专利名称：：Walker-256细胞株在创建骨肿瘤痛模型中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及骨肿瘤痛模型的制作，特别是应用Walker-256细胞林创建骨肿瘤痛模型。(二)
背景技术：
：骨癌痛是癌症病人最常见的一种疼痛，约三分之一的晚期癌症病人都会发生骨转移。肿瘤引起的疼痛严重影响了患者的生活质量。虽然治疗骨癌痛有化疗、放疗、三阶梯疗法及二磷酸盐等多种手段，但由于存在疗效短暂和药品不良反应等问题，仍有相当一部分癌痛得不到理想控制。发展新疗法的关4定在于对癌痛发病机制的正确认识，然而由于长期以来缺乏相应的动物模型，阻碍了对癌痛发生机制的认识及抗癌痛药物的研发。近几年来国外相继有了股骨、肱骨、跟骨和胫骨癌痛动物模型成功建立的报道，为认识人类骨癌痛的机制以及筛选治疗性药物提供了很好的工具。但在国内，由于受到造模用细胞抹来源的限制，癌痛模型复制仍然成为相关课题的究的障碍。国外报道成功建立的骨癌痛模型主要应用两种瘤细胞抹，即NCTC2472纤维肉瘤细胞抹和MRMT-1大鼠乳腺癌细胞抹，然而，这两种细胞在国内很难获得，限制了癌痛模型的复制及相关课题的研究。因此，如何应用国内易得的瘤抹建立稳定癌痛模型具有重要的现实意义和科研价值。资料显示，具有较好的骨侵袭能力，但该细胞林来源于大鼠原发性乳腺癌组织，至今没有报道表明可利用Walker-256癌细胞林制作骨肿瘤痛模型。(三)
发明内容本发明目的是为解决国内骨肿瘤痛模型制作中受到的细胞抹限制，提供Walker-256细胞抹在创建骨肿瘤痛模型中在的应用。为达到发明目的本发明采用的技术方案是Walker-256细胞抹在创建骨肿瘤痛冲莫型中的应用。Walker-256细胞抹在创建大鼠骨肿瘤痛模型中的应用。所述的Walker-256细胞林创建骨肿瘤痛模型为将动物麻醉后，后肢剪毛，皮肤消毒，将胫骨上段的皮肤切开小口以暴露胫骨，在胫骨上穿刺打孔至骨髓，再注射入2jiL5iiL含4x103~4x106个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，用无菌生理盐水沖洗，皮肤缝合，在创口处滴撒抗感染药，继续饲养10~14天即建成骨肿瘤痛模型。所述的动物优选为大鼠。所述的大鼠优选SD或Wistar雌性大鼠，清洁级，体重100~200克。具体的，所述的大鼠经质量浓度3%的戊巴比妥钠麻醉后，后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约lcm小口，小心暴露胫骨，先用5mL或10mL注射器针头穿刺打孔至骨髓，然后换用5pL或IOjiL微量注射器进入骨髓腔，緩慢注入4pL含4x104个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水沖洗，皮肤缝合，在创口处滴4敎少许庆大霉素注射液，继续饲养10~14天即建成骨肿瘤痛才莫型。穿刺打孔时不可将对侧骨皮质穿透，且注射完癌细胞后应迅速用骨蜡封住针孔止血，否则均会导致癌细胞在骨外生长，易致造模失败。在整个操作过程中应注意的问题是，所述的W256癌细胞的生理盐水细胞悬液应于冰块上低温放置，06。C温度条件，每次抽取时要摇匀，在6小时内使用，推荐在23小时内用，否则会影响癌细胞的活力。所述的Walker-256细胞抹创建骨肿瘤痛模型在注意在无菌条件下进行，熟练轻巧的动作也是保证造模成功的重要因素。本发明所述的应用Walker-256癌细胞抹已成功创建大鼠骨肿瘤痛模型。该肿瘤痛模型的创建，将为肿瘤痛相关课题的研究，尤其是筛选抗肿瘤痛中药及其复方提供一个有用的工具；并且该细胞林来源于大鼠原发性乳腺癌组织，因而应用该瘤细胞建立骨肿瘤痛模型可视为乳腺癌骨转移模型，具有重要的科研价值和应用前景。(四)图1为实施例1模型组造模第7天的大鼠胫骨X线片；图2为实施例l模型组造模第14天的大鼠胫骨X线片；图3为实施例1模型组造模第21天的大鼠胫骨X线片；图4为实施例1假手术组的大鼠胫骨X线片；图5为实施例1模型组造模第7天的大鼠胫骨切片；图6为实施例1模型组造模第14天的大鼠胫骨切片；图7为实施例1模型组造模第21天的大鼠胫骨切片；图8为实施例1假手术组的大鼠胫骨切片。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:1.材料和方法瘤林Walker-256大鼠腹水癌细胞抹，由浙江医学科学院提供；动物SD雌性大鼠，清洁级，体重140-160克，由浙江中医药大学实验动物中心提供；主要仪器XZC-2B型自控温度热板仪(山东医学科学院生产)，XZC-A型压力测痛仪(山东医学科学院生产)，高频乳腺摄片机(意大利产)；造才莫方法模型组将大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约lcm小口，小心暴露胫骨，先用5ml注射器针头穿刺打孔，然后换用5pl微量注射器进入骨髓腔，緩慢注入4iaL含4x104个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水沖洗，皮肤缝合，在创口处滴撒少许庆大霉素注射液以防感染；对照组:将大鼠左侧胫骨上段注入等体积的生理盐水,其余操作同模型组。2.指标测定2.1行为学分别于手术前及手术后第7、12、15、18、21天用大鼠热板法和足趾加压法测量热刺激和机械刺激痛阈。热刺激先将热板仪调节温度至52。C土0.1。C，然后将大鼠放置在热板上，待出现添后足时所需要的时间值(秒)即为该动物的痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的热刺激痛阈值，筛选基础痛阈在10秒-30秒的动物用于实验；机械刺激:将大鼠左后足掌置于压力测痛仪压力针下，按动电动按钮，使压力摇杆旋动，随摇杆的旋动大鼠足掌压痛点压力逐渐增加，以缩足或嘶叫为痛反应，出现痛反应时的重量值(x10g)即为该动物的机械刺激痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的机械刺激痛阈值。2.2放射学于造模后第7、14天分别随机抽取每组大鼠2~4只，第21天收集全部剩余大鼠双侧后肢，进行X线摄片，评估肿瘤诱发的骨破坏程度。放射学评分标准如下0分正常的骨结构，无任何骨质破坏的征象；1分在胫骨近骺端注射部位附近，见小的放射性的骨质缺损病灶(数量少于3个)；2分髓质骨缺损放射性病灶增多(大于3个)；3分髓质骨缺失，同时皮质骨受侵；4分单面的骨皮质完全缺损；5分双面的骨皮质缺失，移位性骨折。23组织学将X线摄片后的大鼠后肢进行修剪，留下胫骨及少许软组织，先用4%中性甲酪液固定1周，再在含10%曱酸的多聚甲醛固定液中脱钙1周，石蜡切片，HE染色，镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。统计学处理采用SPSS10.0软件进行方差分析，以PO.05为差异标准。3.结果3.1行为学热刺激(见表l):与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现热刺激痛阈明显下降(PO.Ol)，以后逐渐降低，其中术后第18天和第21天痛阈与第12天比较均有差异显著(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现热痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。表1:两组大鼠不同时间点热刺激痛阈的变化(5±s)(单位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>机械刺激(见表2):与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现机械刺激痛阈明显下降(PO.01),并随时间推移逐渐降低，其中术后第21天痛阈较第12天进一步降低(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现机械性痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。表2:两组大鼠不同时间点机械刺激痛阈的变化(^土s)(单位10g<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与基础痛阈比较"表示PO.Ol,与第12天比较1表示P〈0.053.2放射学大鼠胫骨X线片显示，模型组大鼠左侧胫骨随造模时间的推移逐渐出现明显的骨质破坏，且骨破坏的程度与造模时间成正相关。造模第7天的X线片仅见注射部位松质骨有小的放射性缺损病灶(见图1,评分为1,范围0~2);第14天，X线示+〉质骨放射性病灶增多，同时骨皮质有明显缺损病灶(见图2，评分为3，范围24);到第21天，骨破坏进一步加重,骨皮质完全缺失，病灶范围扩大，部分胫骨已出现病理性骨折(见图3，评分为4，范围3~5)。而假手术组胫骨X线片未显示明显的骨质破坏(见图4,评分为0)。3.3组织学:造;f莫第7天的胫骨切片显示，骨髓腔内及骨小梁间见大量活跃的肿瘤细胞生长，骨小梁破坏较轻，骨皮质仍完整(见图5);造模第14天，骨髓腔内充满了肿瘤细胞，大部分呈活跃状态，骨小梁破坏加重，骨皮质受侵，变薄，局部可见新生编织骨形成(见图6);造模第21天，骨髓腔完全被肿瘤细胞所填充，中央大部分肿瘤细胞已退变坏死，而在骨髓腔的边缘部分，肿瘤细胞多呈活跃状态，肿瘤向外生长，骨小梁和骨皮质均完全被破坏(见图7)。而假手术组各时间点大鼠胫骨切片显示，骨髓腔内见各种正常的骨髓细胞，未见其他骨结构的改变(见图8)。实施例2:1.材津牛和方法瘤抹Walker-256大鼠腹水癌细胞抹，由浙江医学科学院提供；动物SD雌性大鼠，清洁级，体重150-180克，由浙江中医药大学实验动物中心提供；主要仪器XZC-2B型自控温度热板仪(山东医学科学院生产)，XZC-A型压力测痛仪(山东医学科学院生产)，高频乳腺摄片机(意大利产)；造模方法模型组将大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约lcm小口，小心暴露胫骨，先用5ml注射器针头穿刺打孔，然后换用5^d微量注射器进入骨髓腔，緩慢注入4ML含4x103个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水沖洗，皮肤缝合，在创口处滴撒少许庆大霉素注射液以防感染；对照组将大鼠左侧胫骨上段注入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。2.指标测定2.1行为学分别于手术前及手术后第7、12、15、18、21天用大鼠热板法和足趾加压法测量热刺激和机械刺激痛阈。热刺激先将热板仪调节温度至52。C士0.rC，然后将大鼠放置在热板上，待出现添后足时所需要的时间值(秒)即为该动物的痛阈值，每只大鼠领寸3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的热刺激痛阈值，筛选基础痛阈在10秒-30秒的动物用于实验；机械刺激:将大鼠左后足掌置于压力测痛仪压力针下，按动电动按钮，使压力摇杆旋动，随摇杆的旋动大鼠足掌压痛点压力逐渐增加，以缩足或嘶叫为痛反应，出现痛反应时的重量值(x10g)即为该动物的机械刺激痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的机械刺激痛阈值。2.2放射学于造模后第14天随机抽取每组大鼠2只，第21天收集全部剩余大鼠双侧后肢，进行X线摄片，评估肿瘤诱发的骨破坏程度。放射学评分标准如下0分正常的骨结构，无任何骨质破坏的征象；1分在胫骨近骺端注射部位附近，见小的放射性的骨质缺损病灶(数量少于3个)；2分髓质骨缺损放射性病灶增多(大于3个)；3分髓质骨缺失，同时皮质骨受侵；4分单面的骨皮质完全缺损；5分双面的骨皮质缺失，移位性骨折。2.3组织学将X线摄片后的大鼠后肢进行修剪，留下胫骨及少许软组织，先用4%中性甲酪液固定1周,再在含10%甲酸的多聚甲醛固定液中脱4丐1周,石蜡切片，HE染色，镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。统计学处理采用SPSS10.0软件进行方差分析，以P<0.05为差异标准。3.结果3.1行为学热刺激(见表3:与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现热刺激痛阈明显下降(P<0.01)，以后逐渐降低，其中术后第18天和第21天痛阈与第12天比较均有差异显著(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现热痛觉过^:，且呈渐进性加强趋势。表3:两组大鼠不同时间点热刺激痛阈的变化(5土s)(单位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与基础痛阈比较**表示P<0.01机械刺激(见表4):与造模前的基础痛阈相比，模型组第12天开始，大鼠出现机械刺激痛阈明显下降(P<0.01),并随时间推移逐渐降低，其中术后第21天痛阈较第12天进一步降低(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第12天已出现机械性痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。表4:两组大鼠不同时间点机械刺激痛阈的变化(5士s)(单位10g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与基础痛阈比4交**表示P<0.013.2放射学大鼠胫骨X线片显示，模型组大鼠左侧胫骨随造模时间的推移出现明显的骨质破坏。造模第14天的X线片可见注射部位松质骨有小的放射性缺损病灶(评分为1,范围02);第21天，X线示杠、质骨放射性病灶明显增多，同时骨皮质有明显缺损病灶(评分为3,范围2~4)。而假手术组胫骨X线片未显示明显的骨质破坏(评分为0)。3.3组织学造模第14天的胫骨切片显示，骨髓腔内及骨小梁间见活跃的肿瘤细胞生长，骨小梁破坏较轻，骨皮质完整；第21天，骨髓腔内充满了肿瘤细胞，骨小梁破坏加重，骨皮质受侵，变薄，局部可见新生编织骨形成。实施例3:1.材料和方法瘤抹Walker-256大鼠腹水癌细胞抹，由浙江医学科学院提供；动物SD雌性大鼠，清洁级，体重150-180克，由浙江中医药大学实验动物中心提供；主要仪器XZC-2B型自控温度热板仪(山东医学科学院生产)，XZC-A型压力测痛仪(山东医学科学院生产)，高频乳腺摄片机(意大利产)；造模方法模型组将大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，腹部朝上，左侧后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约lcm小口，小心暴露胫骨，先用5ml注射器针头穿刺打孔，然后换用5Kil微量注射器进入骨髓腔，緩慢注入4HL含4x106个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水冲洗，皮肤缝合，在创口处滴撒少许庆大霉素注射液以防感染；对照组:将大鼠左侧胫骨上段注入等体积的生理盐水,其余操作同模型组。2.指标测定2.1行为学分别于手术前及手术后第7、10、12、15天用大鼠热板法和足趾加压法测量热刺激和机械刺激痛阈。热刺激先将热板仪调节温度至52。C士0.rC,然后将大鼠放置在热板上，待出现添后足时所需要的时间值(秒)即为该动物的痛阈值，每只大鼠观'J3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的热刺激痛阈值，筛选基础痛阈在10秒-30秒的动物用于实验；机械刺激:将大鼠左后足掌置于压力测痛仪压力针下，按动电动按钮，使压力摇杆旋动，随摇杆的旋动大鼠足掌压痛点压力逐渐增加，以缩足或嘶叫为痛反应，出现痛反应时的重量值(xiog)即为该动物的机械刺激痛阈值，每只大鼠测3次，间隔5分钟以上，取3次均值作为该动物的机械刺激痛阈值。2.2放射学于造模后第10天随机抽取每组大鼠2只，第15天收集全部剩余大鼠双侧后肢，进行X线摄片，评估肿瘤诱发的骨破坏程度。放射学评分标准如下0分正常的骨结构，无任何骨质破坏的征象；1分在胫骨近骺端注射部位附近，见小的放射性的骨质缺损病灶(数量少于3个)；2分髓质骨缺损放射性病灶增多(大于3个)；3分髓质骨缺失，同时皮质骨受侵；4分单面的骨皮质完全缺损；5分双面的骨皮质缺失，移位性骨折。2.3组织学将X线摄片后的大鼠后肢进行修剪,留下胫骨及少许软组织，先用4%中性曱醛液固定1周,再在含10%曱酸的多聚曱醛固定液中脱钙1周，石蜡切片，HE染色,镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。统计学处理采用SPSS10.0软件进行方差分析，以PO.05为差异标准。3.结果3.1行为学热刺激(见表5):与造模前的基础痛阈相比，模型组第IO天开始，大鼠出现热刺激痛阈明显下降(P<0.01),并逐渐降低，其中术后第15天与第IO天比较有显著差异(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第IO天已出现热痛觉过敏，且呈渐进性加强趋势。表5:两组大鼠不同时间点热刺激痛阈的变化(^土s)(单位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>与基础痛阈比较"表示PO.Ol，与第10天比较A表示P0.05机械刺激(见表6):与造模前的基础痛阔相比，模型组第IO天开始,大鼠出现机械刺激痛阈明显下降(PO.01),并随时间推移逐渐降低，其中术后第15天痛阈较第IO天进一步降低(P<0.05)。而假手术组大鼠术后各时间点痛阈与术前基础痛阈比较均无差异。提示，造模大鼠从第10天已出现机械性痛觉过^t，且呈渐进性加强趋势。表6:两组大鼠不同时间点机械刺激痛阈的变化(；土s)(单位10g)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>与基础痛阈比较"表示PO.01;与第10天比较A表示P0.053.2放射学大鼠胫骨X线片显示，模型组大鼠左侧胫骨随造模时间的推移出现明显的骨质破坏。造模第IO天的X线片可见松质骨明显放射性病灶，同时骨皮质有轻微缺损病灶(评分为2,范围13)。造模第15天的X线片显示松质骨破坏严重，骨皮质有缺损病灶明显扩大(评分为3，范围2~4)。而假手术组胫骨X线片未显示明显的骨质破坏(评分为0)。3.3组织学造模第IO天的胫骨切片显示，骨髓腔内及骨小梁间见大量活跃的肿瘤细胞生长，骨小梁明显破坏，骨皮质较完整；第15天，骨髓腔内充满了肿瘤细胞，骨小梁破坏严重，骨皮质大范围受侵，变薄，局部可见新生编织骨形成。权利要求1.Walker-256细胞株在创建骨肿瘤痛模型中的应用。2.如权利要求l所述的应用，其特征在于Walker-256细胞抹在建立大鼠骨肿瘤痛模型中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的Walker-256细胞抹创建骨肿瘤痛模型为将动物麻醉后，后肢剪毛，皮肤消毒，将胫骨上段的皮肤切开小口以暴露胫骨，在胫骨上穿刺打孔至骨髓，再注射入2nL5luL含4xloS4x1(^个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液,注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，用无菌生理盐水冲洗，皮肤缝合，在创口处滴撒抗感染药，继续饲养1014天即建成骨癌痛模型。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的动物为大鼠。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的大鼠为SD或Wistar雌性大鼠，清洁级，体重100200克。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，后肢剪毛，皮肤消毒，在胫骨上段将皮肤切开约lcm小口，小心暴露胫骨，先用5ml或10mL注射器针头穿刺打孔至骨髓，然后换用5jil或10pl微量注射器进入骨髓腔，緩慢注入4jiL含4x104个W256癌细胞的生理盐水细胞悬液，注射完毕后迅速用骨蜡封住针孔，无菌生理盐水冲洗，皮肤缝合，在创口处滴撒庆大霉素注射液，继续铜养10~14天即建成骨肿瘤痛模型。7.如权利要求3~6之一所述的应用，其特征在于所述的W256癌细胞的生理盐水细胞悬液使用前摇匀，并在6小时内使用。8.如权利要求3-6之一所述的应用，其特征在于所述的Walker-256细胞抹创建骨肿瘤痛模型在无菌条件下进行。全文摘要本发明提供了Walker-256细胞株在创建骨肿瘤痛模型中的应用，尤其是在创建大鼠骨肿瘤痛模型中的应用。本发明所述的应用Walker-256癌细胞株已成功创建大鼠骨肿瘤痛模型。该肿瘤痛模型的建立，将为肿瘤痛相关课题的研究，尤其是筛选抗肿瘤痛中药及其复方提供一个有用的工具；并且该细胞株来源于大鼠原发性乳腺癌组织，因而应用该瘤细胞创建骨肿瘤痛模型可视为乳腺癌骨转移模型，具有重要的科研价值和应用前景。文档编号C12N5/06GK101191123SQ20061015495公开日2008年6月4日申请日期2006年12月1日优先权日2006年12月1日发明者严继贵,俞丽霞,王泽时申请人:浙江中医药大学