专利名称：一种北非蝎昆虫毒素基因序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫毒素，尤其涉及昆虫毒素基因的改造和表达。
背景技术：
蝎子是一种在我国分布很广的以软体昆虫为食的动物，在长期的进化过程中，为生存或防卫的需要在其体内形成了一系列毒素。蝎毒素按其作用对象大致可分为3类(1)哺乳动物神经毒素(MTx，在粗蝎毒中含量高达10％～50％)；(2)昆虫神经毒素，即抗昆虫蝎毒素(ITx，在粗蝎毒中含量低于1％)；(3)甲壳动物神经毒素(CTx)。
蝎毒素的应用价值有1)可用来开发新型生物杀虫剂由于北非蝎昆虫毒素对昆虫的高毒性、特异性以及对甲壳动物、哺乳动物等其他非目标生物均无毒性，因此是开发生物杀虫剂的非常理想的选择。
2)可用来开发具有重要药理活性的蛋白全蝎为我国传统的名贵中药，其有效成分正是蝎毒，主治惊痫抽搐、中风、半身不遂、口眼歪斜、破伤风等，而且还有解毒、止痛，同时也可用来治疗肿瘤、血栓等疾病，并且副作用较小，可以用来生产具有重要药理活性的毒素蛋白。
3)可作为研究蛋白质的理想材料由于蝎昆虫毒素具有特异性和高度选择性，分子较小，便于操作，是研究蛋白质工程、神经生物学、免疫学和离子通道等的理想材料。
从蝎毒中分离得到的抗昆虫神经毒素(下称抗蝎昆虫毒素)，由于多数能专一作用于昆虫，并具有对哺乳动物无害或毒性很小的特点，因而引起了国内外学者的关注。作为一类新的潜在的杀虫基因，应用基因工程的手段，构建重组微生物杀虫剂及转基因抗虫植物，已经成为重要发展方向。
北非蝎昆虫毒素(Androctonus australis Hector insect toxin，AaHIT1)是北非蝎产生的一种毒素，由216bp基因编码，71个氨基酸，分子量约为7KD。AaHIT1毒性很强，具有只作用于昆虫，而对哺乳动物无害的特征。目前国内外对AaHIT1的研究主要集中在两个方面，其一是将AaHIT1基因转入杆状病毒，得到重组的杆状病毒杀虫剂，可缩短杀虫时间，改善保护植物免受危害的效果；其二是转入AaHIT1基因，得到稳定表达AaHIT1基因的抗虫植物，已经体现出良好的应用前景。
例如，国内姚斌等在中国科学(C辑)，Val 26(1)79～84中将AaHIT1基因在杆状病毒中表达，该重组的杆状病毒对粉纹夜蛾幼虫的ST50比野生型杆状病毒缩短了50％。姚斌等还在中国生物化学与分子生物学报，Val 19(2)182-185，将北非蝎昆虫毒素AaHIT1基因转化入烟草中并获得了转基因植株抗虫实验表明，该转基因烟草对白粉虱有明显的抗性。
然而，由于带有AaHIT1基因的重组杆状病毒杀虫剂及转基因抗虫植物对各种昆虫尚缺乏理想的选择性，对非目标鳞翅类昆虫造成持久的危险，其性质更接近于杀虫剂，而不象生物防治制剂，同时重组杆状病毒还存在与野生病毒发生基因交换的风险，造成环境隐患，因此许多学者对此类重组病毒的环境安全性提出了异议。另一方面，AaHIT1毒素基因在多数表达系统中表达水平较低，不能满足科学研究的需要，其基因的调控与表达技术有待进一步完善。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，简称Pf)由于分布广泛，能在多种作物上定殖、对植物病虫害有良好抑菌和防治作用。荧光假单胞菌对人畜无害，多数对植物有益以及遗传操作简便、试验材料丰富等特点，已成为应用重组微生物研究的理想受体菌。美国Mycogen公司将Bt杀虫蛋白基因转入荧光假单胞菌，获得的产品已投放市场。
不同的生物表达基因对基因序列有比较严格的选择性，基因序列的设计成了用基因表达的方法生产高产量和高纯度活性物质的关键。大肠杆菌和荧光假单胞菌是原核生物，北非蝎是真核生物，这种跨界表达更困难，因此国内国外还没有见到能同时在大肠杆菌和荧光假单胞菌中表达的北非蝎昆虫毒素的报告。
本领域迫切需要新的适合作为重组微生物杀虫剂的受体菌，开发新的微生物杀虫剂；同时，需要改进蝎昆虫毒素的表达方法，提供高产量和高纯度的蝎昆虫毒素，满足科学研究的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种同时满足大肠杆菌和荧光假单胞菌嗜好的北非蝎昆虫毒素基因序列，使得北非蝎昆虫毒素基因能在两种宿主菌高水平表达，以克服现有技术之不足。
本发明的另一目的是提供一种制备上述序列的方法。
本发明的另一目的是提供一种北非蝎昆虫毒素的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种上述非蝎昆虫毒素基因序列的应用，用于转化荧光假单胞菌，作为新型微生物杀虫剂，以克服现有技术之不足。
本发明的构思是这样的，用生物信息学的方法分析和计算密码子的偏好率，依照已公开的北非蝎昆虫毒素的氨基酸序列和大肠杆菌及荧光假单胞菌翻译蛋白质的密码子的偏好，设计北非蝎昆虫毒素的基因序列。
本发明的第一方面，提供一种能同时在大肠杆菌和荧光假单胞菌细胞中表达的北非蝎昆虫毒素基因的人工序列，见SEQ.1。
ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAATGCCTGCTGAGCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGCTACTGCTGCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACAAGAAGGTGCTGGAAATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCATCATCAACTAA序列前端划线部分为起始密码子ATG，序列末端划线部分为终止密码子TAA。
本发明的第二方面，提供一种制备SEQ.1所示北非蝎昆虫毒素基因人工序列的方法，该序列是用PCR方法合成的，PCR的引物为P15′-ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAA-3′P25′-GCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGC-3′P35′-GCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACA-3′P45′-ATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCA-3′P53′-CCGTTCCGCGGCCTTACGGACGACTCGTTGATGACGTTGTTGC -5′P63′-ATGCGCCTGTTCCCGATGACGACGGACGACTCGACG-5′P73′-CGGACTTGCTGCTGTTCTTCCACGACCTTTAGTCGCTGTGGGCG-5′P83′-TGACGCTGTGGTGGTAGTAGTTGATT-5′。
8条引物之间有互补的片段，这些互补的片段依次相互配对，经DNA聚合酶补平，可拼接成编码AaHIT1成熟肽的完整的DNA序列，作为PCR反应的模板；所说的DNA聚合酶优选Taq酶。
AaHIT1基因人工序列的合成分两个阶段(1)引物P1～P8加入到如下反应体系ddH2O 55μl，Buffer 10μl，dNTP(10mM)2μl，P1～P8各4μl，Taq酶1μl，反应总体积为100μl；50℃复性1min，72℃延伸20min。
(2)取步骤(1)的反应产物做模板，用P1和P8为引物进行PCR扩增，PCR的反应体系为ddH2O 37.5μl，Buffer 5μl，dNTP(10mmol)1μl，P1、P8各2μl，模板2μl，Taq酶0.5μl。反应条件为94℃预变性2min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，最后72℃延伸5min，回收PCR产物。
PCR产物与pMD18-T进行连接得到测序质粒pMD18-T/AaHIT1，用常规方法进行转化，挑取阳性克隆，测序，PCR产物的序列与AaHIT1的编码基因的序列一致。
本发明的第三方面，提供一种北非蝎昆虫毒素的制备方法，将本发明所提及的北非蝎昆虫毒素基因(SEQ.1)与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的表达载体。再将重组表达载体按常规方法导入适宜的宿主细胞，本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能表达所述重组表达载体。常规方法培养宿主细胞，收集北非蝎昆虫毒素。
在本发明的一个优选的方案中，上述基因序列与表达载体pET32a连接，在大肠杆菌B121细胞中表达。
本发明的另一个优选的方案中，上述基因序列与载体pSUP106连接，在荧光假单胞菌A49838细胞中表达。
本发明的第四方面，公开了北非蝎昆虫毒素基因序列(SEQ.1)的应用，用于转化荧光假单胞菌，作为新型微生物杀虫剂。
在本发明一个优选的方案中，培养北非蝎昆虫毒素基因序列(SEQ.1)转化的荧光假单胞菌，菌体裂解上清液能够抑制甜菜夜蛾幼虫的生长，平均校正死亡率为73.2％。
本发明的有益效果体现在与现有技术相比，本发明的北非蝎昆虫毒素基因序列在大肠杆菌和荧光假单胞菌中能够高效表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，在大肠杆菌和荧光假单胞菌中的表达量分别为35％和33％，见实施例3、实施例4。
本发明的北非蝎昆虫毒素基因转化荧光假单胞菌得到的基因工程菌，其菌体裂解的上清液能够抑制甜菜夜蛾幼虫的生长，说明荧光假单胞菌可正确表达有生物活性的北非蝎昆虫毒素，而荧光假单胞菌原有的抑制植物致病菌(玉米小斑病病原菌)的特性没有改变。因此，本发明的北非蝎昆虫毒素基因可用于转化荧光假单胞菌，开发“双抗”环境友好的新型生物农药。
图1、北非蝎昆虫毒素基因(SEQ.1)在大肠杆菌细胞中的表达表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色而显示。MMarker；1不加诱导剂的表达产物；2加诱导剂的表达产物，箭头所指为表达条带。
图2、北非蝎昆虫毒素基因(SEQ.1)在荧光假单胞菌细胞中的表达表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色而显示。MMarker；1加诱导剂的表达产物，箭头所指为表达条带；2不加诱导剂的表达产物。
图3、北非蝎昆虫毒素基因(SEQ.1)转化的荧光假单胞菌A49838对玉米小斑病病原菌的抑制作用。
具体实施例方式
质粒pET32a、pMD18-T，大肠杆菌BL21菌株、荧光假单胞菌A49838菌株购于华美公司，pSUP106按文献方法制备(Priefer，U B.，Simon，R.and Pühler，A.(1985)Extension of the host range of Escherichia coli vectors by incorporation ofRSF1010 replication and mobilization functions.Journal of Bacteriology，163，324-330)。
限制性内切酶购于购自TaKaRa公司；PCR引物由上海博亚公司合成，其他试剂为国产分析纯试剂，实施例中采用的方法根据《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)。
实施例1、满足大肠杆菌和荧光假单胞菌嗜好的北非蝎昆虫毒素基因人工序列设计根据北非蝎昆虫毒素AaHIT1的氨基酸序列，参照大肠杆菌对密码子的偏好性和荧光假单胞菌密码子的使用频率，设计出相应的DNA序列，具体见SEQ.1。
实施例2北非蝎昆虫毒素(AaHIT1)基因的合成以SEQ.1为模板，设计引物P1～P8。AaHIT1基因人工序列的合成分两个阶段(1)引物P1～P8加入到如下反应体系ddH2O 55μl，Buffer 10μl，dNTP(10mM)2μl，P1～P8各4μl，Taq酶1μl，反应总体积为100μl；50℃复性1min，72℃延伸20min。
(2)取步骤(1)的反应产物做模板，用P1和P8为引物进行PCR扩增，PCR的反应体系为ddH2O 37.5μl，Buffer 5μl，dNTP(10mmol)1μl，P1、P8各2μl，模板2μl，Taq酶0.5μl。反应条件为94℃预变性2min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35个循环，最后72℃延伸5min，回收PCR产物。
PCR产物与pMD18-T进行连接，得到测序质粒pMD18-T/AaHIT1，常规方法转化，挑取阳性克隆，测序鉴定，PCR产物测序结果与SEQ.1完全相同。
实施例3、AaHIT1基因在大肠杆菌中的表达首先构建pET32a/AaHIT1表达载体。在原有的引物P1、P8的5’端加上Nde I、HindIII的酶切位点构成引物P9、P10，引物序列为P9 5’-CGCCATATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC-3’P105’-GGGAAGCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT-3’以实施例2制备的pMD18-T/AaHIT1为模板，以P9，P10为引物，进行PCR反应。将上述的PCR产物回收，分别用Nde I、HindIII酶切，用相同的酶作用pET32a载体。酶切产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳回收片段。将AaHIT1基因的酶切片段和经相同的酶作用了的pET32a相连接，转化DH5α菌，得到阳性克隆，提取质粒，经鉴定为含有AaHIT1基因的质粒pET32a，命名为pET32a/AaHIT1。然后用pET32a/AaHIT1质粒转化E.coli Bl21宿主菌。
挑取转化了pET32a/AaHIT1的Bl 21单菌落，置2ml LB(amp+)中，37℃200rpm培养过夜，从中取100μl菌液加入10ml LB(amp+)培养液中，37℃200rpm培养2h以上，待OD值达到0.5～1.0时，加入诱导剂IPTG(0.8mol/L)，摇床培养2h或4h，利用冻融的方法使菌体破裂，离心去除细胞体，上清液通过SDS-聚丙烯酰胺电泳检测，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，以不加IPTG诱导剂的细菌菌体提取液作为对照。。在分子量7kD左右的部位可见表达产物条带，见图1。通过电泳图谱扫描，目标产物表达量为上清液总蛋白的35％。
实施例4、AaHIT1基因在荧光假单胞菌中的表达挑取荧光假单胞菌A49838菌株的单克隆接入LB液体培养基摇床过夜，以1％的接种量接5ml LB液体培养基，200rpm培养6小时左右，待菌液的OD值达到0.6左右，在无菌的条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的1.5ml Ep管，在冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。5000rpm离心10min。倒出培养液，将管倒置以使最后残留物的痕量培养液流尽。以1ml用冰预冷的30mmol/LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。5000rpm离心10min。倒出培养液，将管倒置以使最后残留物的痕量培养液流尽。用200μl预冷的30mmol/L CaCl2重悬每份沉淀。待用。
在原有的引物P1和P8的5′端加上HindIII的酶切位点构成P11和P12P115’-CGCCATATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC-3’P125’-GGGAAGCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT-3’以P11，P12为引物，原有的pMD18-T/AaHIT1为模板，进行PCR反应，回收PCR产物。用HindIII酶作用回收的PCR产物和去磷酸化处理过的pSUP106质粒。连接质粒与PCR产物，转化E.coli DH5α，转化产物涂LB Cm+平板，挑取阳性克隆，抽提质粒，经鉴定为pSUP106/AaHIT1。然后用pSUP106/AaHIT1转化荧光假单胞菌A49838菌株。
吸取适量质粒pSUP106/AaHIT1加入200μl的感受态细胞，轻轻混匀内容物，在冰中放置30min，42℃水浴2min，快速冰浴1-2min，加入800μl LB培养基，28℃摇床复苏1h，取100μl菌液涂布于平板，28℃培养24-36小时，挑取阳性克隆抽质粒鉴定。37℃200rpm培养2h以上，待OD值达到0.5～1.0时，加入诱导剂IPTG(0.8mol/L)，摇床培养2h或4h，利用冻融的方法使菌体破裂，离心去除细胞体，上清液通过SDS-聚丙烯酰胺电泳检测，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，以不加IPTG诱导剂的细菌菌体提取液作为对照。在分子量7kD左右的部位可见表达产物条带，见图1。通过电泳图谱扫描，目标产物表达量为上清液总蛋白的33％。
实施例5、转化的荧光假单胞菌杀虫作用按实施例4方法制备pSUP106/AaHIT1转化的荧光假单胞菌，加入诱导剂IPTG表达，分别培养2h和4h。冻融的方法使菌体破裂，离心去除细胞体，用该上清液喂饲甜菜夜蛾幼虫，喂养1月后，统计死亡虫体的数量，计算死亡率(见表1)，并测量存活虫体的重量(见表2)。2h表达产物的平均致死率为48.6％，4h表达产物的平均致死率为73.5％，对照组为0.35％；存活虫体平均体重试验组为0.0086克，对照组为0.020克，说明转化的荧光假单胞菌表达上清具有显著的杀虫作用。
表1、AaHIT1转化的荧光假单胞菌表达上清的杀虫作用
表2 甜菜夜蛾存活虫体的重量对比表
实施例6、转化的荧光假单胞菌抑制玉米小斑病病原菌的作用拮抗菌的筛选采用菌斑抑制法。在空白的PDA培养基中央打一直径为10mm小孔，移去培养基，接入相同大小的病原菌，用接种环挑取待测单菌落菌体，在离病原菌的边缘15mm处，划1条不连续同心圆弧，划线时注意与菌斑边缘保持等距离。在28℃培养，并观察菌斑的生长趋势。同时做一份对照样，不接种待测菌体，以比较抑制效果。结果表明A平板为玉米小斑病病原菌的周围接种了A49838菌株，玉米小斑病病原菌的生长受到了限制；B平板只接种了玉米小斑病病原菌，病原菌生长良好。重复实验后，还是产生了同样的结果。平均抑菌带为0.79CM(图3)。
序列表<110>上海师范大学<120>一种北非蝎昆虫毒素基因序列及应用<130>SPI058272<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>216<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaagaaga acggctacgc ggtggacagc agcggcaagg cgccggaatg cctgctgagc 60aactactgca acaacgaatg caccaaggtg cactacgcgg acaagggcta ctgctgcctg 120ctgagctgct actgcttcgg cctgaacgac gacaagaagg tgctggaaat cagcgacacc 180cgcaagagct actgcgacac caccatcatc aactaa21权利要求
1.一种同时满足大肠杆菌和荧光假单胞菌嗜好的北非蝎昆虫毒素(AaHIT1)基因人工序列，其特征在于，所述的序列见SEQ.1。
2.制备权利要求1所述的北非蝎昆虫毒素基因序列的方法，其特征在于，该基因序列用PCR方法合成，PCR扩增的引物为P15′-ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAA-3′P25′-GCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGC-3′P35′-GCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACA-3′P45′-ATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCA-3′P53′-CCGTTCCGCGGCCTTACGGACGACTCGTTGATGACGTTGTTGC-5′P63′-ATGCGCCTGTTCCCGATGACGACGGACGACTCGACG-5′P73′-CGGACTTGCTGCTGTTCTTCCACGACCTTTAGTCGCTGTGGGCG-5′P83′-TGACGCTGTGGTGGTAGTAGTTGATT-5′8条引物之间互补的片段依次相互配对，用DNA聚合酶末端补平，作为PCR扩增的模板，用P1、P8进行PCR扩增，得到完整的北非蝎昆虫毒素基因序列。
3.一种制备北非蝎昆虫毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤将权利要求1所述的北非蝎昆虫毒素基因与表达载体重组，形成重组表达载体；将重组表达载体按常规方法导入适宜的宿主细胞；常规方法培养宿主细胞，收获非蝎昆虫毒素蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，表达载体为pET32a，宿主细胞为大肠杆菌B121细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，表达载体为pSUP106，宿主细胞为荧光假单胞菌A49838细胞。
6.如权利要求1所述的北非蝎昆虫毒素基因人工序列的应用，其特征在于，用于转化荧光假单胞菌，作为新型微生物杀虫剂。
全文摘要
本发明涉及昆虫毒素，尤其涉及昆虫毒素基因的改造和表达。本发明用生物信息学的方法分析和计算密码子的偏好率，依照已公开的北非蝎昆虫毒素的氨基酸序列和大肠杆菌及荧光假单胞菌翻译蛋白质的密码子的偏好，设计北非蝎昆虫毒素的基因序列。该序列能在大肠杆菌及荧光假单胞菌中高效表达。本发明还提供一种转化有北非蝎昆虫毒素基因的荧光假单胞菌，作为一种潜在的新型微生物杀虫剂。利用本发明的北非蝎昆虫毒素基因序列表达的蛋白以及转化荧光假单胞菌得到的基因工程菌，均能够有效抑制甜菜夜蛾幼虫的生长。
文档编号C12P21/02GK1763206SQ20051002883
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月16日 优先权日2005年8月16日
发明者肖明 申请人:上海师范大学