专利名称：一种云芝菌种以及采用该菌种生产云芝胞内糖肽的方法
技术领域：
本发明属于药用微生物发酵领域，具体涉及云芝胞内糖肽生产菌及其发酵培养方法。
背景技术：
云芝胞内糖肽系自药用真菌云芝(Coriolus Versicolor)液体培养菌丝体或从云芝子实体中提取得到的结合蛋白多糖，云芝胞内糖肽具有广泛的药理作用，特别对机体的免疫功能具有调节和增强作用，是一种有效的免疫增强药，已成为治疗免疫功能低下者的药物。云芝胞内糖肽可预防和治疗慢性乙型肝炎、肝硬化等类肝病，可预防和治疗多种肿瘤疾病如肝癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、大肠癌、头颈部癌、妇癌等类恶性肿瘤手术，可降低放、化疗毒副反应，可作为治疗癌症的辅助药品。此外云芝糖肽还具有镇痛、镇静、降血糖、抗乙肝病毒、以及提高抗氧化能力，清除脂质过氧化物作用。云芝胞内糖肽已于1998年被国家卫生部批准为国家II类新药。
云芝胞内糖肽是将天然云芝菌子实体或通过深层发酵培养获得云芝菌丝体，通过粉碎、水煮，过滤去除固体残渣，滤液浓缩至一定体积后，利用多糖溶于水而不溶于醇的特点，将糖肽沉淀醇沉出来。
有关云芝液体发酵有一些文献报道，但由于云芝糖肽是一个多组分复杂体系，糖肽的理化性质、生理活性与分子量有很大关系，如何筛选得到一个优良菌株，如何通过液体发酵，特别是补料发酵及控制pH，以获得大量云芝菌丝体，提取得到较高有效成分含量产品，特别是符合国家药品标准WS-XG-021-2002要求的产品，目前无相关专利报道。
目前云芝菌丝体培养一般采用间歇分批发酵工艺，如中国专利(申请号89105471.5)一种云芝糖肽(PSP)的生产方法中，采用分批发酵的方法，分批发酵其菌体量相对较低，因而云芝胞内糖肽的得率也不高，一般来说其得率不超过1.2克/升发酵液。
中国专利申请号89105471.5中，云芝胞内糖肽的提取，采用发酵醪压滤后得到湿菌丝体，用100C热水浸提3小时；中国专利(申请号90102310.8)“一种云芝多糖提取新工艺”中描述了云芝子实体加水煮沸，在浸出液中加入氢氧化钙，使云芝多糖形成络合物而沉淀析出，再加酸溶解云芝多糖钙络合物沉淀，溶解液中加入乙醇使云芝多糖沉淀；由于菌体破碎不完全，造成云芝胞内糖肽收率不高。
因此，本领域迫切需要改进云芝培养方法以及培养物中云芝胞内糖肽的提取方法，提高产量及收率。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高产云芝胞内糖肽的云芝菌种，弥补现有技术的不足；本发明的另一目的是提供一种通过补料和控制发酵液pH，以提高云芝菌丝体量，进而提高了云芝胞内糖肽产率的发酵方法，解决现有技术菌丝体产量不高、胞内糖肽得率低的问题；本发明的再一目的是提供一种新的云芝胞内糖肽提取方法，以克服现有技术操作时间长，云芝胞内糖肽得率低，以及有效成分含量低的问题。
本发明的第一方面，公开了一种云芝菌株，该云芝菌株是从东北野生云芝子室体中分离得到，已于2004年11月5日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M204081。
所述菌种采集于南京江浦老山树林间，生于栎树的腐木上。
子实体形态特征菌盖扇形至贝壳形，无柄，复瓦状叠生于枯木树干上。体积为1-6×1-10厘米，厚1-3(-4.5)毫米。菌盖革质、薄，表面生有细长绒毛或绒毛，颜色呈灰褐色、灰黄色、灰黑色、灰白色等多种，并排列成2-3钟颜色相间的同心环带，故云芝称杂色云芝，彩绒革盖菌。菌盖边缘薄，完整或波浪状，呈白色或浅色，其下侧无子实层。菌肉白色，半纤维质至木栓质，厚0.5-1(-1.5)毫米，菌盖内部构造由三种形态不同的菌丝组成，即生殖菌丝、骨架菌丝、联络菌丝。菌管面在幼时为白色，渐变成浅黄色或灰色，管口圆形至多角形，每毫米间有3-5个，菌管长0.5-2毫米，管壁薄，全缘。担孢形圆筒形，稍弯曲，光滑无色，5-8×1.5-2.5微米。
菌丝体特征在培养基质上，菌落白色，菌丝绒毛状，质地紧密，紧贴基质上，分泌黄色或浅褐色色繁，菌丝有爬壁现象，培养基表面常出现黄斑，反面浅黄色。显微镜下检验菌丝无色，细长，有分隔，分枝繁茂，菌丝直径3.5微米，菌丝细胞壁上有锁状联合，生长的前、中期锁状联合较多，后期减少。
该菌种在PDA培养基上，28℃培养1-2天，可见有白色菌丝长出，培养4-5天，白色菌丝扩展、稠密；该菌种通过《中国的真菌》(邓叔群科学出版社)文献公开的方法进行鉴定，属于云芝菌种(Coriolus Versicolor)，但是，与常规的云芝菌种有明显的区别，其最主要的区别在于从该菌丝体提取得到云芝胞内糖肽的HPLC图谱与云芝胞内糖肽标准品(中国药品生物制品检定所购得)一致，且有效成分相对含量高。
本发明的第二方面，提供了一种流加式培养云芝培养物的方法，包括如下步骤在发酵罐中接入发酵培养基和种子液，种子液和培养基的体积比百分比为5-20％，种子液和发酵培养基体积为发酵罐总体积的40-80％；种子液培养时间为20-50h，发酵液培养时间为72-144h。
在搅拌转速120-300rpm、通风0.4-1.0v/v/m、温度25-30C条件下发酵培养；按照本发明优选的技术/方案，在起始培养后20-50小时之间，补加pH调节剂和营养物质；pH调节剂为浓度为0.05～0.2N的氢氧化钠，补料后培养基的pH控制在4.5-6.0；营养物质选自重量浓度为1-4％的葡萄糖、重量浓度为0.5-2％玉米浆、重量浓度为0.1-0.6％蛋白胨中的一种或其混合物，营养物质的添加量为发酵培养基的总体积的0.5～6％；继续培养，在起始培养后4-5天，获得含菌丝体的发酵液，即培养物。
其中发酵培养基的组分和含量为(g/l)葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麸皮5-30，蛋白胨1-20，豆饼粉10-40，磷酸氢二钾1-10，硫酸镁0.2-；其中，种子液为菌种CCTCC M204081的斜面培养物经两级液体发酵培养制备斜面菌种培养斜面培养基(g/l)为土豆180～220，葡萄糖5～15，蔗糖5～15，酵母粉0.5～2，琼脂1～3；接种后，26-28℃培养5-6天；一级、二级种子培养种子培养基(g/l)为葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麸皮5-30，蛋白胨1-20，豆饼粉10-20，磷酸氢二钾1-10，硫酸镁0.2-1；接种后培养40-70小时，温度25-30℃，转速150-200rpm。
本发明的第三方面，提供了一种从云芝培养菌丝体中提取云芝胞内糖肽的方法，包括如下步骤(1)板框过滤含菌丝体的发酵液通过板框过滤获得菌丝体，洗涤，去除残留物质；(2)菌丝体破碎板框过滤后得到的菌丝体，加入菌丝体重量3～8倍的水，经高压均质机在400～600Kg/cm2下均质破碎菌丝体；(3)抽提经高压均质破碎的菌丝体，在水中煮沸0.5～2小时，板框过滤，滤饼用95～100℃的沸水洗涤，板框过滤；(4)超滤浓缩滤过液采用截留分子量为0.5～2万，优选1万的超滤膜超滤，体积的浓缩倍数为3-10倍，得到云芝胞内糖肽浓缩液；(5)酒精沉淀加入超滤浓缩液体积的2～5倍的、体积浓度为75～95％的乙醇醇沉，静置6-8小时，收集云芝胞内糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞内糖肽产品。
通过高效液相色谱(HPLC)示差折光检测器检测，所制备的云芝糖肽产品与云芝糖肽标准品出峰时间一致，其总糖、单糖、肽含量等指标，均符合国家药品标准WS-XG-021-2002的要求。
本发明的补料培养云芝菌丝体的方法，通过补料调节发酵液pH值，有利于菌丝体生长和胞内糖肽合成；同时，通过补料补充了菌丝体生长所需的碳源、氮源等营养物质。与分批培养方法相比，本发明的补料培养方法有利于提高菌丝体产量，提高胞内糖肽及胞外糖肽的产率。
本发明的提取云芝糖肽的方法，采用高压均质方法破碎细胞，使胞内糖肽最大程度的释放，减少热水抽提时间，节约能耗，同时可保留有效成分的活性，提高胞内糖肽得率。
本发明的提取云芝糖肽的方法，超滤步骤去除大部分小分子物质，提高了终产品中大分子量多糖等有效成分比例，获得的云芝胞内糖肽产品，其总糖≥35％，还原糖≤10％，肽≥20％，显著提高了产品质量。
图1实施例2的云芝胞内糖肽HPLC图谱。
具体实施例方式
本发明的发明人从全国各地采集了8株云芝菌种，经筛选获得可产生符合国家药品要求的云芝胞内糖肽优良菌株CV-LS。该云芝菌株CV-LS是从老山野生云芝子室体中分离得到，已于2004年11月5日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M204081。
本发明所说的云芝糖肽的国家药品标准WS-XG-021-2002参见“中国药典2000年版”，用于云芝糖肽鉴定的对照品/标准品由中国药品生物制品检定所提供。
本发明中采用的30升全自动不锈钢发酵罐购于无锡三海生化工程有限公司；高压均质机为APV Gaulin Inc.公司的15MR-8TBA型号的产品，也可以采用上海张堰轻工机械厂生产的高压均质机，型号为JHG-Q54-P60。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应理解，实施例只用于具体阐述本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1种子液为菌种CCTCC M204081的斜面培养物经两级液体发酵培养制备斜面菌种培养斜面培养基(g/l)为土豆200，葡萄糖10，蔗糖10，酵母粉0.1，琼脂2；接种后，27℃培养5天；一级、二级种子培养种子培养基(g/l)为葡萄糖30，蔗糖30，玉米粉21，麸皮17，蛋白胨10，豆饼粉15，磷酸氢二钾6，硫酸镁0.6；接种后培养50小时，温度28℃，转速170rpm，获得种子液。
实施例2发酵培养基每升培养基含30g葡萄糖，20g豆饼粉，6g蛋白胨，5g麸皮及无机盐等。30升全自动不锈钢发酵罐(无锡三海生化工程有限公司生产)，装液量22L，121℃灭菌25min，冷却至室温后，接入实施例1的种子液，接种量为10％，搅拌转速200rpm，通风0.8v/v/m，温度27℃、罐压0.5kg/cm2。
培养4天后结束发酵，菌丝体干重为18.50g/l，菌丝体经破壁热水抽提，过滤，减压浓缩，醇沉干燥后，获得1.10g/l胞内糖肽，经检测其总糖为44.57％，肽27.92％，HPLC检测，其出峰时间与标准品相同。其他指标均符合国家药品标准WS-XG-021-2002。云芝胞内糖肽的HPLC图谱见图2。
实施例3发酵培养基每升培养基含30g葡萄糖，20g豆饼粉，6g蛋白胨，5g麸皮及无机盐等。30升全自动不锈钢发酵罐，装液量20L，接种量10％、搅拌转速150rpm、通风1v/v/m、温度26℃、罐压0.5kg/cm2。发酵30h后补加1L重量浓度为20％葡萄糖，同时用0.1N NaOH控制pH为5，培养4.5天后结束发酵，菌丝体干重为28.78g/l，菌丝体经破壁热水抽提，过滤，减压浓缩，醇沉干燥后，获得2.0g/l胞内糖肽，经检测其总糖为55.15％，肽34.42％，HPLC检测，其出峰时间与标准品相同，符合国家药品标准WS-XG-021-2002。
实施例4发酵培养基每升培养基含30g葡萄糖，20g豆饼粉，6g蛋白胨，5g麸皮及无机盐等。30升全自动不锈钢发酵罐，装液量18L，接种量10％、搅拌转速150rpm、通风0.6v/v/m、温度28℃、罐压0.5kg/cm2。发酵48h后补加1.8L重量浓度为20％的葡萄糖水溶液和0.36L重量浓度为10％的蛋白胨水溶液，同时用0.1N NaOH控制pH为4.5，培养5天后结束发酵，菌丝体干重为29.94g/l，菌丝体经破壁热水抽提，过滤，减压浓缩，醇沉干燥后，获得2.20g/l胞内糖肽，经检测其总糖为47.10％，肽37.72％，HPLC检测，其出峰时间与标准品相同，符合国家药品标准WS-XG-021-2002。
实施例5发酵过程采用0.1N NaOH调节控制发酵液pH为5.5，与未控制pH发酵，其胞内糖肽得率比较如表1所示。
表1、发酵过程控制pH对胞内糖肽得率的影响
可见控制pH发酵，胞内糖肽提高近70％，效果显著，控制pH有利于胞内糖肽的合成。
实施例6(1)板框过滤实施例2的含菌丝体的发酵液通过板框过滤获得菌丝体，洗涤，去除残留物质；(2)菌丝体破碎板框过滤后得到的菌丝体，加入菌丝体重量5倍的水，经高压均质机在400Kg/cm2下均质破碎菌丝体；(3)抽提经高压均质破碎的菌丝体，在水中煮2小时，板框过滤，滤饼100℃的沸水洗涤，板框过滤；(4)超滤浓缩滤过液采用截留分子量1万的超滤膜超滤，体积浓缩倍数为5倍，得到云芝胞内糖肽浓缩液；(5)酒精沉淀加入超滤浓缩液的5倍体积的、体积浓度为95％的乙醇醇沉，静置7小时，收集云芝胞内糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞内糖肽产品。其得率见表2。
实施例7～8同实施例6，其中，板框过滤后得到的菌丝体，加入菌丝体重量4倍的水，经高压均质机分别在500和600Kg/cm2下均质破碎菌丝体；其得率如表2所示。
对比实施例1采用实施例6相同的工艺条件，其中，采用常规的机械方法破壁，其得率如表2所示。
表2、高压均质与机械破壁效果比较
由表2可见，高压破壁能使菌丝体破壁完全，明显提高胞内多糖得率，而且热水抽提时间缩短为1小时，能耗降低，降低了成本。
权利要求
1.一种保藏编号为CCTCC M204081的云芝菌株。
2.一种补料培养云芝培养物的方法，其特征在于，包括如下步骤在发酵罐中接种CCTCC M204081的云芝种子培养液，种子液和培养基的体积百分比为5-20％；在搅拌转速120-300rpm、通风0.4-1.0v/v/m、温度25-30℃条件下发酵培养，培养后4-5天，获得含菌丝体的发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在起始培养后20-50小时之间，补加pH调节剂和营养物质，补料后培养基的pH控制在4.5-6.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，pH调节剂为0.05～0.2N的氢氧化钠。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，营养物质选自重量浓度为1-4％的葡萄糖、重量浓度为0.5-2％玉米浆、重量浓度为0.1-0.6％蛋白胨中的一种或其混合物，营养物质的添加量为发酵培养基的总体积的0.5～6％。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的发酵培养基的组分及配比按重量、体积比计，每升培养基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麸皮5-30克，蛋白胨1-20克，豆饼粉10-40克，磷酸氢二钾1-10克，硫酸镁0.2-1克。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的种子液为菌种CCTCCM204081的斜面培养物经两级液体发酵培养的产物；斜面培养基的组分及配比按重量、体积比计，每升培养基含有土豆200克，葡萄糖10克，蔗糖10克，酵母粉1克，琼脂2-2.5％；接种后，26-28℃培养5-6天；一级、二级液体培养的种子培养基的组分及配比按重量、体积比计，每升培养基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麸皮5-30克，蛋白胨1-20克，豆饼粉10-20克，磷酸氢二钾1-10克，硫酸镁0.2-1克，pH自然；接种后培养40-70小时，温度25-30℃，转速150-200rpm。
8.一种从云芝培养菌丝体中提取云芝胞内糖肽的方法，其特征在于，包括如下步骤含菌丝体的发酵液过滤获得菌丝体，洗涤，去除残留物质；加入菌丝体重量3～8倍的水，经高压均质机在400～600Kg/cm2下均质破碎菌丝体；经高压均质破碎的菌丝体，在水中煮沸0.5～2小时，板框过滤，滤饼用95～100℃的沸水洗涤，板框过滤；滤过液采用截留分子量为0.5～2万的超滤膜超滤，体积的浓缩倍数为3-10倍，得到云芝胞内糖肽浓缩液；加入超滤浓缩液体积的2～5倍的、体积浓度为75～95％的乙醇醇沉，静置6-8小时，收集云芝胞内糖肽沉淀，干燥，得到云芝胞内糖肽产品。
全文摘要
本发明属于药用微生物发酵领域，具体涉及云芝胞内糖肽生产菌及其发酵培养方法。发明人筛选得到可产生高含量有效成分的云芝胞内糖肽生产菌种云芝(Coriolus versicolor)CCTCC M204081，并提供了一种通过补料和控制pH优化发酵过程的新方法；本发明还公开了新的从菌丝体提取云芝胞内糖肽的提取工艺。本发明的方法，提高菌丝体量，有利于云芝胞内糖肽的合成，从而提高了云芝胞内糖肽产率。获得的云芝胞内糖肽产品，其总糖≥35％，还原糖≤10％，肽≥20％，主峰的保留时间与对照品主峰的保留时间一致，符合国家药品标准WS－XG－021－2002的要求。
文档编号C12P21/00GK1807573SQ20051011230
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者余晓斌, 胡卫珍, 濮文林 申请人:江南大学, 南京老山药业股份有限公司