素瘤；肾癌例如但是不限于肾细胞癌，腺癌，超级肾瘤，纤维肉瘤，转移细胞癌(肾盂和/或子宫)；Wilms肿瘤；膀胱癌例如但是不限于转移细胞癌，鳞状细胞癌症，腺癌，恶性肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤，成骨肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管内皮细胞肉瘤，间皮瘤，滑液瘤，成血管细胞瘤，上皮瘤，囊状腺癌，支气管癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳突状癌和乳突腺癌(对这些紊乱的综述，参见Fishman等人，1985，Medicine，2dEd.，J.B.LippincottCo.，Philadelphia和Murphy等人，1997，InformedDecisionsTheCompleteBookofCancerDiagnosis，Treatment，andRecovery，VikingPenguin，PenguinBooksU.S.A.，Inc.，UnitedStatesofAmerica)。因此，本发明的方法和组合物还可以用于治疗或预防各种癌症或其它的异常的增生性疾病，包括(但是不限于)如下癌症，包括膀胱、乳腺、大肠、肾脏、肝脏、肺部、卵巢、前列腺、胃、子宫颈、甲状腺和皮肤的癌症；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血性肿瘤，包括白血病，急性淋巴细胞白血病，急性成淋巴细胞白血病，B-细胞淋巴瘤，T-细胞淋巴瘤，Berketts淋巴瘤；骨髓谱系的造血性肿瘤，包括急性和慢性的骨髓性白血病和前髓细胞白血病；间叶细胞来源的肿瘤，包括成纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括成纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、外皮色素沉积(xenodermapegmentosum)、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡瘤和畸胎癌。还可以预期，由凋亡中的异常引起的癌症也可以用本发明的方法和组合物来治疗。这种癌症包括但是不限于滤泡淋巴瘤，p53突变的癌症，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖肿瘤，以及癌症前期的损害例如家族性的腺癌息肉病和髓细胞发育异常综合症。在特定的实施方案中，在卵巢、膀胱、乳腺、大肠、肝脏、肺部、皮肤、前列腺或子宫中，治疗或预防恶性的和异常增生性的变化(例如转化的和发育异常的)或者超增生性的紊乱。在其它特定实施方案中，肉瘤、黑素瘤或白血病被治疗或预防。5.3.2治疗性/预防性的施用本发明提供通过给动物(例如母牛、猪、马、鸡、猫、狗、人等)施用有效量的本发明的多核苷酸来预防和处理癌症、肿瘤或者癌症或肿瘤的复发的方法。本发明的多核苷酸可以以其本身或者药物组合物的形式被施用给受治疗者，来治疗和预防癌症。在特定的实施方案中，本发明的多核苷酸通过门静脉内注射施用。在另一个特定的实施方案中，本发明的多核苷酸通过肌肉注射来施用。在某些实施方案中，本发明的治疗性或预防性组合物与一种或多种可以用于治疗疾病或症状的其它治疗性或预防性的组合物同时地被施用给哺乳动物，优选为人。在一个实施方案中，AAV-B7.1载体与AAV-血管抑制素载体同时地被施用。术语“同时地”不是将预防性或治疗性组合物的施用限定在严格的同一时间，而是指本发明的组合物和其它试剂顺序地并且在一个时间间隔内被施用给哺乳动物，使得包含多核苷酸的组合物可以与其它组合物一起作用，产生比它们以其它方式被施用时更强的有益效果。例如，各种预防性或治疗性组合物(例如化学治疗、放射治疗、激素治疗、生物学治疗、栓塞术或者化学栓塞术治疗)可在同一时间点上被施用或者以任何顺序在不同时间点上顺序地被施用；然而，如果不是在相同时间点上施用，则它们应当在足够接近的时间点上被施用，以产生期望的治疗性或预防性作用。各种治疗性组合物可以被分开施用，以任何适当形式和通过任何合适的路径施用。在其它实施方案中，在手术之前、同时和之后，施用本发明的组合物。优选地，手术完全去除了局部肿瘤或者降低了大肿瘤的尺寸。还可以实施手术来减少疼痛。在各种实施方案中，在相隔小于1小时、相隔约1小时、相隔约1-2小时、相隔约2-3小时、相隔约3-4小时、相隔约4-5小时、相隔约5-6小时、相隔约6-7小时、相隔约7-8小时、相隔约8-9小时、相隔约9-10小时、相隔约10-11小时、相隔约11-12小时、相隔不超过24小时或者不超过48小时时，施用预防性或治疗性组合物。在优选实施方案中，给同一个患者施用两种或多种成分。在其它实施方案中，在相隔约30分钟、相隔约1小时、相隔约1-2小时、相隔约2-3小时、相隔约3-4小时、相隔约4-5小时、相隔约5-6小时、相隔约6-7小时、相隔约7-8小时、相隔约8-9小时、相隔约9-10小时、相隔约10-11小时、相隔约11-12小时、相隔约1-2天、相隔约2-4天、相隔约4-6天、相隔约1周、相隔约1-2周、或相隔2周以上施用预防性或治疗性组合物。在优选实施方案中，在组合物仍具有活性的期限内施用预防性或治疗性组合物。在特定的实施方案中，在施用第一种AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体后4周，施用第二种AAV-B7.1载体、AAV-血管抑制素载体和/或AAV-B7.1/血管抑制素载体。本领域技术人员能够通过被施用的组合物的半衰期来确定该时间期限。在特定的实施方案中，AAV-B7.1和AAV-血管抑制素载体都通过门静脉内注射来施用。在另一个特定的实施方案中，AAV-B7.1和AAV-血管抑制素载体都通过肌肉注射来施用。在另一个特定的实施方案中，AAV-B7.1载体通过门静脉内注射来施用，而AAV-血管抑制素载体通过肌肉注射来施用。在还有一个特定的实施方案中，AAV-B7.1载体通过肌肉注射来施用，而AAV-血管抑制素载体通过门静脉内注射来施用。在某些实施方案中，本发明的预防性或治疗性组合物被循环施用给受治疗者。循环治疗包括施用第一种组合物一段时间，接着施用第二种组合物和/或第三种组合物一段时间，并重复该连续施用。循环治疗能够减少产生对一种或多种治疗方法的抗性，避免或降低一种治疗方法的副作用，和/或提高治疗的功效。在某些实施方案中，在小于约3周、约每2周1次、约10天1次或约每周1次的循环中施用预防性或治疗性的组合物。一个循环可以包括通过每个循环灌注90分钟以上、每个循环灌注约1小时、每个循环灌注约45分钟来施用治疗性或预防性组合物。每个循环包括至少1周的休止期、至少2周的休止期、至少3周的休止期。施用的循环数为约1-12个循环，更加典型地为约2-10个循环，更加典型地为约2-8个循环。在还有其它实施方案中，本发明的治疗性和预防性组合物以有规律的剂量方案施用，通过没有长期休止期的持续灌注或者频繁的施用。这种有规律的施用包括在无休止期的恒定间隔中给药。剂量方案包括在很长一段时期内长期每日施用相对低的剂量。在优选实施方案中，使用较低剂量能够最小化毒副作用，并去除休止期。在某些实施方案中，通过在约24小时到约2天、到约1周、到约2周、到约3周、到约1个月、到约2个月、到约3个月、到约4个月、到约5个月、到约6个月的范围内，长期低剂量或者持续灌注治疗性和预防性的组合物。这种剂量方案的时间安排可以由熟练的内科医生来优化。在此提供的剂量含量和施用频率包括在术语治疗有效性和预防有效性中。通常，剂量和频率还随特异于各个患者的因素来变化，取决于所施用的特定治疗性或预防性组合物、疾病或症状的严重性和类型、施用路径，以及患者的年龄、体重、反应和已往病史。在考虑这些因素和如下的例如在文献中报导的和在Physician′sDeskReference(56thed.，2002)中推荐的剂量后，本领域技术人员能够选择合适的方案。各种呈递系统是已知的，可以用于施用本发明的治疗性或预防性的组合物，例如封装在脂质体、微粒、微囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞中、受体介导的细胞内吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987))、作为逆转录病毒的和其它载体的部分的核酸构建体中等。施用本发明的预防性或治疗性的组合物的方法包括，但是不限于，胃肠外施用(例如，经皮的、肌肉内的、腹腔内的、静脉内的和皮下的)、硬脑膜上的和粘膜的(例如，鼻内和口腔路径)。在特定实施方案中，本发明的预防性或治疗性组合物通过肌肉内、静脉内或皮下施用。通过任何便捷的路径，例如通过灌注或大丸剂注射，通过上皮或粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收来施用预防性或治疗性的组合物，还可以与其它生物活性试剂一起施用。施用可以是系统性的或者局部的。在特定实施方案中，期望将本发明的预防性或治疗性组合物局部施用到需要处理的部位；这可以通过例如，但是不是限制于，局部灌注，通过注射，或者借助植入物来实现，所述植入物是一种多孔、无孔或者凝胶状物质，包括膜，例如sialastic膜或纤维。在还有另一个实施方案中，可以在控制释放或延长释放的系统中呈递预防性或治疗性组合物。在一个实施方案中，可以使用泵来实现控制释放或延长释放(参见Langer，同上文；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.1420；Buchwald等人，1980，Surgery88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一个实施方案中，使用聚合物来实现本发明的预防性或治疗性组合物的控制释放或延长释放(参见，例如MedicalApplicationsofControlledRelease，LangerandWise(编辑)，CRCPres.，BocaRaton，Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability，DrugProductDesignandPerformance，SmolenandBall(编辑)，Wiley，NewYork(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；还可以参见Levy等，1985，Science228190；During等人，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71105)；美国专利5,679,377；美国专利5,916,597；美国专利5,912,015；美国专利5,989,463；美国专利5,128,326；PCT公开WO99/15154；和PCT公开WO99/20253。用于延长释放的制剂中的聚合物的例子包括，但是不限于，聚(异丁烯酸-2-羟基乙基酯)、聚(异丁烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-醋酸乙烯基酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚正酯(polyorthoester)。在优选实施方案中，用于延长释放的制剂中的聚合物是惰性的、不含可以沥去的杂质、在贮存中是稳定的、无菌的和可生物降解的。在还有另一个实施方案中，将控制释放或延长释放的系统置于预防性或治疗性靶点附近，因而仅需要系统性剂量的一部分(参见，例如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease，同上文，第2卷，115-138(1984))。控制释放系统在Langer(1990，Science2491527-1533)的综述中被讨论。任何本领域技术人员已知的技术可以被用于生产包含一种或多种本发明的治疗性组合物的延长释放制剂。参见，例如美国专利4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人，1996，″IntratumoralRadioimmunotheraphyofaHumanColonCancerXenograftUsingaSustained-ReleaseGel，″Radiotherapy&Oncology39179-189，Song等人，1995，″AntibodyMediatedLungTargetingofLong-CirculatingEmulsions，″PDAJournalofPharmaceuticalScience&Technology50372-397，Cleek等人，1997，″BiodegradablePolymericCarriersforabFGFAntibodyforCardiovascularApplication，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854，和Lam等人，1997，″MicroencapsulationofRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyforLocalDelivery，″Proc.Int′l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24759-760，它们中的每一篇在此完全引入作为参考。5.3.3其它治疗性/预防性试剂按照本发明，通过施用多核苷酸的治疗可以结合施用一种或多种治疗，例如但是不限于化学治疗、放射治疗、激素治疗、生物学治疗/免疫治疗、栓塞术和/或化学栓塞术治疗。在特定实施方案中，本发明的方法包括施用一种或多种血管生成抑制剂，例如但是不限于抗血管生成抗凝血酶III；血管酶(Angiozyme)；ABT-627；Bay12-9566；Benefin；Bevacizumab；BMS-275291；软骨来源的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col3；CombretastatinA-4；内抑制素(胶原XVIII片段)；纤连蛋白片段；Gro-beta；Halofuginone；肝素酶；肝素六糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺激素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle5(血浆酶原片段)；Marimastat；金属蛋白酶抑制剂(TEMP)；2-甲氧雌二醇；Nu270(CGS27023A)；MoAbIMC-1C11；Neovastat；NM-3；Panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；血浆酶原活化抑制剂；血小板因子-4(PF4)；Prinomastat；泌乳刺激素16kD片段；多育曲霉素相关蛋白(PRP)；PTK787/ZK222594；类维生素A；Solimastat；Squalamine；SS3304；SU5416；SU6668；SU11248；四氢皮质醇-S；硫酸钼酸盐；thalidomide；血小板反应蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；Vasculostatin；Vasostatin(caireticulin片段)；ZD6126；ZD6474；法呢基转移酶抑制剂(FTI)和磷酸氢盐。在包括本发明的药物组合物和剂量形式和试剂盒的本发明的各种实施方案中，所使用的抗癌试剂的其它例子，包括但是不限于阿雪维菌素(acivicin)；阿拉克霉素(aclarubicin)；acodazolehydrochloride；acronine；阿多来星(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；二霉素(ambomycin)；醋酸双羟胺蒽酮(ametantroneacetate)；氨鲁米特(aminoglutethimide)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；氨茴霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶(asparaginase)；asperlin；阿扎胞苷(azacitidine)；azetepa；含氮霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；benzodepa；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比生群(bisantrenehydrochloride)；bisnafidedimesylate；bizelesin；硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)；布喹那钠(brequinarsodium)；bropirimine；白消安(busulfan)；cactinomycin；calusterone；卡拉酰胺(caracemide)；carbetimer；卡铂(carboplatin)；卡氯芥(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicinhydrochloride)；carzelesin；cedefmgol；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；cirolemycin；顺铂(cisplatin)；克拉屈滨(cladribine)；那托甲磺酸(crisnatolmesylate)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷(cytarabine)；氮烯咪胺(dacarbazine)；放线菌素(dactinomycin)；盐酸道诺霉素(daunorubicinhydrochloride)；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；dezaguanine；dezaguaninemesylate；地吖醌(diaziquone)；多西紫杉醇(docetaxel)；阿霉素(doxorubicin)；盐酸阿霉素；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬(droloxifenecitrate)；dromostanolonepropionate；偶氮霉素(duazomycin)；依达赛特(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflornithinehydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；恩洛铂(enloplatin)；enpromate；epipropidine；盐酸表柔比星(epirubicinhydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸伊柔比星(esorubicinhydrochloride)；雌氮芥(estramustine)；磷酸雌氮芥钠(estramustinephosphatesodium)；依他硝唑(etanidazole)；鬼臼乙叉甙(etoposide)；磷酸鬼臼乙叉甙(etoposidephosphate)；etoprine；盐酸法倔唑(fadrozolehydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；4-N羟基维甲胺(fenretinide)；氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；flurocitabine；磷喹酮(fosquidone)；磷曲星钠(fostriecinsodium)；吉西它滨(gemcitabine)；盐酸吉西它滨；羟基脲(hydroxyurea)；盐酸伊达比星(idarubicinhydrochloride)；异环磷酰胺(ifosfamide)；伊莫复星(ilmofosine)；白介素II(包括重组白介素II，或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；顺式-二氯-反式-二羟基-双-异丙胺合铂(iproplatin)盐酸伊立替康(irinotecanhydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotideacetate)；来曲唑(letrozole)；抑那通(leuprolideacetate)；盐酸利阿唑(liarozolehydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexolsodium)；洛莫司汀(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantronehydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；盐酸二氯甲基二乙胺(mechlorethaminehydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)；醋酸甲孕酮(melengestrolacetate)；美法仑(melphalan)；曼诺加利(menogaril)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；氨甲蝶呤(methotrexate)；氨甲蝶呤钠(methotrexatesodium)；metoprine；美妥替哌(meturedepa)；mitindomide；mitocarcin；mitocromin；mitogillin；丝裂马菌素(mitomalcin)；丝裂菌素(mitomycin)；mitosper；临氯苯对氯苯二乙烷(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)；麦考酚酸(mycophenolicacid)；诺考达唑(nocodazole)；诺加霉素(nogalamycin)；欧玛铂(ormaplatin)；吡酰亚砜(oxisuran)；紫杉醇(paclitaxel)；培门冬酶(pegaspargase)；佩里霉素(peliomycin)；戊莫司汀(pentamustine)；硫酸培普利欧霉素(peplomycinsulfate)；perfosfamide；pipobroman；piposulfan；盐酸吡罗蒽醌(piroxantronehydrochloride)；plicamycin；plomestane；卟吩姆(porfimersodium)；甲基丝裂霉素(porfiromycin)；prednimustine；盐酸甲苄肼(procarbazinehydrochloride)；嘌呤霉素(puromycin)；盐酸嘌呤霉素(puromycinhydrochloride)；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；riboprine；洛替密特(rogletimide)；safingol；safingolhydrochloride；司莫司汀(semustine)；simtrazene；sparfosatesodium；稀硫霉素(sparsomycin)；盐酸螺锗(spirogermaniumhydrochloride)；螺氮芥(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑霉素(streptonigrin)；链脲佐菌素(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；talisomycin；tecogalansodium；替加氟(tegafur)；盐酸替洛蒽酮(teloxantronehydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊甙(teniposide)；特洛西酮(teroxirone)；睾丸内酯(testolactone)；thiamiprine；硫鸟嘌呤(thioguanine)；噻替派(thiotepa)；2-β-D-呋喃核糖基-4-酰胺噻唑(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；柠檬酸托瑞米芬(toremifenecitrate)；trestoloneacetate；triciribinephosphate；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexateglucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸土布洛唑(tubulozolehydrochloride)；尿嘧啶芥子(uracilmustard)；uredepa；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱(vinblastinesulfate)；硫酸长春新碱(vincristinesulfate)；长春碱酰胺(vindesine)；硫酸长春碱酰胺(vindesinesulfate)；vinepidinesulfate；vinglycinatesulfate；vinleurosinesulfate；酒石酸长春瑞宾(vinorelbinetartrate)；vinrosidinesulfate；vinzolidinesulfate；伏氯吐(vorozole)；增尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；盐酸索罗比星(zorubicinhydrochloride)。其它抗癌药物包括，但是不限于20-epi-1，25二羟维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；abiraterone；阿拉克霉素(aclarubicin)；acylfulvene；adecypenol；阿多来星；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀(ambamustine)；amidox；氨磷汀(amifostine)；氨基果糖酸(aminolevulinicacid)；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑；穿心莲内酯(andrographolide)；血管发生抑制剂；抑制剂D；抑制剂G；antarelix；抗背部化形态蛋白-1(anti-dorsalizingmorphogeneticprotein-1)；抗雄激素(antiandrogen)，前列腺癌；抗雌激素(antiestrogen)；抗肿瘤物质(antineoplaston)；反义寡核苷酸；蚜栖菌素甘氨酸盐(aphidicolinglycinate)；凋亡基因调节物(apoptosisgenemodulators)；凋亡调控子(apoptosisregulators)；脱嘌呤酸(apurinicacid)；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀；axinastatin1；axinastatin2；axinastatin3；阿扎西隆(azasetron)；azatoxin；azatyrosine；浆果赤霉素(baccatin)III衍生物；balanol；巴马司他(batimastat)；BCR/ABL拮抗剂；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；白桦脂酸(betulinicacid)；bFGF抑制剂；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群；二吖丙啶精胺(bisaziridinylspermine)；双萘酰亚胺(bisnafide)；比生群A；bizelesin；breflate；bropirimine；二乙氧基双(1-苯基-1，3-丁二酮络)钛(budotitane)；丁胱亚磺酰亚胺(buthionineSulfoximine)；钙泊三醇(calcipotriol)；calphostinC；喜树碱衍生物；canarypoxIL-2；卡培他滨(capecitabine)；羧胺-氨基-三唑；羧胺氨基三唑；CaRestM3；CARN700；软骨来源的抑制剂；carzelesin；干酪素激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺(castanospermine)；天蚕素B(cecropinB)；cetrorelix；chlorlns；磺胺氯喹喔啉(chloroquinoxalinesulfonamide)；cicaprost；顺式-卟啉；克拉屈滨(cladribine)；克罗米酚(clomifene)类似物；克霉唑(clotrimazole)；克里霉素(collismycin)A；克里霉素B；风车子抑碱(combretastatin)A4；风车子抑碱类似物；conagenin；crambescidin816；那托；cryptophycin8；cryptophycinA衍生物；curacinA；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；cytarabineocfosfate；细胞毒素因子；cytostatin；dacliximab；地西他滨(decitabine)；去氢膜海鞘素(dehydrodidemnin)B；deslorelin；地塞米松(dexamethasone)；dexifosfamide；右旋丙亚胺(dexrazoxane)；dexverapamil；diaziquone；膜海鞘素B；didox；二乙基正精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞苷；dihydrotaxol，9-；dioxamycin；联苯螺氮芥(diphenylspiromustine)；多西紫杉醇(docetaxel)；二十二烷醇(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；屈洛昔芬(droloxifene)；dronabinol；duocarmycinSA；ebselen；ecomustine；edelfosine；edrecolomab；二氟甲基鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；emitefur；表柔比星(epirubicin)；爱普列特(epristeride)；雌莫司汀(estramustine)类似物；雌激素激动剂(estrogenagonists)；雌激素拮抗剂；etanidazole；磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)；依西美坦(exemestane)；fadrozole；fazarabine；fenretinide；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；flavopiridol；flezelastine；fluasterone；氟达拉滨(fludarabine)；fluorodaunorunicinhydrochloride；forfenimex；福美坦(formestane)；fostriecin；福莫司汀(fotemustine)；替沙林钆(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸镓(galliumnitrate)；galocitabine；ganirelix；明胶酶抑制剂；吉西他滨(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基二乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)；金丝桃素(hypericin)；ibandronicacid；伊达比星(idarubicin)；吲哚昔酚(idoxifene)；idramantone；ilmofosine；ilomastat；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特(imiquimod)；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；iobenguane；吲哚阿霉素(iododoxorubicin)；依波米醇(ipomeanol)，4-；iroplact；伊索拉(irsogladine)；异孟加唑(isobengazole)；isohomohalicondrinB；itasetron；jasplakinolide；kahalalideF；lamellarin-Ntriacetate；兰瑞肽(lanreotide)；leinamycin；雷诺格拉斯蒂姆(lenograstim)；硫酸蘑菇多糖(lentinansulfate)；leptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林(leuprolide)+雌激素+孕酮；抑那通(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide7；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；lometrexol；lonidamine；losoxantrone；洛伐他汀(lovastatin)；loxoribine；lurtotecan；lutetiumtexaphyrin；lysofylline；细胞溶解肽(lyticpeptide)；maitansine；mannostatinA；marimastat；马丙考(masoprocol)；maspin；基质溶素(matrilysin)抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；menogaril；merbarone；meterelin；甲硫氨酸酶；灭吐灵(metoclopramide)；MIF抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；mirimostim；错配的双链RNA；异靛甲(mitoguazone)；mitolactol；丝裂菌素类似物；mitonafide；mitotoxin成纤维细胞生长因子-saporin；氟达拉滨(fludarabine)；mofarotene；莫拉司亭(molgramostim)；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺生长激素；单磷酸类脂A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇(mopidamol)；多重药物抗性基因抑制剂；基于多重肿瘤抑制物1的治疗；芥子抗癌剂；mycaperoxideB；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林(nafarelin)；nagrestip；纳洛酮(naloxone)+戊唑辛(pentazocine)；napavin；naphterpin；nartograstim；奈达铂(nedaplatin)；nemorubicin；奈立膦酸(neridronicacid)；中性肽链内切酶(endopeptidase)；尼他胺(nilutamide)；nisamycin；氧化一氮调节物；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；06-苯基鸟嘌呤；奥曲肽(octreotide)；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；恩丹西酮(ondansetron)；恩丹西酮(ondansetron)；oracin；口腔细胞因子诱导物；欧玛铂(ormaplatin)；osaterone；奥沙利铂(oxaliplatin)；oxaunomycin；紫杉醇(paclitaxel)；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸(pamidronicacid)；人参炔三醇(panaxytriol)；panomifene；parabactin；pazelliptine；培门冬酰胺酶(pegaspargase)；peldesine；戊聚糖多硫酸纳(pentosanpolysulfatesodium)；喷司他丁(pentostatin)；pentrozole；全氟碳(perflubron)；perfosfamide；紫苏醇(perillylalcohol)；phenazinomycin；乙酸苯酯(phenylacetate)；磷酸酶抑制剂；溶血性结核菌素(picibanil)；盐酸匹鲁卡品(pilocarpinehydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；哌利特森(piritrexim)；placetinA；placetinB；血浆酶原激活抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；光卟啉钠(porfimersodium)；甲基丝裂霉素；强的松(prednisone)；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；蛋白A免疫调节戊；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，microalgal；蛋白磷酸酪氨酸抑制剂；嘌呤核苷酸磷酸化酶抑制剂；羟基茜草素(purpurin)；pyrazoloacridine；吡哆氧化血色素多聚氧乙烯偶联物(pyridoxylatedhemoglobinpolyoxyethyleneconjugate)；raf拮抗剂；raltitrexed；雷莫司琼(ramosetron)；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；去甲基化retelliptine；铼Re186依替膦酸钠(etidronate)；rhizoxin；核糖酶(ribozymes)；RII酰胺；洛替密特(rogletimide)；rohitukine；罗莫肽(romurtide)；roquinimex；rubiginoneB1；ruboxyl；safingol；saintopin；SarCNU；肉芝软珊瑚醇(sarcophytol)A；sargramostim；Sdi1模拟物；司莫司汀(semustine)；老化来源的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号传导抑制剂；信号传导调节物；单链抗原结合蛋白；sizofiran；索布佐生(sobuzoxane)；sodiumborocaptate；苯基乙酸钠；solverol；生长调节素(somatomedin)结合蛋白；sonermin；sparfosicacid；spicamycinD；spiromustine；splenopentin；spongistatin1；角鲨胺(squalamine)；干细胞抑制剂；干细胞分化抑制剂；stipiamide；基质分解素(stromelysin)抑制剂；sulfinosine；超活性的血管活性的肠道肽拮抗剂；suradista；苏拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；合成的粘多糖；tallimustine；甲碘他莫西芬(tamoxifenmethiodide)；牛磺莫司江(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；tecogalansodium；替加氟(tegafur)；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替莫唑胺(temozolomide)；替尼泊甙(teniposide)；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；厚果唐松草碱(thaliblastine)；thiocoraline；血小板生成素(thrombopoietin)；血小板生成素模拟物；thymalfasin；促胸腺生成素(thymopoietin)受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；甲状腺刺激素；乙基锡初紫红素(tinethyletiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；茂钛烯二氯化物(titanocenebichloride)；托普西汀(topsentin)；托瑞米芬(toremifene)；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸(tretinoin)；三乙酰尿苷(triacetyluridine)；triciribine；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；turosteride；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostins；UBC抑制剂；百士欣(ubenimex)；泌尿生殖腔来源的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；奥曲肽(vapreotide)；variolinB；载体系统，红血球基因治疗；velaresol；veramine；verdins；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；vinxaltine；vitaxin；伏氯吐(vorozole)；zanoterone；zeniplatin；zilascorb；和净司他丁刺激物(zinostatinstimalamer)。优选的其它抗癌药物为5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。这两种试剂在使用沙利度胺(thalidomide)和拓扑异构酶抑制剂的方法中是特别有用的。可用于本发明的方法中的其它抗癌试剂包括，用于治疗、控制和预防致瘤性疾病的草药、草药提取物或者中药。这些方案可以与本发明的载体组合用于癌症治疗。5.3.4基因治疗本发明提供用于治疗或预防癌症和肿瘤的方法，包括施用本发明的编码血管抑制素或B7.1的核酸分子。在特定的实施方案中，通过基因治疗，施用包含编码血管抑制素或B7.1的序列的核酸分子来治疗或预防癌症。基因治疗是指通过将被表达或可表达的核酸施用给受治疗者而实施的治疗。在本发明的实施方案中，核酸分子产生调节预防性或治疗性作用的编码蛋白。按照本发明，可以使用本领域可获得的任何用于基因治疗的方法。示例性的方法将在下文中被描述。对于基因治疗方法的总体回顾，参见Goldspiel等人，1993，ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11(5)155-215)。可以使用的DNA重组
技术领域：
通常所知的方法被描述在Ausubel等人(编辑)，1993，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，GeneTransferandExpression，ALaboratoryManual，StocktonPress，NY中。在一个方面中，将包含本发明的核酸分子的组合物施用给合适的宿主，该核酸分子在表达载体中含有编码血管抑制素或B7.1的核酸序列。编码血管抑制素或B7.1的核酸序列的表达可以由本领域技术人员知晓的任何可诱导的、组成型的或组织特异性的启动子来调控。在特定实施方案中，被导入用于基因治疗的核酸包含被可操作地连接到编码区上的可诱导启动子，使得核酸表达可以通过控制适当的转录诱导物的存在或缺失来调控。在特定的实施方案中，编码血管抑制素或B7.1的核酸分子与在基因组的期望位点上促进同源重组的区域侧面连接，从而导致在染色体内表达所述编码区(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature342435-438)。将核酸呈递给患者可以是直接的，在这种情况下，患者被直接暴露于核酸分子或者携带核酸分子的载体，或者是间接的，在这种情况下，首先在体外用核酸分子转化细胞，然后将细胞移植给患者。这两种方法分别被称作为体内的或离体的基因治疗。在特定的实施方案中，直接体内施用核酸分子，核酸分子被表达产生编码产物。这可以通过本领域知晓的大量方法中的任何一种来实现，例如，通过将它们构建成为适当的核酸表达载体的一部分，施用载体使它们进入细胞内，例如通过用缺陷型或减毒的逆转录病毒或其它病毒性载体进行感染(参见美国专利4,980,286)，或者通过直接注射裸DNA或者通过使用微粒轰击(例如，基因枪Biolistic，Dupont)，或者用脂质或者细胞表面受体或转染试剂包被，封装在脂质体、微粒或者微胶囊中，或者将它们与已知会进入细胞核的肽相连来施用，或者将它们与会发生受体介导的细胞内吞的配体相连来施用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)(这可以用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，形成核酸-配体复合物，其中配体包含融合基因病毒性肽，以破坏内涵体，使核酸分子免受溶酶体的降解。在还有另一个实施方案中，通过靶向特定受体，在体内将核酸分子靶向特定的细胞摄取和表达(参见例如，1992年4月16日申请的PCT公开WO92/06180(Wu等人)；1992年12月23日申请的WO92/22635(Wilson等人)；1992年11月26日申请的WO92/20316(Findeis等人)；1993年7月22日申请的WO93/14188(Clarke等人)，1993年10月14日申请的WO93/20221(Young))。可替代地，将核酸分子导入细胞内，通过同源重组与宿主细胞DNA结合来表达(KollerandSmithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature342435-438)。在特定实施方案中，用病毒性载体来表达核酸序列。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。这些逆转录载体删除了不是病毒基因组的包装所必需的逆转录病毒序列，并且整合到宿主细胞DNA中。用于基因治疗中的编码核酸序列的核酸分子被克隆到一个或多个载体中，以便将基因呈递到患者中。对逆转录病毒载体的更加详细的描述可见Boesen等人，1994，Biotherapy6291-302，其中描述了使用逆转录病毒载体来将mdrl基因呈递到造血干细胞中，使干细胞对化学治疗有更高的抵抗性。阐述逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其它参考文献是Clowes等人，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kiem等人，1994，Blood831467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，HumanGeneTherapy4129-141；以及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3110-114。腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒性载体。对于将基因呈递到呼吸道上皮细胞中来说，腺病毒是特别有吸引力的载体。腺病毒天然地感染呼吸道上皮细胞，引起轻微的疾病。腺病毒呈递系统的其它靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有优点，能够感染未分化的细胞。Kozarsky和Wilson，1993，CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3499-503中综述了腺病毒基因治疗。Bout等人，1994，HumanGeneTherapy53-10证明了，使用腺病毒载体可将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮细胞中。在基因治疗中使用腺病毒的其它例子可参见Rosenfeld等人，1991，Science252431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell68143-155；Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91225-234；PCT公开WO94/12649；以及Wang，等人，1995，GeneTherapy2775-783。在优选实施方案中，使用腺病毒载体。腺伴随病毒(AAV)也被建议用于基因治疗(Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美国专利5,436,146)。用于本发明的最优选的病毒载体为腺伴随病毒(AAV)载体。AAV载体会引起在肠道上皮细胞和肝细胞中持续(＞6个月)表达转基因，导致在糖尿病动物模型中的长期表型恢复(Xu，RA等人，2001，Perarollytransductionofdiffusecellsandhepatocyteinsulinleadingtoeuglycemiaindiabeticrats，MolTher3S180；During，MJ等人，1998，Perarollygenetherapyoflactoseintoleranceusinganadeno-associatedvirusvector，NatureMed.41131-1135；DuringMJ等人，2000，AnoralvaccineagainstNMDAR1withefficacyinexperimentalstrokeandepilepsy，Science2871453-1460)。AAV是细小病毒家族的一种非致病性的、依赖于辅助病毒的成员，具有几个主要优点，例如稳定整合、低免疫原性、长期表达，并且能够感染分化的和未分化的细胞。其能够在大部分末期分化的组织内引导长期的转基因表达，而不会对宿主产生毒性，并且也不会对转导细胞产生细胞免疫反应(PonnazhaganS等人，2001，Adeno-associatedvirusforCancerGeneTherapy，CancerRes616313-6321；LaiCC等人，2001，Suppressionofchoroidalneovascularizationbyadeno-associatedvirusvectorexpressingangiostatin，InvestOphthalmolVisSci42(10)2401-7；NguyenJT等人，1998，Adeno-associatedvirusmediateddeliveryofantiangiogenicfactorsasanantitumorstrategy，CancerResearch585673-7)。另一种基因治疗方法包括通过点穿孔、脂感染、磷酸钙介导的转染或者病毒感染这样的方法将基因转移到组织培养的细胞中。通常，转移方法包括将可选择的标记转移到细胞中。然后将细胞置于选择条件下来分离那些已经摄取并且正在表达转移基因的细胞。然后将那些细胞呈递给患者。在一个实施方案中，在体内施用得到的重组细胞之前，将核酸导入细胞中。这种导入可以通过本领域知晓的任何方法来实施，包括，但是不限于转染、电穿孔、微注射、用含有核酸序列的病毒载体或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原始质球融合等。许多用于将外源基因导入细胞的技术在本领域是已知的(参见，例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen等人，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，并且可以被用于本发明中，只要不破坏受体细胞的必要的发育功能和生理功能。该技术应该能够将核酸分子稳定地转移到细胞中，使得包含核酸序列的核酸分子可以由细胞表达，并且优选是可遗传的和可以被其子代细胞表达。可以通过本领域已知的各种方法将生成的重组细胞呈递给患者。优选静脉内施用重组的血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。预期所用的细胞的含量取决于期望的效果、患者状态等，可以由本领域技术人员确定。导入核酸用于基因治疗目的的细胞包括任何期望的、可获得的细胞类型，包括但是不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等获得。在优选实施方案中，用于基因治疗的细胞与患者是自体同源的。在一个实施方案中，重组细胞被用于基因治疗，将编码血管抑制素或B7.1的本发明的核酸序列导入细胞中，使得这些细胞或其子代可以表达这些序列，然后体内施用重组细胞以达到治疗作用。在特定实施方案中，使用干细胞或祖细胞。任何可以在体外分离和维持的干细胞和/或祖细胞都有可能被用于本发明的实施方案中(参见例如1994年4月28日申请的PCT公开WO94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell71973-985；Rheinwald，1980，Meth.CellBio.21A229；以及Pittelkow和Scott，1986，MayoClinicProc.61771)。5.4治疗性/预防性用途的证明在人类中使用之前，优选在体外测试本发明的组合物，然后体内检测期望的治疗或预防活性。例如，论证组合物的治疗性或预防性用途的体外分析包括，组合物对细胞系的作用，特别是对特定癌症类型的一个探针或者患者组织样本的作用。组合物对细胞系组织样本的作用可以采用本领域技术人员知晓的技术来确定，包括，但是不限于玫瑰花形成分析和细胞溶解分析。特别地，肝癌细胞系、乳腺癌细胞系，例如MDA-MB-231，淋巴瘤细胞系，例如U937，和大肠癌细胞系，例如RKO，可以被用于评价编码血管抑制素或B7.1蛋白的多核苷酸的作用。本领域技术人员知晓的技术可以被用于测量细胞活性。例如，可以通过3H-胸苷掺入分析和台盼兰细胞计数来评价细胞增殖。作为检测本发明的治疗剂的治疗性或预防性活性的特定例子，可以采用鸡尿囊绒毛膜(CAM)分析。这是血管抑制素活性的次级的和独立的分析。将该一日龄受精卵在水夹层培养箱(38℃，85％湿度)中培养3天。敲碎鸡蛋，将具有完整卵黄的鸡胚置于含有10mlRPMI-1640培养基的塑料培养皿中(38℃，85％湿度，3％CO2)。培养3天后，将含有抑制剂的甲基纤维素盘置于各个鸡胚的CAM上。在培养48小时后，分析各个鸡胚的CAM上的无血管条带的形成，并拍照。以甲基纤维素盘(各个浓度为3-5个鸡蛋)内的血管区域相对于未处理的血管区域的百分比来确定血管抑制素的抑制血管作用。在另一个特定的实施方案中，可以通过计数来自用治疗剂处理的受治疗者的组织样本的血管数量来评价本发明的治疗剂的抑制肿瘤血管化作用，将这些组织样本用抗内皮细胞的特定抗体(例如抗-CD31抗体)染色，并与对照组织样本比较。在还有另一个特定的例子中，本发明的治疗剂的表达可以通过用特定探针进行原位杂交或者通过Western印迹或用特定抗体进行免疫组织化学染色来检测。在还有另一个特定的实施方案中，本治疗剂的治疗性的或预防性的活性可以通过计数用TUNEL染色方法处理的组织样本中的凋亡细胞的数量来评价(HenseyC等人，1998，ProgramcelldeathduringXenopusdevelopmentaspatio-temporalanalysis，DevBiol20336-48；Veenstra，GJ等人，1998，Non-cellautonomousinductionofapoptosisandlossofposteriorstructuresbyactivationdomain-specificinteractionsofOct-1intheXenopusembryo，CellDeathDiffer5774-84)并与对照样本的细胞数量比较。可以检测测试组合物在降低患有癌症的患者(例如动物)的肿瘤形成的能力。还可以检测测试组合物减轻一种或多种与癌症伴随的症状的能力。此外，可以检测测试组合物延长患有癌症的患者的存活期的能力。本领域技术人员知晓的技术可以被用于分析检测测试组合物在患者中的功能。在本发明的各种实施方案中，可以用于确定特定的组合物的施用是否是需要的体外分析包括体外细胞培养分析，其中将患者组织样本在培养基中生长，并暴露于或者另外地被施用一种组合物，并观察这种组合物对组织样本的作用。特别地，所表达的蛋白的细胞毒性作用可以通过Promega细胞滴度96水溶性细胞增殖分析和分子探针存活/死亡细胞毒性试剂盒来评价。在人类中进行检测之前，可以在合适的动物模型系统中检测用于治疗中的组合物，包括但是不限于大鼠、小鼠、鸡、奶牛、猴、兔等。对于体内分析，在施用给人之前，可以使用本领域知晓的任何动物模型系统。本发明还提供一种药物包裹或者药物试剂盒，包含一个或多个填装了本发明的药物组合物的一种或多种成分的容器。任选地与这种容器相随的是管理生产商的政府部门规定的形式的告示、药物或生物产品的使用或销售，该告示反映了管理部门对制造、使用或销售用于人施用的批准。本发明还提供可以用于上述方法中的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含核酸分子。在特定的实施方案中，本发明的试剂盒含有用于治疗、预防癌症、病毒性感染或微生物感染的核酸分子的使用说明书。本发明通过参考详细描述临床试验的如下实施例来进一步详细说明，进行这些临床试验是研究本发明的三氧化砷组合物的功效和安全性。如下的实施例阐明本发明的AAV-血管抑制素载体A和AV-B7.1载体的制备和用途。这些实施例不应被解释为限制性的。6.实施例16.1rAAV-血管抑制素的制备在表达质粒载体中，鸡β-肌动蛋白启动子与巨细胞病毒(CMV)增强子(CAG启动子)(XuL.等人，CMV-beta-actinpromoterdirectshigherexpressionfromanadeno-associatedviralvectorintheliverthanthecytomegalovirusorelongationfactor1alphapromoterandresultsintherapeuticlevelsofhumanfactorXinmice.HumGeneTher.2001；12(5)563-7)、报道基因、由信号肽和第一个四个小鼠血浆酶原的kringle区的1.4-kb编码全长小鼠血管抑制素的cDNA(SEQIDNO1)和polyA序列被使用适当的限制性酶插入到反向末端重复(ITR)之间(参见附图2)。将旱獭乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)插入到该构建体中来增强表达水平(DonelloJ.等人，Woodchuckhepatitisviruscontainsatripartitepost-transcriptionalregulatoryelement.JVirol.1998；725085-5092；XuR.A.等人.Quantitativecomparisonofexpressionwithadeno-associatedvirus(AAV-2)brain-specificgenecassettes.GeneTher.2001；81323-1332)。用Qiagen质粒纯化试剂盒来制备质粒。通过含有一些修饰的三个质粒、无辅助病毒的包装方法来制备AAV颗粒(DonelloJ.等人.1998，同上文；XiaoW.等人，RouteofadministrationdeterminesinductionofTcellindependenthumoralresponsetoadeno-associatedvirusvectors.Molaxer.2000；1(4)323-9)。采用磷酸钙沉淀方法，用rAAV-血管抑制素和辅助病毒pFd、H22转染293细胞。在转染后70小时后收集细胞，并通过在存在50单位/mlBenzonase(Sigma，St.Louis，MO)时，在37℃下用0.5％脱氧胆酸酯培养来溶解。在以5000g离心后，用0.45-μmAcrodisc注射器滤膜过滤细胞，来去除任何颗粒的细胞物质，用于肝素洗脱柱。通过略加改进的亲合层析来分离rAAV颗粒。用100mMNaCl、1mMMgCl2和20mM磷酸氢钠和磷酸二氢钠缓冲液，pH7.4透析峰值的病毒馏分。用ABAppliedBiosystem对部分样本进行定量PCR分析，以量化基因组的滴度。PCRTaqMan分析是点印迹方案，连续稀释AAV并用DNA酶I和蛋白激酶K进行消化。用苯酚-氯仿提取病毒DNA两次来去除蛋白质，然后用2.5倍等体积的乙醇进行沉淀。在102到107的拷贝范围内建立标准扩增曲线，并获得对应于各个起始模板拷贝数的扩增曲线。通过商业上可获得的分析试剂盒(Progen，Germany)来再次确认病毒颗粒。在进行动物试验之前，将病毒载体贮存在-80℃下。6.2小鼠中的AAV-介导的抗血管生成的基因治疗6.2.1小鼠、细胞系和抗体6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠(H-2b)从香港大学的试验动物单位获得。同源的(H-2b)EL-4胸腺淋巴瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD，USA)。将细胞培养在37℃下的DMEM培养基(GibcoBRL，GrandIsland，NY)中，该培养基中添加了10％胎牛血清、50U/ml青霉素/链霉素、2mML-谷氨酸和1mM丙酮酸。抗血浆酶原mAb、兔多克隆抗VEGF抗体和抗CD31抗体MEC13.3分别购自Calbiochem-NovabiochemCorporation、LabVisionCorporation和Pharmingen(CA，USA)。6.2.2试验方案所有施加给动物的手术操作和护理都遵照规定的方针。随机地处理动物。每一组含有10只小鼠。结节和分散的肿瘤模型一致地在至少90-95％动物中形成了肿瘤。等体积的PBS和等颗粒数量的空AAV病毒或含有报道基因的AAV病毒载体作为对照。6.2.2.1肝脏结节肿瘤的诱导在麻醉小鼠后，通过手术暴露肝脏，用针头或者通过门静脉将肿瘤细胞注射到肝被膜下的肝脏的左叶中。一周后，通过门静脉注射3×1011rAAV-血管抑制素病毒颗粒。进行止血，封闭腹腔。手术后5周，处死小鼠，切除肝脏左叶的肿瘤，用测径器在两个垂直直径上进行测量(分别为a和b)。按照公式(a×b×2π)/6计算肿瘤体积，如先前所描述(AuerbachR.等人.Regionaldifferencesintheincidenceandgrowthofmousetumorsfollowingintradermalorsubcutaneousinoculation.CancerRes.1978；381739-1744)。6.2.2.2分散的肝脏转移性肿瘤的诱导在麻醉小鼠后，通过手术暴露脾脏，并且在分离短胃血管和胃与脾脏的韧带后，完整地将脾脏取出。首先，用30-G针头将2×105EL4肿瘤细胞缓慢地注射到脾脏中。在延迟大约5分钟以使肿瘤细胞进入门静脉循环后，在结扎脾脏梗茎后，实施脾脏切除手术。其次，通过门静脉注射3×1011rAAV-血管抑制素病毒颗粒。进行止血，并封闭腹腔。手术后6周，处死小鼠并切除肝脏。然后冷冻和低温保存肝脏来制备10μm的切片，在5个不同水平面上制备切片来覆盖整个肝脏。封固切片，并用苏木精和伊红进行染色。在显微镜下用西格玛软件程序测量和检查整个肝脏和肿瘤面积。按照公式计算肿瘤所占的相对面积(总肿瘤面积/肝脏面积)×100。6.2.2.3存活力研究如分散的肝脏转移那样，通过脾脏内注射1×106EL-4肿瘤细胞，接着门静脉内注射3×1011AAV-血管抑制素颗粒来生成肿瘤模型。每周对动物称重3次，并进行评价。按照预先建立的标准无痛致死垂死的小鼠；即存在两个或多个如下的premoid症状总腹水、可触知的大于2cm的肿瘤负担、脱水、萎靡、瘦弱和体重下降超过起始体重的20％。6.3.免疫组织分析在门静脉AAV灌注后，将由肝脏或肿瘤制备的冰冻切片(10μm)与特定抗体一起培养过夜。随后，用适当的第二抗体(VECTASTAINOUniversalQuickkit，VectorLaboratories，Burlingame，CA)培养切片30分钟，并用SigmaFASTDAB(3，3′-二氨基对二氨基联苯四盐酸盐)和CoCl2增强药片(Sigma，St.Louis，MO)显影。然后用Mayer苏木精复染。6.4.原位杂交在4％甲醛中固定肝脏切片7分钟，并在PBS中洗涤3分钟，在2xSSC中洗涤10分钟。按照原位杂交方案(Ambion，Austin)，将脱水的切片在60℃下与探针溶液杂交过夜。用4xSSC洗涤切片，并在RNA酶消化溶液中、37℃下培养30分钟。然后用浓度逐渐降低的SSC，在室温下以5分钟的间隔缓慢搅拌来洗涤切片。然后用浓度逐渐升高的乙醇使切片脱水。通过试剂盒VECTASTAINXABC(VectorLaboratories，Burlingame，CA)和BCIP/NBT检测杂交。6.5Western印迹处理后，切除样本，敲碎，并在蛋白质溶解缓冲液中进行匀浆。通过在4℃下，以10,000g离心10分钟来去除组织或细胞碎片。汇集来自每个组小鼠的肿瘤溶解产物，确定蛋白质含量。将蛋白质样本(100mg)溶解在10％聚丙烯酰胺SDS凝胶中，并电泳转移到硝化纤维HybondTMC外膜上(AmershamLifeScience，England)。在用5％BSA封闭膜后，用特定的第一抗体培养斑点，接着与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体一起培养，通过增强的化学发光来显影(AmershamInternationalplc，England)，并暴露于X射线膜上。用SigmaScanPro软件量化条带浓度。6.6血管化的评价确定肿瘤血管化的方法先前已经被描述(SunX.等人，AngiostatinenhancesB7.1-mediatedcancerimmunotherapyindependentlyofeffectsonvascularendothelialgrowthfactorexpression.CancerGeneTherapy2001；8719-727)。简而言之，如先前描述的，将用处理后4周的肝脏结节肿瘤制备的10mm肿瘤切片用抗CD31抗体免疫染色。在放大40倍的任意选择的5个随机区域(0.155mm2)中计数染色的血管，计算最大的三个值的平均数。同心圆方法(HeatherE.R.等人，HIF-laisrequiredforsolidtumorformationandembryonicvascularization.EMBOJ.1998；173005-3015；Kayar等人.Evaluationoftheconcentric-circlesmethodforestimatingcapillary-tissuediffusiondistances，MicrovascularRes.1982；24342-353)也被用于评价血管化。6.7凋亡细胞的原位检测在处理后的4周后，从肿瘤中制备6mm厚度的连续切片。用购自RocheMolecularBiochemicals，Germany的原位细胞死亡检测试剂盒进行切片的TUNEL染色。简而言之，将冷冻切片用4％的甲醛溶液固定，用0.1％Triton-X100和0.1％柠檬酸钠的溶液进行透化处理，在37℃下用TUNEL试剂培养60min，并通过荧光显微镜进行检测。相邻的切片用苏木精和伊红进行反染色。计数10个随机选择的区域中的凋亡细胞的总数。以阳性染色细胞(即，凋亡细胞)的比例计算凋亡指数；即AI＝(凋亡细胞数量/有核细胞的总数)×100。6.8统计分析对于肿瘤占据的肿瘤体积和相对面积，进行Kruskal-Wallis测试来检测治疗作用。对于存活力数据，进行对数排列测试来检测治疗作用。对于其它数据，结果表示为平均值±标准偏差(s.d.)，和用Student检验来评价统计显著性。当P小于0.05时，被认为是统计显著的。6.9结果6.9.1在门静脉灌注rAAV-血管抑制素后，血管抑制素在肝脏中长期而持续地表达rAAV的主要优点之一是它能够介导长期的转基因表达。通过门静脉注射重组rAAV-血管抑制素载体成功地阻止肝脏中外源基因的长期表达最高达到6个月。为了分析基因转移的效率，在门静脉注射rAAV-血管抑制素后的2天、14天、28天、60天、90天和180天收集肝脏样本。通过免疫组织化学、原位杂交和western印迹来证实肝脏中的血管抑制素的表达。如附图3所示，在基因转移后的14天，已经可以明显地检测到血管抑制素的原位过度表达(附图3B)，并在基因转移后持续180天(附图3C)，相比之下，用空AAV(A)处理的对照的情况仅持续2天的表达。由于血管抑制素是血浆酶原的一个片段，是一种内源性蛋白，并且可以被抗血管抑制素Ab检测到，该结果还可以通过用DIGRNA标记试剂盒进行原位杂交来进一步证实(图3D、3E和3F，分别对应于图3A、3B和3C的肝脏切片)。本发明人先前已经报道了，经过口内施用AAV-胰岛素载体会导致肝细胞中的转基因胰岛素在3个月内逐渐升高，此后达到一个稳定水平(Xu，RA，等人，2001，同上文；During等人，2000，同上文)。在通过门静脉内灌注AAV-血管抑制素的情况下，肝细胞中转基因血管抑制素的表达在一个月内达到高水平，在两个月内升高到峰值水平，然后稳定6个月。样本是来自在AAV-血管抑制素灌注后2天(条带1)、14天(条带2)、28天(条带3)、60天(条带4)、90天(条带5)或180天(条带6)切除肝脏的小鼠(参见图4)。6.9.2对肝转移性结节肿瘤和分散性肿瘤的抑制为了分析门静脉内注射rAAV-血管抑制素在对结节肝脏肿瘤方面的治疗潜力，将EL-4肿瘤细胞注射到30只小鼠的肝脏的左叶中，然后，让每只小鼠随机接受门静脉内注射PBS(n＝10)、空AAV(n＝10)或者rAAV-血管抑制素病毒(n＝10)。4周后，对所有小鼠实施肝脏切除手术。各个组中的肝脏肿瘤的体积被显示在图5A中。在接受PBS和空AAV的处理组中，左叶肿瘤的平均体积分别为149.2mm2和127.5mm2。这两组之间的细微差别不具有统计显著性(P＞0.05)。相反，在用AAV-血管抑制素处理的组中左叶肿瘤的平均体积仅为40.3mm2，其相对于用PBS和空AAV处理的组的肿瘤体积分别下降了72％和68％。该结果显著区别于用PBS(P＜0.001)或空AAV(P＜0.01)处理的情况。为了分析门静脉内注射rAAV-血管抑制素对分散的肝脏转移性肿瘤的治疗潜力，将EL-4肿瘤细胞注射到小鼠的脾脏中(n＝30)，并实施脾脏切除手术。然后，随机对小鼠门静脉内注射PBS(n＝10)、空AAV(n＝10)或rAAV-血管抑制素病毒(n＝10)。6周后，处死小鼠并取出肝脏。以横切方式冷冻保存肝脏。肿瘤在肝脏中所占据的面积图示在图5B中。在PBS、空AAV和rAAV-血管抑制素组中，肿瘤在肝脏中所占据的平均相对面积分别为26.5％、24.0％和7.3％。在PBS和空AAV处理组之间没有显著性差别(P＞0.05)。但是，与PBS和AAV处理组相比，rAAV-血管抑制素处理导致肿瘤所占据的相对面积分别下降了72％和71％，说明在rAAV-血管抑制素处理组和任何对照组之间存在统计学上的显著性差别(各个P＜0.001)。6.9.3rAAV-血管抑制素提高具有肝脏肿瘤转移的小鼠的存活率进一步研究用AAV-血管抑制素处理的具有肝脏肿瘤转移的小鼠的存活率，以探讨这种处理是否会对小鼠产生存活益处。虽然肝内模型能够精确地测量肿瘤的大小，而脾内模型更加接近地模拟临床状态，导致通过门静脉系统的多发性肝脏肿瘤转移，并且可更好地通过存活率来评价。给30只C57BL小鼠脾脏内注射1×106EL-4肿瘤细胞，然后接受门静脉内注射3×1011rAAV-血管抑制素颗粒(n＝10)、PBS(n＝10)或空AAV(n＝10)，后两种作为对照。用AAV-血管抑制素处理会导致对用肿瘤细胞进行脾脏攻击的小鼠的存活产生深刻和统计学上的显著性改善。在肿瘤细胞接种后，该组中的10只小鼠中的4只存活超过了80天，而PBS和空AAV处理组中所有小鼠都死亡。用PBA处理的小鼠的中值存活时间为25天，而用空AAV处理的小鼠的中值存活时间为29天。这两个组之间没有显著性差别(P＞0.1)。但是，用AAV-血管抑制素处理的小鼠的中值存活时间为58天，这分别显著地区别于PBS处理组和空AAV处理组的存活时间(各个P＜0.01)(参见图5C)。6.9.4对不依赖于内皮血管生长因子的肿瘤血管化的抑制通过门静脉灌注AAV-血管抑制素会导致对肝脏结节转移性肿瘤的血管化的抑制。在注射rAAV-血管抑制素后4周后，去除在肝脏左叶中建立的结节肿瘤，冷冻切成10μm的切片，并用抗CD31抗体染色。来自用PBS(A)、空AAV(B)和AAV-血管抑制素(C)处理的小鼠的示例性图片显示在图6中。rAAV-血管抑制素治疗导致肿瘤血管密度的显著下降，即分别为用PBS和空AAV处理的肿瘤血管的约40％(各个P＜0.01)；而在用PBS和空AAV处理的肿瘤之间没有显著性差别(P＞0.05)(图7A)。此外，在用rAAV-血管抑制素处理的肿瘤中，从一列点到最近的用抗CD31Ab标记的点之间的中值距离显著地大于在用PBS或空AAV处理的肿瘤中观察到的中值距离(各个P＜0.01)(图7B)。尽管进行了深入研究，但是，血管抑制素的抗血管生成活性的机制仍然大部分是未知的。一些研究已经表明血管抑制素能够下调血管内皮生长因子的表达(KirschM.等人，1998，同上文；JoeY.A.等人，1999，同上文)。在本研究中，rAAV-血管抑制素对VEGF的表达没有显著的影响，并且该结果与先前的研究一致(Sun等人，2001，同上文)。但是，用VEGF特异性抗体通过Western印迹检测的肿瘤VEGF表达表明，在用rAAV-血管抑制素处理后，VEGF的表达稍有增加(图7C)。这可能是由于通过血管抑制素诱导的抗血管生成，使得环境中的肿瘤缺氧加强，这可能导致通过组织缺氧诱导因子路径上调VEGF的表达，组织缺氧诱导因子是VEGF转录因子。类似地，Ding等人(IntratumoraladministrationofendostatinplasmidinhibitsvasculargrowthandperfusioninMca-4mammarycarcinomas，CancerRes.2001；61526-531)报道，在肿瘤内施用内抑制素引起VEGF和VEGF受体mRNA的原位转录的补偿性增加。6.9.5rAAV-血管抑制素增加肿瘤细胞的凋亡但是不增加肝细胞的凋亡由于肿瘤能够耐受营养素和氧气的饥饿，作为rAAV-血管抑制素处理的结果，防止大量的血管网络的形成，采用TUNEL方法通过片段DNA原位标记进行试验来检查如此处理的肿瘤是否发生程序性死亡。在用PBS或空AAV处理的肿瘤中检测到少量的凋亡细胞(图8A和8B)，而在rAAV-血管抑制素处理后，凋亡细胞的数量翻倍(附图8C)。rAAV-血管抑制素处理组的凋亡指数(AI)分别显著地高于用PBS(P＜0.001)和空AAV(P＜0.05)处理的组的凋亡指数(附图9)。在用PBS和rAAV处理的组之间没有显著性差别。此外，如图8A-8C中所示，几乎所有的凋亡细胞都是肿瘤细胞，而极少的肝细胞凋亡，表明rAAV-血管抑制素的凋亡作用是高度的肿瘤细胞选择性的，而不作用于正常的肝脏细胞。对正常的肝脏细胞不具有毒性显然对于rAAV-血管抑制素在治疗肝癌的临床中应用是有利的。6.10讨论6.10.1rAAV介导的抗血管生成的治疗比其它治疗策略更有利定位的门静脉呈递rAAV表达载体到肝脏中，导致在肝脏细胞中持续过度表达外源性血管生成抑制剂-血管抑制素最多达6个月，并且抑制恶性肝脏转移性肿瘤的生长。肿瘤的生长和转移依赖于被称作为肿瘤血管生成的过程对功能性血液供应的补充，并且实际上，“血管生成表型”与许多人类固体肿瘤中的预后成负相关(FolkmanJ.Tumorangiogenesistherapeuticimplications.NEnglJMed.1971；171-14)。迄今设计的抗血管生成治疗靶向了血管生成过程的不同步骤，范围从通过过度表达抗血管生成因子来抑制血管生成分子的表达，到用内源性血管生成抑制剂或者人工构建的靶向配体直接靶向肿瘤内皮细胞。在一个有争议的报道中，在静脉内施用典型的血管生成抑制剂TNP-470，抑制了在Yoshida肉瘤的大鼠模型中的原发性肿瘤的生长，但是增加了淋巴结节中的转移灶的生长(HoriK.等人.IncreasedgrowthandincidenceoflymphnodemetastasisesduetotheangiogenesisinhibitorAGM-1470.BrJCancer1997；751730-1734)。低剂量或短期施用抗血管抑制剂可能不适合于转移性癌症的治疗。虽然，大部分迄今的潜伏期的和临床的抗血管生成治疗已经用纯化的抗血管生成因子来实施，但是，基因治疗似乎比其它形式的抗血管生成治疗更加有效。抗血管形成基因治疗的潜在优点是持续表达抗血管生成因子和高度定位的呈递。尽管有这些优点，这种治疗形式的载体的开发仍然处于早期阶段(ChenC.T.等人，Antiangiogenicgenetherapyforcancerviasystemicadministrationofadenoviralvectorsexpressingsecretableendostatin.HumanGeneTherapy2000；111983-96；FeldmanA.L.等人，Antiangiogenicgenetherapyofcancerutilizingarecombinantadenovirustoelevateendostatinlevelsinmice.CancerRes.2000；601503-1506)。但是，由基于腺病毒载体介导的抗血管生成因子的表达受到了有效的宿主免疫反应的限制，并且由于载体的附加体性质，该表达也是次要的。6.10.2局部呈递AAV-血管抑制素在肝脏转移治疗中达到可能的治疗功效施用组成型地表达抗血管生成的蛋白质的载体，使得可以在循环中维持该蛋白质，并且在小鼠中已经证明它比注射抑制剂的间断峰值更加有效(BlezingerP.等人1999，同上文)。设计来分别表达血管抑制素、内抑制素和neuropilin的腺病毒显著是低效率的(KuoC.J.等.Comparativeevaluationoftheantitumoractivityofantiangiogenicproteinsdeliveredbygenetransfer.ProcNatlAcadSciUSA2001；984605-4610)。但是，当用内抑制素转染细胞，然后将细胞植入小鼠中时，肿瘤的生长完全地被抑制(FeldmanA.L.等人，Effectofretroviralendostatingenetransferonsubcutaneousandintraperitonealgrowthofmurinetumors.JNatlCancerInst.2001；931014-1020)。有关当内抑制素游离在循环中(低效的)和当其被局部释放到肿瘤病灶(tumorbed)(高效的)时的抗肿瘤功效的明显差别的原因是不清楚的。一种可能性是系统性基因治疗产生显著高于系统性蛋白质治疗的血浆水平的内抑制素。如果循环中的内抑制素符合U型的功效曲线，那么循环中的非常高的蛋白质浓度可能比较低的剂量更不具有抗血管生成作用。先前已经报导，按照持续的静脉内方案来施用内抑制素，当剂量达到20mg/kg/天和血浆水平达到约250ng/ml的稳定状态时，在人BxPC3胰腺癌中引起97％的肿瘤退化(KiskerO.等人，Continuousadministrationofendostatinbyintraperitoneallyimplantedosmoticpumpimprovestheefficacyandpotencyoftherapyinamousexenografttumormodel.CancerRes.2001；617669-7674)。但是，当以400mg/kg/天施用极高剂量的内抑制素时，仅能抑制49％的肿瘤生长(KerbelR.等人，Clinicaltranslationofangiogenesisinhibitors.NatureReviews/cancer2002；2727-739)。虽然，这些剂量远远超出患者所接受的剂量，至少超出系统性治疗的剂量，但是必须小心调整内抑制素的血清水平，以获得一定范围的血液水平(Shi，W等人，2002，Adeno-associatedvirus-mediatedgenetransferofendostatininhibitsangiogenesisandtumorgrowthinvivo，CancerGeneTher.9513-521；CalvoA等人，Adenovirus-mediatedendostatindeliveryresultsininhibitionofmammaryglandtumorgrowthinC3(1)/SV40T-antigentransgenicmice.CancerRes.2002；623934-3938；IndraccoloS.等人Differentialeffectsofangiostatin，endostatinandinterferon-1genetransferoninvivogrowthofhumanbreastcancercells.GeneTher.2002；9867-878)。但是，被表达的蛋白质在体循环中的含量不必与肿瘤中的局部含量相等，仅达到较窄范围内的水平。局部化的载体呈递已经被用于在不同基因治疗条件下在肿瘤中实现或增加转基因的表达(JuD.W.等人，IntratumoralinjectionofGM-CSFgeneencodedrecombinantvacciniaviruselicitspotentantitumorresponseinamurinemelanomamodel.CancerGeneTher.1997；4139-144；BassC.等人.Recombinantadenovirus-mediatedgenetransfertogenitourinaryepitheliuminvitroandinvivo.CancerGeneTher.1995；297-104；deRoosW.K.等人Isolated-organperfusionforlocalgenedeliveryefficientadenovirus-mediatedgenetransferintotheliver.GeneTher.1997；455-62；LeeS.S.等人.Intravesicalgenetherapyinvivogenetransferusingrecombinantvacciniavirusvectors.CancerRes.1994；543325-3328).。6.10.3除了抗血管生成功能外，AAV-血管抑制素能够诱导肿瘤凋亡虽然一些试验已经证明，血管抑制素介导的对血管生成的抑制会引起肿瘤细胞凋亡的增加，而不直接影响肿瘤细胞的增殖率，但是，rAAV-血管抑制素诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不清楚(JoeY.A.等人，1999，同上文；TanakaT.等人，1998，同上文；GriscelliF.等人，1998，同上文)。血管抑制素对新血管化的抑制可能会限制肿瘤细胞存活因子的供应，这些存活因子由内皮细胞和/或体液循环提供。还证明血管抑制素会在内皮细胞中诱导凋亡，内皮细胞对于新血管形成是重要的(Clasesson-WelshL.等人.Angiostatininducesendothelialcellapoptosisandactivationoffocaladhesionkinaseindependentlyoftheintegrin-bindingmotifRGD.ProcNatlAcadSciUSA1998；955579-5583；LucasR.等人，Multipleformsofangiostatininduceapoptosisinendothelialcells.Blood1998；924730-4741)。rAAV-血管抑制素介导肿瘤细胞凋亡的机制可能由切断氧气和营养的呈递构成。因此，血管抑制素可能诱导支持肿瘤细胞的微血管中的内皮细胞凋亡，接着，肿瘤细胞发生凋亡。数个试验表明，血管发生抑制剂能够降低内皮细胞来源的促进细胞存活的旁分泌因子的含量，从而诱导肿瘤细胞凋亡。已经报导，这些蛋白中至少有20种可由内皮细胞生成，例如其中的血小板来源的生长因子(PDGF)、IL-6和结合肝素的上皮生长因子(HB-EGF)(RakJ.等人Consequencesofangiogenesisfortumorprogression，metastasisandcancertherapy.Anti-CancerDrugs1995；63-18)。旁分泌因子的生成降低部分地是由于内皮细胞增殖被抑制(DixeliusJ.等人.Endostatin-inducedtyrosinekinasesignalingthroughtheShbadaptorproteinregulatesendothelialcellapoptosis.Blood2000；953403-3411)。还不清楚，血管生成抑制剂是否还直接降低内皮细胞生成旁分泌因子。6.10.4AAV-介导的抗治疗可用于预防和治疗转移性肝癌本发明提供有用的用于转移性肝癌的抗血管生成治疗的临床应用。通过手术(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文)或者放射(CamphausenK.等人.Radiationtherapytoaprimarytumoracceleratesmetastaticgrowthinmice.CancerRes.2001；612207-2211)去除原发性肿瘤，会引起分散的微小的远处的肿瘤发生血管化和快速生长。这种被称作为“伴随性抵抗”的现象如今被解释为一个肿瘤抑制其它肿瘤中的血管发生的能力(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文)。一些肿瘤产生能激活血管发生抑制剂的酶，这些抑制剂例如是血管抑制素(O′ReillyM.S.等人，1994，同上文；Camphausen，K.等人，2001，同上文)、内抑制素(O′ReillyM.S.等人.Endostatinanendogenousinhibitorofangiogenesisandtumorgrowth.Cell1997；88277-285；WenW.等人.Thegenerationofendostatinismediatedbyelastase.CancerRes.1999；596052-6056；FelborU.等人.SecretedcathepsinLgeneratesendostatinfromCollagenXVIII.EMBOJ2000；191187-1194)和抗血管发生抗血栓素(O′ReillyM.S.等人.Antiangiogenicactivityofthecleavedconformationoftheserpinantithrombin.Science1999；2851926-1928；KiskerO.等人.Generationofmultipleangiogenesisinhibitorsbyhumanpancreaticcancer.CancerRes.2001；617298-7304)，接着，这些酶会阻止远处的肿瘤的生长(O′ReillyM.S.等人，1997，同上文；WenW.等人，1999，同上文)。化学治疗是预防和处理这些微小的分散的转移性肿瘤的最常用方法。但是，化学治疗的毒性和免疫抑制特性使其临床应用价值降低。抗血管生成治疗通常是低毒性的，并且更不太可能诱导获得性药物抗性。因此，对于具有高度患癌症危险性的患者来说，抗血管生成抑制剂可以被用作一种预防性措施，或者作为完全手术切除原发性肿瘤后的癌症复发的治疗方法。在大鼠中进行的自然的致癌物质诱导乳腺癌的示例性试验已经证明，内抑制素防止乳腺癌的发生，而且与未处理的对照相比，还延长所处理的大鼠的存活(ChoykeP.L.等人.Specialtechniquesforimagingbloodflowtotumors.CancerJ.2002；8109-118)。但是，为了获得预防性效果，必须长期和高浓度地呈递抗血管生成试剂。7.实施例27.1方法7.1.1制备AAV-血管抑制素和AAV-B7.1采用适当的限制性酶，将巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡β-肌动蛋白启动子、报导基因、编码由信号肽和小鼠血浆酶原的前四个kringle区组成的全长小鼠血管抑制素的1.4-kbcDNA片段或者编码全长小鼠B7.1的1.2kbcDNA片段以及polyA序列插入到反向末端重复序列之间(参见，XuL.等人，CMV-beta-actinpromoterdirectshigherexpressionfromanadeno-associatedviralvectorintheliverthanthecytomegalovirusorelongationfactor1alphapromoterandresultsintherapeuticlevelsofhumanfactorXinmice.HumGeneTher.2001；12563-7)。旱獭乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)也被插入到该构建体中，以增强表达水平(DonelloJ.等人.Woodchuckhepatitisviruscontainsatripartiteposttranscriptionalregulatoryelement.JVirol.1998；725085-5092；XuR.等人，Quantitativecomparisonofexpressionwithadeno-associatedvirus(AAV-2)brain-specificgenecassettes.GeneTher.2001；81323-32)。用Qiagen质粒纯化试剂盒来制备质粒。采用稍微改进的三质粒、无辅助病毒的包装方法来制备AAV颗粒(XiaoW.等人.RouteofadministrationdeterminesinductionofTcellindependenthumoralresponsetoadeno-associatedvirusvectors.MolTher.2000；1323-9)。采用磷酸钙沉淀方法，将AAV-血管抑制素和辅助病毒pFdH22转染到293细胞中。在转染后70小时收获细胞，在存在50单位/mlBenzonaseX(Sigma)时，用0.5％脱氧胆盐在37℃下培养30分钟来溶解细胞。在以5,000xg离心后，用0.45μmAcrodisch注射器滤膜过滤，以除去颗粒物质，接着在肝素柱上分馏。通过肝素亲合柱层析来分离AAV颗粒。用100mMNaCl、1mMMgCl2和20mM磷酸钠和磷酸二氢钠，pH7.4来透析峰值病毒馏分。采用ABAppliedBiosystem对部分样本进行定量PCR分析，来量化基因组滴度。PCRTaqman分析是一种改进的斑点印迹方法，其中连续稀释AAV，接着用DNA酶I和蛋白激酶K消化。用苯酚-氯仿提取病毒DNA两次，以去除蛋白质，然后用2.5个当量体积的乙醇进行沉淀。在102-107个拷贝的范围内建立标准扩增曲线，得到对应于各个起始模板拷贝数的扩增曲线。用商品试剂盒(Progen，Germany)再次确认病毒颗粒。在进行动物试验之前，将病毒载体存储在-80℃下。7.1.2小鼠、细胞系和抗体6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠(H-2b)从香港大学的试验动物单位获得。同源的(H-2b)EL-4胸腺淋巴瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD，USA)。将细胞培养在37℃下的Dulbecco′sModifiedEaglesMedium(DMEM)(GibcoBRL，GrandIsland，NY，USA)中，该培养基中添加了10％胎牛血清、50U/ml青霉素/链霉素、2mML-谷氨酸和1mM丙酮酸。抗血管抑制素单克隆抗体(mAb)和抗B7.1mAb分别购自Calbiochem-NovabiochemCorporation(Boston，MA，USA)和BDPharmingen(SanDiego，CA，USA)。7.1.3EL-4细胞的转染以及对转基因表达的分析将原代EL-4细胞(5×105/孔，培养在96-孔培养板中)培养在总体积50μl的添加了10％FCS的DMEM中，加入感染性AAV，产生1-500之间的MOL。在第0.5小时、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时时收获细胞。在用4％仲甲醛溶液固定后，用3％牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞，并用抗B7.1抗体(Abs)培养。然后用荧光素-异硫氰酸酯(FITC)偶联的第二抗体培养，并通过荧光显微镜观察。将仅用空AAV载体转染的细胞作为对照。7.1.4流式细胞计数在AAV转导后，收获EL-4肿瘤细胞，并通过Ficoll密度梯度离心，并洗涤。在冰上，在磷酸缓冲盐水(PBS)、4％FCS、0.1％叠氮化钠、20mMHEPS(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2乙磺酸)和5mM乙烯二氨基四乙酸(EDTA)，pH7.3中，用特定抗体培养细胞30分钟，并洗涤。用同型对照大鼠IgG1mAb(BDPharmingen)培养来控制非特异性结合。仅用空AAV载体转染的细胞作为对照。通过FACScan分析，评价转基因的表达水平。然后将细胞作为如下所述的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的靶点，并用于动物试验。7.1.5动物试验给动物实施的所有手术操作和护理得到了香港大学道德委员会的批准，并且按照制定的指导方针进行。动物随机地接受处理。各组含有10只小鼠。分散的肿瘤模型在至少90-95％动物中一致地产生了肿瘤。将等量的亲本EL-4细胞和等量的空AAV病毒颗粒作为对照。7.1.5.1小鼠免疫用10％克他命/甲苯噻嗪溶液，通过腹膜内注射来麻醉C57BL小鼠，并用Betadine溶液处理它们的腹部。右侧肋下肌切口用于打开腹腔。在暴露肝门后，用30G针头，将2×105AAV-B7.1转染的EL-4肿瘤细胞缓慢注射到门静脉中，通过无菌棉尖端施用器(cottontipapplicator)施加压力，直到注射部位止血。进行止血，并封闭腹腔。4周后，在麻醉状态下打开小鼠的腹腔，观察肝脏表面的肿瘤。处死具有可见的肿瘤的小鼠，去除肝脏。然后冷冻保存肝脏，低温保存以制备横断的10μm切片，这些切片是在5个不同的水平上制备的，以覆盖整个肝脏。封闭切片，并用苏木精和伊红染色。用SigmaScan程序，在显微镜下测量和检测整个肝脏和肿瘤的面积。按照如下公式计算肿瘤所占据的相对面积总体肿瘤面积/肝脏面积×100。在肝脏表面无可见肿瘤的小鼠被用于如下试验中。7.1.5.2用亲本肿瘤细胞攻击免疫接种的小鼠通过门静脉内方式给来自上面试验的、在肝脏表面无可见肿瘤的小鼠注射2×105或2×106亲本EL-4肿瘤细胞，以确定是否已经产生系统性的抗肿瘤免疫性。4周后，处死小鼠并取出肝脏。如上分析肿瘤在肝脏中所占据的相对面积。7.1.5.3抗击免疫接种的小鼠中分散的肝癌的AAV-血管抑制素治疗将用AAV-B7.1转染的EL-4肿瘤细胞免疫接种并且没有发现肝脏肿瘤的小鼠，用30G针头门静脉内注射2×106亲本EL-4肿瘤细胞，接着门静脉内灌注3×1011AAV-血管抑制素的颗粒。用无菌棉尖端施用器施加压力，直到注射部位被止血。进行止血，并封闭腹腔。将未免疫接种的小鼠和空AAV病毒用作对照。手术后4周，处死小鼠，取出肝脏。如上所述，分析肝脏中被肿瘤占据的相对面积。7.1.5.4存活力研究将用AAV-B7.1转染的EL-4肿瘤细胞免疫接种并且没有发现肝脏肿瘤的小鼠，用30G针头门静脉内注射2×106亲本EL-4肿瘤细胞，接着门静脉内灌注3×1011AAV-血管抑制素的颗粒。用无菌棉尖端施用器施加压力，直到注射部位被止血。进行止血，并封闭腹腔。将未免疫接种的小鼠和空AAV病毒用作对照。每周称重3次，并评价。按照预先建立的标准，无痛处死濒临死亡的小鼠，即存在两个或多个如下premoid症状(1)总腹水，(2)可触知的大于2cm的肿瘤负担，(3)脱水，(4)萎靡，(5)瘦弱，和(5)体重下降超过起始体重的20％。7.1.6组织切片的免疫组织化学将从门静脉内呈递治疗剂后的肝脏中制备的冷冻切片(10μm厚度)，用特异性的抗体培养过夜。接着，用适当的第二抗体(VECTASTAINDUniversalQuickkit，VectorLaboratories，Burlingame，CA)培养30分钟，并用SigmaFASTTMDAB(3，3′-二氨基对二氨基联苯四盐酸盐)和CoCl2增强片剂(Sigma)显影。用Mayer的苏木精对切片进行反染色。7.1.7Western印迹分析收获体外感染的细胞，或者将来自小鼠的组织在蛋白质溶解缓冲液中剥离、切碎和匀浆。4℃下，通过以10,000xg离心10分钟来去除碎片。汇集来自每一组小鼠的溶解产物，并确定蛋白质的浓度。将蛋白质样本(100μg)溶解在10％聚丙烯酰胺SDS凝胶中，并通过电泳转移到硝化纤维HybondTM-C附加膜上(AmershamLifeScience，England)。在用5％BSA封闭膜后，用特定的第一抗体培养斑点，接着用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体培养，并通过增强化学发光(AmershamInternationalplc，England)来显影，曝光在X射线胶片上。用SigmaScanProgram量化条带密度。7.1.8细胞毒性分析从用AAV-B7.1转染的EL-4肿瘤细胞免疫接种并且无肝脏肿瘤的小鼠中收获脾细胞，并在37℃下以分等级的E∶T比的EL-4靶向细胞在96孔圆底平板中进行培养。在培养4小时后，收集50μl的上清液，用CytoTox96Assay试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)测量溶解产物。包括用于非特异靶点和效应细胞溶解产物的背景对照。在背景递减后，用公式计算细胞溶解的百分比100×(实验性自发的效应靶向的自发靶点/最大的靶向的自发靶点)。7.1.9原位杂交在4％甲醛中固定肝脏切片7分钟，在PBS中洗涤3分钟，然后在2xSSC中洗涤10分钟。按照已经建立的原位杂交方法，在60℃下，用探针溶液杂交脱水切片过夜(Ambion，Austin，TX，USA)。用4xSSC洗涤切片，在37℃下在RNA酶消化溶液中培养30分钟，接着在室温下，用浓度逐渐降低的SSC洗涤5分钟，并轻轻搅拌。用浓度逐渐升高的乙醇将切片脱水，并用VECTASTAINABC试剂盒和碱性磷酸酶色素原试剂盒(BCIP/NBT)进行杂交。7.2结果7.2.1用AAV-B7.1体外快速而有效地转染EL-4肿瘤细胞通过流式细胞仪测量细胞表面上的B7.1的表达，分析AAV-B7.1病毒转染亲本EL-4肿瘤细胞的效率(附图10A)，并且通过免疫组织化学(附图10B)和Western印迹分析(附图10C)证实。与未被转染的亲本EL-4细胞相比，用AAV-B7.1病毒转染的EL-4细胞表达更高水平的B7.1。培养6小时后，80％以上用AAV-B7.1转染的EL-4肿瘤细胞表达的B7.1的水平升高。然后，将转染体用于如下试验中。7.2.2在门静脉灌注AAV后，在肝脏中持续表达血管抑制素本发明人先前已经报导了，通过门静脉注射重组的AAV-血管抑制素载体会导致在肝脏中长期表达外源基因(参见，2003年1月7日申请的美国在先申请60/438,449；以及XuR.等人，Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60，在此完全引入作为参考)。在后一个试验中，在门静脉内注射AAV-血管抑制素后14天，在肝细胞中过度表达血管抑制素蛋白，并且含量持续升高至少180天。在本试验中，在门静脉内注射AAV-血管抑制素后第2、14、60和180天时收集肝脏样本，也获得了类似的结果。空AAV被用作对照。通过免疫组织化学、原位杂交和Western印迹来证实血管抑制素在肝脏中表达。如附图11中所示，通过用DIG-标记的反义WPRE原位杂交肝脏切片检测，与用空载体对照处理的肝脏中的低内源性含量相比(A)，在基因转移后14天，肝细胞中显然过度表达血管抑制素(B)。还通过肝脏切片的免疫组织化学进一步验证在门静脉内注射AAV-血管抑制素后，过度表达血管抑制素(附图11D，与附图11C比较)。对肝脏匀浆的Western印迹分析表明，在肝细胞中表达的转基因血管抑制素在2周内迅速达到一个较高水平，在2个月内升高到峰值水平，然后在一个恒定水平上被稳定表达，直到在注射AAV-血管抑制素后至少6个月(图11E)。7.2.3在门静脉内灌注的小鼠模型中，AAV-B7.1转染刺激肿瘤特异性的溶解细胞的T细胞活性为了分析分散的肝转移性肿瘤的形成和生长，将2×105已经用AAV-B7.1转染的EL-4细胞通过门静脉内注射到小鼠的肝脏中(n＝10)。将肿瘤形成和生长与通过门静脉内方式将类似数量的空载体所转染的EL-4注射到对照小鼠中的进行比较。四周后，对全部小鼠实施剖腹手术，取出具有可见肿瘤的小鼠的肝脏。将肝脏切片，并且用SigmaScan程序测量肿瘤所占据的相对面积，如图12A所示。用AAV-B7.1或者空AAV所转染的EL-4细胞处理后，平均相对面积分别为22.9％和3.2％。用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞免疫接种导致肿瘤所占据的相对面积显著(P＜0.001)减少(86％)。此外，60％的小鼠无肝脏肿瘤。在肝脏表面无可见肿瘤的小鼠被用于如下试验。为了评价EL-4转染体表达B7.1是否通过抗肿瘤的CTL促进肿瘤细胞分解，设计了一种体外的CTL杀死分析，其中将自通过用AAV-B7.1转染体免疫接种治愈的肿瘤攻击的小鼠的脾细胞与已经用AAV-B7.1或者空AAV转染的EL-4细胞混合。在效应子与靶点的比例为50∶1时，相比于用空AAV转染的EL-4细胞，抗肿瘤CTL极其显著地(P＜0.01)杀死用AAV-B7.1转染的EL-4细胞。因此，外源性B7.1促进抗肿瘤的CTL杀死肿瘤细胞；这种效果会被抗B7.1抗体消除(图12B)。7.2.4由AAV-B7.1诱导的记忆性抗肿瘤免疫是肿瘤特异性的，并且防止随后的肿瘤攻击与来自接受了空AAV转染的EL-4细胞的小鼠的脾细胞相比，来自无肿瘤的治愈小鼠的脾细胞所展示的抗肿瘤CTL活性得到了显著增强(P＜0.01)，这些治愈小鼠在28天之前已经以门静脉内方式注射了用AAV-B7.1转染的EL-4细胞(图13A)。通过门静脉内注射用AAV-B7.1转染的EL-4细胞治愈了其肿瘤的小鼠，再次受到通过门静脉内注射2×105亲本EL-4肿瘤细胞的攻击。10只小鼠中仅1只中出现了肿瘤，表明已经产生了系统性的抗肿瘤免疫记忆活性。相反，在所有未免疫接种的小鼠中出现了分散的肝脏肿瘤，肿瘤占据了十分大的面积(最高达38％)(图13B)。7.2.5由AAV-B7.1诱导的抗肿瘤免疫性不能阻止大负荷的亲本EL-4肿瘤细胞的攻击通过门静脉内方式，给用门静脉内注射AAV-B7.1所转染的EL-4细胞治愈了肿瘤的小鼠注射更大量的(2×106)亲本EL-4肿瘤细胞来再次攻击它。虽然与未免疫接种的小鼠相比，在免疫接种小鼠中肿瘤所占据的平均相对面积显著较小(P＜0.01)(图13C)，但是在所有小鼠中观察到肿瘤已经转移到肝脏中。7.2.6AAV-血管抑制素增强AAV-B7.1疫苗的治疗功效将AAV-B7.1所转染的EL-4肿瘤细胞(2×105)通过门静脉内注射到小鼠的肝脏中。四周后，对这些免疫接种的小鼠实施剖腹手术，以观察可见的肝脏肿瘤。从试验中排除具有可见的肝脏肿瘤的小鼠。通过门静脉内方式给所有无肿瘤的小鼠注射2×106EL-4亲本细胞，接着门静脉内注射空AAV(n＝10)或者AAV-血管抑制素(n＝10)。给作为对照的未免疫接种的小鼠门静脉内注射2×106亲本EL-4细胞，接着注射AAV(n＝10)或者AAV-血管抑制素(n＝10)。四周后处死小鼠，切除肝脏，并将肝脏横断切片。肿瘤在肝脏中所占据的相对面积被图示在图14A中。在接受空AAV或者AAV-血管抑制素的未被免疫接种的小鼠中，平均相对肿瘤面积分别为42.3％和17.7％。因此，根据本发明人的先前报导，AAV-血管抑制素显著地抑制了56％的已经转移到肝脏的肿瘤生长(XuR.等人.Long-termexpressionofangiostatinsuppresseslivermetastaticcancerinmice.Hepatology.2003；37(6)1451-60)。用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞进行免疫接种也显著地抑制了38％的肿瘤的生长，使得肝脏中26.2％被肿瘤占据，而在未被免疫接种的小鼠中，肝脏中的42.3％被肿瘤占据。在用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞免疫接种并用AAV-血管抑制素处理的小鼠中，肝脏肿瘤所占据的平均相对面积仅为5.6％，并且仅50％(5/10)的小鼠具有可见的肝脏肿瘤。与用空AAV处理的未免疫接种的小鼠相比，肝脏肿瘤所占据的相对面积减少了87％，与用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞免疫接种和用空AAV处理的小鼠相比，减少了79％，与用AAV-血管抑制素处理的未免疫接种的小鼠相比，减少了68％。7.2.7AAV-B7.1和AAV-血管抑制素在提高具有肝脏转移性肿瘤的小鼠的存活率中起协同作用本发明人还研究了通过用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞免疫接种后用AAV-血管抑制素进行治疗产生的协同作用是否会对小鼠存活有益。给C57BL/6小鼠门静脉内注射2×105AAV-B7.1所转染的EL-4肿瘤细胞。四周后，对小鼠实施剖腹手术。从试验中排除在肝脏中具有可见肿瘤的小鼠。给无肿瘤的所有小鼠门静脉内注射2×106EL-4亲本细胞，接着门静脉内注射3×1011空AAV颗粒(n＝10)，或者3×1011AAV-血管抑制素颗粒(n＝10)。给作为对照的未被免疫接种的小鼠通过门静脉内注射2×106EL-4亲本细胞，接着门静脉内注射3×1011空AAV颗粒(n＝10)，或者3×1011AAV-血管抑制素颗粒(n＝10)。与用空AAV处理的未被免疫接种的小鼠相比，用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞免疫接种和用AAV-血管抑制素进行治疗都使小鼠的存活率显著提高。此外，组合治疗获得了统计学上更高的存活率。组合治疗组中的10只小鼠中的6只在接种肿瘤细胞后存活超过100天(图14B)。用AAV-B7.1所转染的EL-4相比，免疫接种并且用空AAV处理的小鼠的中值存活时间或者用AAV-血管抑制素处理的未被免疫接种的小鼠的存活时间分别为33天和42天，分别显著地(P＜0.05或P＜0.01)区别于用空AAV处理的未免疫接种的对照小鼠的25天的中值存活时间(附图14B)。7.3讨论许多最常见的癌症转移到肝脏。大部分患者死于含有多种主要存在于肝脏中的转移性酶的结肠直肠癌和乳腺癌。临床效果需要靶向所有肝脏转移性肿瘤的系统性或局部的治疗(TadaH.等人，SystemicIFN-βgenetherapyresultsinlong-termsurvivalinmicewithestablishedcolorectallivermetastases.JClinInvest.2001；10883-95)。对本研究的推动力源于先前的报导，在该报导中，本发明人证明大肿瘤的免疫抗性可以通过组合B7.1介导的免疫治疗和通过基因转移呈递血管抑制素对肿瘤血管的协同攻击来克服(SunX.等人.CancerGeneEher.2001；8719-727)，而在另一个报导中，本发明人证明，门静脉内灌注编码小鼠血管抑制素的重组AAV载体会导致在肝脏中长期和稳定地表达血管抑制素，并显著地抑制转移性肝脏肿瘤(XuR.同上文)。但是，采用AAV-血管抑制素的抗血管发生的治疗不能够根除转移性肝脏治疗，这大概是由于虽然抗血管生成蛋白质对于诱导治疗退化是有效的，但是它们不是直接杀死肿瘤的，因此，一旦停止处理，常常再次发生肿瘤再生。为了扩大与免疫治疗和抗血管发生治疗结合的癌症基因治疗的范围，本发明人采用AAV技术来呈递血管抑制素和共刺激分子B7.1。本研究首次证明，局部门静脉内呈递AAV-B7.1所转染的EL-4细胞会诱导记忆性抗肿瘤免疫性，这使被免疫接种的小鼠具有抵抗被亲本EL-4细胞攻击的能力。组合门静脉内灌注AAV-B7.1所转染的EL-4细胞和AAV血管抑制素能够根除所建立的肝脏转移性肿瘤。由于依赖于B7的共刺激信号在T细胞激活中起重要作用，已经提出许多肿瘤类型的免疫原性的缺乏是由于缺乏B7表达(ChenL.等人，CostimulationofantitumorimmunitybytheB7counterreceptorfortheTlymphocytemoleculesCD28andCTLA-4.Cell.1992；711093-102；BaskarS.等人，ConstitutiveexpressionofB7restoresimmunogenicityoftumorcellsexpressingtruncatedmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules.ProcNatlAcadSciUSA.1993；90(12)5687-90)。实际上，已经证明，B7.1基因转染到不同的实验性小鼠肿瘤中，极大地提高了它们的免疫原性(ChenL.等人，同上文；BaskarS.等人，同上文)。B7-1和B7-2转染到免疫原性的肿瘤细胞中，使得这种细胞具有呈递其肿瘤抗原和生成抗肿瘤CTL的能力，当转染体被注射到动物中时，防止了肿瘤的发生。相反，免疫系统仍然完全不识别亲本的未被转染的肿瘤细胞，这些细胞无限制地生长(ChenL.等人，CostimulationofantitumorimmunitybytheB7counterreceptorfortheTlymphocytemoleculesCD28andCTLA-4.Cell.1992；711093-102；TownsendS.E.等人，TumorrejectionafterdirectcostimulationofCD8+TcellsbyB7-transfectedmelanomacells.Science1993；259368-370；BaskarS.等人，ConstitutiveexpressionofB7restoresimmunogenicityoftumorcellsexpressingtruncatedmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules.ProcNatlAcadSciUSA.1993；90(12)5687-90)。已经证明，小鼠B7-1和B7-2的肿瘤内基因转移能够根除已经建立的肿瘤，已经显示这种转移共同刺激由CD8+T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤活性，伴随着与穿孔素和Fas-配体路径相关的增强的肿瘤特异性的溶解细胞的T细胞活性(SunX.CancerGeneTher.2001；8719-727；KanwarJ.R.等人，GeneTherapy1999；61835-1844；SunX.等人，GeneTher2001；8638-645；KanwarJ.R.等人，EffectofsurvivingantagonistsonthegrowthofestablishedtumorsandB7.1immunogenetherapy.JNatlCancerInst.2001；931541-1552)。用于本研究的AAV介导的转染系统是有利的，其能够快速在体外转染EL-4肿瘤细胞，因此将EL-4细胞转化为一种疫苗，该疫苗被用于免疫接种小鼠。被免疫接种的小鼠抵抗亲本EL-4细胞的攻击，表明产生了抗肿瘤的免疫性。本研究的关键发现是，血管抑制素和B7.1-免疫治疗在根除转移到肝脏中的肿瘤中起协同作用。相比之下，用AAV-B7.1所转染的EL-4细胞进行免疫接种或者使用AAV-血管抑制素单一治疗都不能有效地清除转移到肝脏中的肿瘤。通过组合治疗治愈的并且用活的亲本EL-4细胞再次攻击的小鼠保持无肿瘤至少2个月，表明已经产生了有效的系统性的抗肿瘤的免疫性。局部载体呈递已经被用于在肿瘤中特异性地靶向转基因表达(BassC.等人，Rcombinantadenovirus-mediatedgenetransfertogenitourinaryepitheliuminvitroandinvivo.CancerGeneTher.1995；297-104；deRoosW.K.等人，Isolated-organperfusionforlocalgenedeliveryefficientadenovirus-mediatedgenetransferintotheliver.GeneTher.1997；455-62；LeeS.S.等人，Intravesicalgenetherapyinvivogenetransferusingrenconbinantvacciniavirusvectors.CancerRes.1994；543325-3328)。虽然，在许多临床条件下，系统性的载体呈递可能是最优选的，但肝脏的独特解剖学特征使得基因治疗方法对于不可切除的肝脏转移性肿瘤来说是便捷的(deRoos等人，同上文)。局部载体呈递的优点是显然的，其能够原位诱导转基因蛋白质的高水平表达，以产生有效的抗肿瘤活性，并且相对于系统性呈递来说，降低了副作用发生的可能性。在此描述的组合基因治疗方法，采用共刺激分子B7.1和血管发生抑制剂血管抑制素，导致在肝细胞中持续过度表达外源的血管抑制素最长达6个月，并且抑制已经转移到肝脏中的淋巴瘤的生长。对于通常难以治疗的肝脏癌症治疗来说，该结果具有重要的意义。8.等同物仅采用常规试验，本领域的技术人员将会认识到或者能够确定，在此描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。这些等同物被包括在如下的权利要求书中。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此引入作为参考，其程度与每个独立的出版物或专利申请被明确而分别地指明引入作为参考一样。在此对参考文献的引用或者讨论不应被解释为认同它们为本发明的现有技术。序列表<110>Xu，RuianSun，XueyingFan，Sheung-TatKung，Hsiang-FuKrissensan，GeoffreyFung，Peter<120>用血管抑制素协同加强腺伴随病毒介导的B7.1免疫接种以根除扩散的肝转移性肿瘤<130>9661-048-999<140>将要被指定<141><150>60/438,449<151>2003-01-07<160>6<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>1401<212>DNA<213>小鼠<220><221>CDS<222>(1)...(1401)<223>小鼠血管抑制素<400>1atggaccataaggaagtaatccttctgtttctcttgcttctgaaacca48MetAspHisLysGluValIleLeuLeuPheLeuLeuLeuLeuLysPro151015ggacaaggggactcgctggatggctacataagcacacaaggggcttca96GlyGlnGlyAspSerLeuAspGlyTyrIleSerThrGlnGlyAlaSer202530ctgttcagtctcaccaagaagcagctcgcagcaggaggtgtctcggac144LeuPheSerLeuThrLysLysGlnLeuAlaAlaGlyGlyValSerAsp354045tgtttggccaaatgtgaaggggaaacagactttgtctgcaggtcattc192CysLeuAlaLysCysGluGlyGluThrAspPheValCysArgSerPhe505560cagtaccacagcaaagagcagcaatgcgtgatcatggcggagaacagc240GlnTyrHisSerLysGluGlnGlnCysValIleMetAlaGluAsnSer65707580aagacttcctccatcatccggatgagagacgtcatcttattcgaaaag288LysThrSerSerIleIleArgMetArgAspValIleLeuPheGluLys859095agagtgtatctgtcagaatgtaagaccggcatcggcaacggctacaga336ArgValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArg100105110ggaaccatgtccaggacaaagagtggtgttgcctgtcaaaagtggggt384GlyThrMetSerArgThrLysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGly115120125gccacgttcccccacgtacccaactactctcccagtacacatcccaat432AlaThrPheProHisValProAsnTyrSerProSerThrHisProAsn130135140gagggactagaagagaactactgtaggaacccagacaatgatgaacaa480GluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGln145150155160gggccttggtgctacactacagatccggacaagagatatgactactgc528GlyProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCys165170175aacattcctgaatgtgaagaggaatgcatgtactgcagtggagaaaag576AsnIleProGluCysGluGluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLys180185190tatgagggcaaaatctccaagaccatgtctggacttgactgccaggcc624TyrGluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAla195200205tgggattctcagagcccacatgctcatggatacatccctgccaaattt672TrpAspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPhe210215220ccaagcaagaacctgaagatgaattattgccacaaccctgacggggag720ProSerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGlu225230235240ccaaggccctggtgcttcacaacagaccccaccaaacgctgggaatac768ProArgProTrpCysPheThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyr245250255tgtgacatcccccgctgcacaacacccccgcccccacccagcccaacc816CysAspIleProArgCysThrThrProProProProProSerProThr260265270taccaatgtctgaaaggaagaggtgaaaattaccgagggaccgtgtct864TyrGlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSer275280285gtcaccgtgtctgggaaaacctgtcagcgctggagtgagcaaacccct912ValThrValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrPro290295300cataggcacaacaggacaccagaaaatttcccctgcaaaaatctggaa960HisArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGlu305310315320gagaactactgccggaacccagatggagaaactgctccctggtgctat1008GluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyr325330335accactgacagccagctgaggtgggagtactgtgagattccatcctgc1056ThrThrAspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCys340345350gagtcctcagcatcaccagaccagtcagattcctcagttccaccagag1104GluSerSerAlaSerProAspGlnSerAspSerSerValProProGlu355360365gagcaaacacctgtggtccaggaatgctaccagagcgatgggcagagc1152GluGlnThrProValValGlnGluCysTyrGlnSerAspGlyGlnSer370375380tatcggggtacatcgtccactaccatcacagggaagaagtgccagtcc1200TyrArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyLysLysCysGlnSer385390395400tgggcagctatgtttccacacaggcattcgaagaccccagagaacttc1248TrpAlaAlaMetPheProHisArgHisSerLysThrProGluAsnPhe405410415ccagatgctggcttggagatgaactactgcaggaacccggatggtgac1296ProAspAlaGlyLeuGluMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAsp420425430aagggcccttggtgctacaccactgacccgagcgtcaggtgggaatac1344LysGlyProTrpCysTyrThrThrAspProSerValArgTrpGluTyr435440445tgcaacctgaagcggtgctcagagacaggagggagtgttgtggaattg1392CysAsnLeuLysArgCysSerGluThrGlyGlySerValValGluLeu450455460cccacataa1401ProThr*465<210>2<211>466<212>PRT<213>小鼠<400>2MetAspHisLysGluValIleLeuLeuPheLeuLeuLeuLeuLysPro151015GlyGlnGlyAspSerLeuAspGlyTyrIleSerThrGlnGlyAlaSer202530LeuPheSerLeuThrLysLysGlnLeuAlaAlaGlyGlyValSerAsp354045CysLeuAlaLysCysGluGlyGluThrAspPheValCysArgSerPhe505560GlnTyrHisSerLysGluGlnGlnCysValIleMetAlaGluAsnSer65707580LysThrSerSerIleIleArgMetArgAspValIleLeuPheGluLys859095ArgValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArg100105110GlyThrMetSerArgThrLysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGly115120125AlaThrPheProHisValProAsnTyrSerProSerThrHisProAsn130135140GluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGln145150155160GlyProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCys165170175AsnIleProGluCysGluGluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLys180185190TyrGluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAla195200205TrpAspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPhe210215220ProSerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGlu225230235240ProArgProTrpCysPheThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyr245250255CysAspIleProArgCysThrThrProProProProProSerProThr260265270TyrGlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSer275280285ValThrValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrPro290295300HisArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGlu305310315320GluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyr325330335ThrThrAspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCys340345350GluSerSerAlaSerProAspGlnSerAspSerSerValProProGlu355360365GluGlnThrProValValGlnGluCysTyrGlnSerAspGlyGlnSer370375380TyrArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyLysLysCysGlnSer385390395400TrpAlaAlaMetPheProHisArgHisSerLysThrProGluAsnPhe405410415ProAspAlaGlyLeuGluMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAsp420425430LysGlyProTrpCysTyrThrThrAspProSerValArgTrpGluTyr435440445CysAsnLeuLysArgCysSerGluThrGlyGlySerValValGluLeu450455460ProThr465<210>3<211>2824<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(364)...(1230)<223>人cD80抗原(Genbank登录号NM005191)<400>3aagtaacagaagttagaaggggaaatgtcgcctctctgaagattacccaaagaaaaagtg60atttgtcattgctttatagactgtaagaagagaacatctcagaagtggagtcttaccctg120aaatcaaaggatttaaagaaaaagtggaatttttcttcagcaagctgtgaaactaaatcc180acaacctttggagacccaggaacaccctccaatctctgtgtgttttgtaaacatcactgg240agggtcttctacgtgagcaattggattgtcatcagccctgcctgttttgcacctgggaag300tgccctggtcttacttgggtccaaattgttggctttcacttttgaccctaagcatctgaa360gccatgggccacacacggaggcagggaacatcaccatccaagtgtcca408MetGlyHisThrArgArgGlnGlyThrSerProSerLysCysPro151015tacctcaatttctttcagctcttggtgctggctggtctttctcacttc456TyrLeuAsnPhePheGlnLeuLeuValLeuAlaGlyLeuSerHisPhe202530tgttcaggtgttatccacgtgaccaaggaagtgaaagaagtggcaacg504CysSerGlyValIleHisValThrLysGluValLysGluValAlaThr354045ctgtcctgtggtcacaatgtttctgttgaagagctggcacaaactcgc552LeuSerCysGlyHisAsnValSerValGluGluLeuAlaGlnThrArg505560atctactggcaaaaggagaagaaaatggtgctgactatgatgtctggg600IleTyrTrpGlnLysGluLysLysMetValLeuThrMetMetSerGly657075gacatgaatatatggcccgagtacaagaaccggaccatctttgatatc648AspMetAsnIleTrpProGluTyrLysAsnArgThrIlePheAspIle80859095actaataacctctccattgtgatcctggctctgcgcccatctgacgag696ThrAsnAsnLeuSerIleValIleLeuAlaLeuArgProSerAspGlu100105110ggcacatacgagtgtgttgttctgaagtatgaaaaagacgctttcaag744GlyThrTyrGluCysValValLeuLysTyrGluLysAspAlaPheLys115120125cgggaacacctggctgaagtgacgttatcagtcaaagctgacttccct792ArgGluHisLeuAlaGluValThrLeuSerValLysAlaAspPhePro130135140acacctagtatatctgactttgaaattccaacttctaatattagaagg840ThrProSerIleSerAspPheGluIleProThrSerAsnIleArgArg145150155ataatttgctcaacctctggaggttttccagagcctcacctctcctgg888IleIleCysSerThrSerGlyGlyPheProGluProHisLeuSerTrp160165170175ttggaaaatggagaagaattaaatgccatcaacacaacagtttcccaa936LeuGluAsnGlyGluGluLeuAsnAlaIleAsnThrThrValSerGln180185190gatcctgaaactgagctctatgctgttagcagcaaactggatttcaat984AspProGluThrGluLeuTyrAlaValSerSerLysLeuAspPheAsn195200205atgacaaccaaccacagcttcatgtgtctcatcaagtatggacattta1032MetThrThrAsnHisSerPheMetCysLeuIleLysTyrGlyHisLeu210215220agagtgaatcagaccttcaactggaatacaaccaagcaagagcatttt1080ArgValAsnGlnThrPheAsnTrpAsnThrThrLysGlnGluHisPhe225230235cctgataacctgctcccatcctgggccattaccttaatctcagtaaat1128ProAspAsnLeuLeuProSerTrpAlaIleThrLeuIleSerValAsn240245250255ggaatttttgtgatatgctgcctgacctactgctttgccccaagatgc1176GlyIlePheValIleCysCysLeuThrTyrCysPheAlaProArgCys260265270agagagagaaggaggaatgagagattgagaagggaaagtgtacgccct1224ArgGluArgArgArgAsnGluArgLeuArgArgGluSerValArgPro275280285gtataacagtgtccgcagaagcaaggggctgaaaagatctgaaggtctcacctcca1280Val*tttgcaattgacctcttctgggaacttcctcagatggacaagattaccccaccttgccct1340ttacgtatctgctcttaggtgcttcttcacttcagttgctttgcaggaagtgtctagagg1400aatatggtgggcacagaagtagctctggtgaccttgatcaaggggttttgaaatgcagaa1460ttcttgagttctggaagggactttagagaataccagtgttattaatgacaaaggcactga1520ggcccagggaggtgacccgaattataaaggccagcgccagaacccagatttcctaactct1580ggtgctctttccctttatcagtttgactgtggcctgttaactggtatatacatatatatg1640tcaggcaaagtgctgctggaagtagaatttgtccaataacaggtcaacttcagagactat1700ctgatttcctaatgtcagagtagaagattttatgctgctgtttacaaaagcccaatgtaa1760tgcataggaagtatggcatgaacatctttaggagactaatggaaatattattggtgttta1820cccagtattccatttttttcattgtgttctctattgctgctctctcactcccccatgagg1880tacagcagaaaggagaactatccaaaactaatttcctctgacatgtaagacgaatgattt1940aggtacgtcaaagcagtagtcaaggaggaaagggatagtccaaagacttaactggttcat2000attggactgataatctctttaaatggctttatgctagtttgacctcatttgtaaaatatt2060tatgagaaagttctcatttaaaatgagatcgttgtttacagtgtatgtactaagcagtaa2120gctatcttcaaatgtctaaggtagtaactttccatagggcctccttagatccctaagatg2180gctttttctccttggtatttctgggtctttctgacatcagcagagaactggaaagacata2240gccaactgctgttcatgttactcatgactcctttctctaaaactgccttccacaattcac2300tagaccagaagtggacgcaacttaagctgggataatcacattatcatctgaaaatctgga2360gttgaacagcaaaagaagacaacatttctcaaatgcacatctcatggcagctaagccaca2420tggctgggatttaaagcctttagagccagcccatggctttagctacctcactatgctgct2480tcacaaaccttgctcctgtgtaaaactatattctcagtgtagggcagagaggtctaacac2540caacataaggtactagcagtgtttcccgtattgacaggaatacttaactcaataattctt2600ttcttttccatttagtaacagttgtgatgactatgtttctattctaagtaattcctgtat2660tctacagcagatactttgtcagcaatactaagggaagaaacaaagttgaaccgtttcttt2720aataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2780aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2824<210>4<211>288<212>PRT<213>人<400>4MetGlyHisThrArgArgGlnGlyThrSerProSerLysCysProTyr151015LeuAsnPhePheGlnLeuLeuValLeuAlaGlyLeuSerHisPheCys202530SerGlyValIleHisValThrLysGluValLysGluValAlaThrLeu354045SerCysGlyHisAsnValSerValGluGluLeuAlaGlnThrArgIle505560TyrTrpGlnLysGluLysLysMetValLeuThrMetMetSerGlyAsp65707580MetAsnIleTrpProGluTyrLysAsnArgThrIlePheAspIleThr859095AsnAsnLeuSerIleValIleLeuAlaLeuArgProSerAspGluGly100105110ThrTyrGluCysValValLeuLysTyrGluLysAspAlaPheLysArg115120125GluHisLeuAlaGluValThrLeuSerValLysAlaAspPheProThr130135140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地连接到编码B7.1的核酸分子上的CAG启动子，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。9.权利要求8的核酸分子，还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。10.一种核酸分子，包含腺伴随病毒载体和被可操作地连接到(a)SEQIDNO3的核苷酸序列；或者(b)编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上的CAG启动子，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。11.权利要求10的核酸分子，还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。12.包含权利要求8的核酸分子的载体。13.包含权利要求12的载体的宿主细胞。14.一种药物组合物，包含权利要求8的核酸分子和药学上可接受的载体。15.一种用于生产分离的或纯化的血管抑制素蛋白或其片段、变体或衍生物的方法，所述方法包括(i)培育权利要求6的细胞，使得血管抑制素蛋白被表达；和(ii)分离或纯化所述的血管抑制素蛋白。16.一种用于生产分离的或纯化的B7.1蛋白或其片段、变体或衍生物的方法，所述方法包括(i)培育权利要求13的细胞，使得B7.1蛋白被表达；和(ii)分离或纯化所述的B7.1蛋白。17.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的核酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。18.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，CAG启动子被可操作地连接到编码B7.1的核酸序列上，其中CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。19.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)SEQIDNO1的核苷酸序列；或者(b)编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。20.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)SEQIDNO3的核苷酸序列；或者(b)编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。21.权利要求17或18的方法，其中所述的核酸分子还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。22.权利要求17或18的方法，其中所述的癌症是肝癌。23.权利要求22的方法，其中所述的肝癌是转移性的。24.权利要求17或18的方法，其中通过门静脉施用所述的核酸分子。25.权利要求17或18的方法，其中通过肌肉注射施用所述的核酸分子。26.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的(a)包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的第一种核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到编码血管抑制素的核酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子；和(b)包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的第二种核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到编码B7.1的核酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。27.一种在需要的受治疗者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的(a)包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的第一种核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)SEQIDNO1的核酸序列；或者(b)编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子；和(b)包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的第二种核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)SEQIDNO3的核酸序列；或者(b)编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。28.权利要求26的方法，其中第一种核酸分子还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。29.权利要求26的方法，其中第二种核酸分子还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。30.权利要求26的方法，其中所述癌症是肝癌。31.权利要求30的方法，其中所述肝癌是转移性的。32.权利要求26的方法，其中第一种核酸分子和第二种核酸分子是通过门静脉施用的。33.权利要求26的方法，其中第一种核酸分子和第二种核酸分子是通过肌肉注射施用的。34.权利要求26的方法，其中第一种核酸分子和第二种核酸分子被顺序施用。35.权利要求26的方法，其中第一种核酸分子和第二种核酸分子被同时施用。36.一种核酸分子，包含腺伴随病毒载体和CAG启动子，该CAG启动子被可操作地连接到包含编码血管抑制素的第一条核酸序列的第一条多核苷酸，和包含编码B7.1的第二条核酸序列的第二条多核酸上，其中CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。37.权利要求36的核酸分子，还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。38.一种核酸分子，包含腺伴随病毒载体和CAG启动子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)包含(i)SEQIDNO1的核苷酸序列或者(ii)编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列的第一条多核苷酸；和(b)包含(i)SEQIDNO3的核苷酸序列或者(ii)编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列的第二条多核苷酸，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。39.权利要求38的核酸分子，还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。40.包含权利要求36的核酸分子的载体。41.包含权利要求40的载体的宿主细胞。42.一种药物组合物，包含权利要求36的核酸分子和药学上可接受的载体。43.一种生产分离的或者纯化的B7.1蛋白和血管抑制素或其片段、变体或者衍生物的方法，所述方法包括(i)培育权利要求41的细胞，使得B7.1蛋白和血管抑制素被表达；和(ii)分离或者纯化所述的B7.1蛋白和血管抑制素。44.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到包含编码血管抑制素的第一条核酸序列的第一条多核苷酸和包含编码B7.1的第二条核酸序列的第二条多核苷酸上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。45.一种治疗或预防需要治疗或预防癌症的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的包含腺伴随病毒载体和CAG启动子的核酸分子，该CAG启动子被可操作地连接到(a)包含(i)SEQIDNO1的核苷酸序列或者(ii)编码SEQIDNO2的氨基酸序列的核苷酸序列的第一条多核苷酸；和(b)包含(i)SEQIDNO3的核苷酸序列或者(ii)编码SEQIDNO4的氨基酸序列的核苷酸序列的第二条多核苷酸上，其中该CAG启动子包含巨细胞病毒增强子和β-肌动蛋白启动子。46.权利要求44的方法，其中第一条多核苷酸还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。47.权利要求44的方法，其中第二条多核苷酸还包括旱獭乙肝病毒转录后调控元件。48.权利要求44的方法，其中所述的癌症是肝癌。49.权利要求48的方法，其中所述的肝癌是转移性的。50.权利要求44的方法，其中通过门静脉施用核酸分子。51.权利要求26的方法，其中通过肌肉注射施用核酸分子。全文摘要本发明提供编码血管抑制素蛋白的腺伴随病毒(AAV)载体和/或编码共刺激分子B7.1的腺伴随病毒(AAV)载体(“AAV－B7.1载体”)。可以单独地将AAV－血管抑制素载体施用给受验者，或者将其与AAV－B7.1载体顺序地或同时地施用组合，来治疗、控制或者预防转移性肿瘤。还描述了包含AAV－血管抑制素载体和/或AAV－B7.1载体的药物组合物和疫苗及其制造方法。还提供了通过门静脉内注射和肌肉注射来施用AAV－血管抑制素和AAV－B7.1载体。文档编号C12N15/864GK1761757SQ200480005187公开日2006年4月19日申请日期2004年1月7日优先权日2003年1月7日发明者许瑞安,孙学英,范上达,孔祥复,冯戬云,G·克里斯桑森申请人:香港大学,奥克兰单一服务有限公司