专利名称：一种运用现代发酵技术生产高纯度云芝胞内糖肽的方法
技术领域：
本发明属药用微生物发酵领域，具体涉及一种运用现代生物发酵技术从云芝菌丝体中提取高纯度云芝胞内糖肽的生产方法。
背景技术：
云芝系担子菌纲多孔菌目多孔菌科的高等真菌，为传统中药，《本草纲目》记载其具有“扶正固本、补精益气、久食健身、延年益寿”之功效，即现代医学所述的增强机体免疫功能，防治疾病等作用。1970年，日本学者首次报告了由杂色云芝菌(采绒革盖菌Cariolus Versicolov CM-101)的菌丝体中提取一种多糖，定名为PS-K，其功效成分明显高于云芝菌本身，且易于被人体吸收，对小鼠可移植性肉瘤-180的实验治疗，口服或注射均为有效。 1976年，PS-K首先在日本上市，用于增强机体免疫功能，治疗各种恶性肿瘤、白血病、慢性肝炎、肝硬化等症，取得较好的治疗效果。我国于1978年开始对杂色云芝进行系统研究；1981年开始在重庆、北京、上海等地的医学院及医院开展对云芝胞内糖肽(曾用名云芝多糖)的临床疗效观察，证实其具有良好的免疫促进作用；1986年，我们成功利用现代生物技术，采用深层发酵培养获得云芝菌丝体，并采用科学方法提取其细胞内活性物质，开始了我国云芝胞内糖肽的工业化生产。据目前公布的云芝胞内糖肽的相关中国专利，其提供了多种云芝胞内糖肽的生产和提取方法，主要集中在提高云芝胞内糖肽的产率上，采用依靠提高终产品中大分子量多糖的比例，从而提取出更多的云芝胞内糖肽产品。但是，根据我国多家核心医学和药学期刊发表的相关药理药效及临床研究论文显示云芝胞内糖肽具有增强人体免疫功能、保护肝脏细胞、抑瘤、抗衰老、抗感染、抗溃疡、抗炎、抗伤害、抗流感病毒、降血脂、镇痛、改善学习记忆功能等多重复合作用，而当对某云芝胞内糖肽样品进行水解后发现，其多糖及蛋白质(肽)分解成单糖和氨基酸，多糖由下列6种单糖组成葡萄糖15. 8%，甘露糖2. 8%， 半乳糖2.7%，核糖1.6%，岩藻糖1.2%，木糖1.0%，总糖量为25. 1% ；蛋白质由下列15 种氨基酸组成天门冬氨基酸2.77%，苏氨酸0. 74 %，丝氨酸1.01%，谷氨酸4. 16 %，脯氨酸0. 48 %，甘氨酸1.7%，丙氨酸1. 57 %，胱氨酸0. 31 %，缬氨酸0. 77 %，蛋氨酸0. 07 %， 异亮氨酸0. 56 %，酪氨酸0.沈％，苯丙氨酸0. 47 %，组氨酸0. 46 %，精氨酸2. 79 %，总量为 19.6% ；化学结构葡萄糖多以α_1、4，α_1、2，β _1、6糖苷键和以谷氨酸、天门冬氨基酸为主的小分子蛋白质(肽)相结合，成为一种蛋白多糖(多糖肽)；而同时，研究人员在临床上给患者服用上述6种单糖和15种氨基酸，却未见与云芝胞内糖肽相同的功效，可见云芝胞内糖肽的分子结构具有特殊性。据2002年香港中文大学的相关研究报告云芝胞内糖肽中真正的药效成分是可供人体吸收的肽葡聚糖(多糖肽)，其可以穿过人体肠脏，被人体吸收，刺激白血球细胞生长和增强其他免疫功能，而多糖体的分子大，很难被肠脏吸收，因此难以有效发挥作用。因此，提高云芝胞内糖肽中的肽葡聚糖的含量，才是提高该药物产品质量和临床疗效的关键，单纯提高多糖、特别是大分子量多糖的含量没有更大的临床应用价值。
因此，本领域亟需改进云芝胞内糖肽的生产方法，提高肽葡聚糖(多糖肽)的纯度和含量，使之符合国家药品标准并达到日本同类产品的品质要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的云芝胞内糖肽的发酵方法，通过连续流加补料和控制发酵搅拌转速，提高云芝菌丝体量，提高了胞内糖肽的有效成分，同时提高了产量。本发明的另一目的是提供新的云芝胞内糖肽的提取方法，以克服现有技术中云芝胞内糖肽收率低的问题，从而提高多糖含量。本发明的再一目的是提供新的云芝胞内糖肽的干燥工艺，以克服现有干燥技术对云芝胞内糖肽中多糖体的破坏，提高可吸收多糖体的含量。本发明所提供的新的发酵方法，其生产步骤及特征如下1、菌株培育步骤从所转让得到的一株云芝菌株，经筛选复壮后获得一株优良菌株CVDX-I，该菌株适合深层通气发酵，对培养基的适应性强，可用廉价的黄豆饼粉、豆粕粉、花生饼粉为碳源， 以及麦芽糖、葡萄糖为碳源，从而为提高云芝胞内糖肽的有效成份的含量奠定了基础条件。2、发酵培养步骤采用三级通气发酵法生产云芝菌丝体，发酵培养流程包括(1)试管斜面培养；(2) 母瓶种子培养；(3)小罐培养(一级)；中罐培养(二级)；( 大罐培养(三级)。具体实施如下(1)斜面培养斜面培养基按重量/体积比计，葡萄糖2%、酵母膏0. 5%、琼脂1. 5 2%，饮用水配制，PH自然。119 123°C灭菌30分钟，把保存菌株CVDX-I接到培养基上，在25-29°C 培养箱内，培养6 7天。(2)母瓶培养培养基组成葡萄糖2.0%、酵母粉1.0%、廿氨酸0.2%、硫酸镁0.5%、硫酸锌 0.5%，饮用水配制，PH自然。119 123°C灭菌30分钟，接种后置于培养室内往复摇床上 (60次/分)培养5 6天，培养温度25 。(3)小罐、中罐培养培养基组成葡萄糖1.5%，黄豆粉1.5%，糊精10%，硫酸镁0.5%，磷酸二氢钾 0.5%，碳酸钙0.2%。119 123°C灭菌30分钟，投料量50 70%，接种量5 10%，罐温 25 四°〇，通气量1 0. 3 1 0. 5 (V/V)，培养时间15 20小时。(4)大罐培养119 123°C温度条件下培养基灭菌30分钟，投料量50 70 %，接种量5 10 %， 罐温25 ，通气量1 0. 3 1 0. 5 (V/V)，搅拌转速50 200rpm，接种后，搅拌转速由高到低逐渐降低。接种后培养M 48小时之间开始补料，补料量为发酵培养基总体积的1 5 %，补料液重量浓度为葡萄糖5 10 %，黄豆粉2 4 %，蛋白胨1 2 %，培养时间3 6天。本发明所提供的新的提取方法，以及所提供的新的干燥工艺，其提取-干燥的生产流程及特征包括(1) 一次压滤；(2)水解；(3) 二次压滤；(4)浓缩；(5)沉降；(6)低温干燥；(7)粉粹；⑶混合包装、成品。具体实施如下1、发酵液一次压滤发酵液经过板框压滤后，胞外液排地沟，滤饼运入水解罐进行水解。2、水解水解罐内加饮用水，加量为滤饼体积的3 5倍，用蒸汽加热，温度93 95°C，罐内增压0. 12 0. 15Mpa，保温2 3小时后过滤。3、二次压滤水解液经压滤机压滤后，滤液打入滤液贮桶待浓缩。4、浓缩在浓缩罐内采用真空蒸汽加热浓缩，真空度0. 06 0. 07Mpa，浓缩液浓度达到35 65%。5、沉降在浓缩液中加入乙醇搅拌均勻后静置3 4小时抽去酒精母液，将结晶体进行干燥。6、在-40 _30°C的温度下干燥后粉碎，混合包装。本发明的生产方法，通过采用菌种改造得到可产高含量有效成分的云芝胞内糖肽生产菌种；采用液体深层通气发酵，通过大罐发酵时连续流加补料和变频变速调节优化发酵过程，既补充了菌丝生长和代谢所需的碳源、氮源等营养物质，又不因分批补料而破坏菌丝生长和代谢的环境，有利于菌丝体胞内多糖和肽的有效成份的合成；同时大罐发酵时通过变频变速搅拌，合理调节菌丝生长和代谢所需的容氧，既可节约电能，有利于菌丝体和胞内多糖和肽的产率；提取工艺采用加压高温方法破碎菌丝细胞壁，以最快最大程度释放菌丝体胞内物，减少加热提取时间，保留有效成分的活性，节约能源；采用低温干燥工艺得到成品，提高了多糖肽的收率。本发明有利于菌丝体的生长和云芝胞内糖肽的合成， 提高了云芝胞内糖肽的收率和质量，产品总糖彡35%，还原糖彡10%，肽彡20%，产率达到3g/L，且主峰的保留时间与日本同类药品PSK的主峰保留时间一致，符合国家药品标准 WS-XG-02-2002 的要求。
图1为本发明提供的发酵培养流程，图2为本发明提供的提取-干燥流程，图3为实施例1的云芝胞内糖肽的HPLC图谱，图4为实施例2的云芝胞内糖肽的HPLC图谱。
具体实施例方式本发明人所述的云芝胞内糖肽的国家药品标准WS-XG-021-2002参见《中国药典》 2000年版，用于云芝胞内糖肽鉴定的对照品/标准品由中国药品生物制品检定所提供。以下结合实施例对本发明的做进一步的说明，应当理解，此处所描述的优选实例仅用于具体阐述本发明，并不用于限定本发明。实施例1种子液由菌种CVDX-I的斜面培养物经两层液体通气发酵培养制备。斜面培养基(g/L)葡萄糖20、酵母膏5、琼脂15，饮用水配制，PH自然。119°C温度条件下灭菌30分钟，把保存菌株CVDX-接到培养基上，在25°C培养箱内，培养7天。母瓶培养基(g/L):葡萄糖20、酵母粉10、廿氨酸2、硫酸镁5、硫酸锌5，饮用水配制，PH自然。119°C灭菌30分钟，接种后置于培养室内往复摇床上(60次/分)培养6天，培养温度25 °C。小罐培养基(g/L)葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙2。119°C灭菌30分钟，10升全自动不锈钢发酵罐，投料量5L，接种量为5%，罐温25°C， 通气量1 0. 3(V/V)，培养时间20小时。中罐培养(g/L)葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙 2。119°C灭菌30分钟，30升全自动不锈钢发酵罐，投料量15L，接种量为5%，罐温25°C，通气量1 0. 3(V/V)，培养时间20小时。大罐培养基葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙2。 119°C灭菌30分钟，500升全自动不锈钢发酵罐，投料量250L，接种量5%，罐温25°C，通气量1 0. 3 (V/V)，搅拌转速50rpm，接种后，搅拌转速由高到低逐渐降低，接种后培养48 小时之间开始补料，补料量为发酵培养基总体积的1%，补料液重量浓度(g/L)为葡萄糖 12. 5，黄豆粉5，蛋白胨2. 5，培养时间6天。提取-干燥发酵液一次压滤——发酵液经过板框压滤后，胞外液排地沟，滤饼运入水解罐进行水解；水解——水解罐内加饮用水，加量为滤饼体积的3倍，用蒸汽加热，温度92°C，罐内增压0. 12Mpa,保温3小时后过滤；二次压滤——水解液经压滤机压滤后，滤液打入滤液贮桶待浓缩；浓缩——在浓缩罐内采用真空蒸汽加热浓缩，真空度0. 06Mpa，浓缩液浓度达到35% ；沉降——在浓缩液中加入乙醇搅拌均勻后静置3小时抽去酒精母液，将结晶体在-30°C温度下进行干燥。获得3g/L的云芝胞内糖肽，经检测其总糖为37. 9%，还原糖为9. 1 %，肽27. 8%，HPLC检测，其主峰的保留时间与标准品一致，并与日本PS-K样品的主峰保留时间一致，符合国家药品标准WS-XG-02-2002的要求。实施例2种子液由菌种CVDX-I的斜面培养物经两层液体通气发酵培养制备。斜面培养基(g/L)葡萄糖20、酵母膏5、琼脂15，饮用水配制，PH自然。122°C温度条件下灭菌30分钟，把保存菌株CVDX-I接到培养基上，在培养箱内，培养5天。母瓶培养基(g/L):葡萄糖20、酵母粉10、廿氨酸2、硫酸镁5、硫酸锌5，饮用水配制，PH自然。123°C灭菌30分钟，接种后置于培养室内往复摇床上(60次/分)培养5天， 培养温度^°C。小罐培养基(g/L)葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙2。122V灭菌30分钟，10升全自动不锈钢发酵罐，投料量7L，接种量为10%，罐温， 通气量1 0. 5 (V/V)，培养时间16小时。中罐培养(g/L)葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙 2。122°C灭菌30分钟，30升全自动不锈钢发酵罐，投料量21L，接种量为10%，罐温， 通气量1 0. 5 (V/V)，培养时间16小时。大罐培养基葡萄糖15、黄豆粉15、糊精100、硫酸镁5、磷酸二氢钾5、碳酸钙2。 122°C灭菌30分钟，500升全自动不锈钢发酵罐，投料量350L，接种量10%，罐温，通气量1 0. 5 (V/V)，搅拌转速IOOrpm，接种后，搅拌转速由高到低逐渐降低，接种后培养M小时之间开始补料，补料量为发酵培养基总体积的5%，补料液重量浓度(g/L)为葡萄糖50， 黄豆粉20，蛋白胨5，培养时间4天。提取-干燥发酵液一次压滤——发酵液经过板框压滤后，胞外液排地沟，滤饼运入水解罐进行水解；水解——水解罐内加饮用水，加量为滤饼体积的5倍，用蒸汽加热，温度95°C，罐内增压0. 15Mpa,保温2小时后过滤；二次压滤——水解液经压滤机压滤后，滤液打入滤液贮桶待浓缩；浓缩——在浓缩罐内采用真空蒸汽加热浓缩，真空度0. 07Mpa，浓缩液浓度达到60% ；沉降——在浓缩液中加入乙醇搅拌均勻后静置3小时抽去酒精母液，将结晶体在-40°C温度下进行干燥。获得3. lg/L的云芝胞内糖肽，经检测其总糖为38. 5%, 还原糖为9.4%，肽沈.2%，朋^检测，其主峰的保留时间与标准品一致，并与日本PS-K样品的主峰保留时间一致，符合国家药品标准WS-XG-02-2002的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种云芝胞内糖肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤经筛选复壮后获得一种编号为CVDX-I的优良菌株，在发酵罐中接种CVDX-I云芝种子培养液，接种量5 10% ；在罐温25 ^°C，通气量1 0. 3 1 0. 5 (V/V)、搅拌转速 50 200rpm的条件下发酵培养，培养3 6天，获得云芝菌丝体发酵液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在起始接种培养M 48小时之间开始补料，补料量为发酵培养基总体积的1 5%。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，补料液重量浓度为葡萄糖5 10%，黄豆粉2 4%，蛋白胨1 2%。
4.一种从云芝菌丝体中提取云芝胞内糖肽的方法，其特征在于，包括如下步骤将含云芝菌丝体的发酵液经第一次压滤后，进行水解，制成水解液；将水解液进行第二次压滤，所得液体放置入浓缩罐，采用真空加热进行浓缩，制成云芝胞内糖肽浓缩液；在浓缩液中加入乙醇搅拌均勻后，静置3 4小时，抽去酒精母液，制成云芝胞内糖肽结晶体；将云芝胞内糖肽结晶体在低温下进行干燥，粉碎，制得高纯度云芝胞内糖肽产品。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述水解工艺流程的温度在93 95°C，罐内增压0. 12 0. 15Mpa，保温2 3小时。
6.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述低温干燥工艺流程系在-40 -30°C条件下进行。
全文摘要
通过提供一种新的云芝胞内糖肽的现代生物发酵方法，即在生产过程中采用连续流加补料和控制发酵搅拌转速，提高云芝菌丝体量，同时采用新的提取方法，以克服现有技术中云芝胞内糖肽收率低等问题，从而能有效提高云芝胞内糖肽的收率和产量。在干燥步骤中采用低温干燥工艺，克服了现有高温干燥技术对云芝胞内糖肽中多糖肽的破坏，提高了可吸收多糖肽的含量，使其能达到国家质量标准的要求，并达到日本同类产品的质量标准。
文档编号C12R1/645GK102296098SQ20101021028
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者周俊渝, 赵德 申请人:北大国际医院集团有限公司, 北大国际医院集团重庆大新药业股份有限公司