一种右旋生物素中间体内酯的制备方法

专利名称：：一种右旋生物素中间体内酯的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种右旋生物素中间体内酯的制备方法，尤其是一种以外消旋生物素中间体内酉旨(tetrahydro-l,3陽bis(phenylmethy1)-1H-Furo[3,4-d]imidazole-2,4-dione)水解后得到的外消旋有机酸(l,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)为反应底物，在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯的方法。(二)
背景技术：
：生物素(Biotin)[CAS:5828525]又名维生素H(VitaminH)或维生素B7和辅酶R(CoenzymeR),是一种重要水溶性B簇维生素。生物素广泛应用于医疗、多维制剂及饲料添加剂方面，尤其是配制饲料的关键组分之一。生物素是脂肪酸合成和糖代谢羧化酶的辅酶，是整个生物界所必需的，在糖质新生和氨基酸代谢中也相当重要。除了一部分细菌，酵母和植物能自身合成生物素外，几乎所有的动物和一部分微生物都要从外源获得生物素。生物素用途广泛，20-30%用于医用原料，50%用于饲料，另外还用作化妆品原料等等。A生物素在世界上的需求量相当大，光学纯的右旋生物素中间体内酯是生产丛生物素的重要中间体。如图l,式la/b为外消旋内酯1,3-二,基-六氢-lH-呋喃并[3,4-d]咪唑-2,4-二酮，其中右旋内酯la是生产d-生物素的重要中间体；式2为内酯水解后得到的有机酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(la为右旋体内酯，lb左旋体内酯，2为内酯水解后的有才几酸)中间体内酯的合成目前采用化学法，但此法工艺复杂，拆分不完全，造成原料浪费，本4交高。经拆分后得到右旋体和左旋体的混旋物，该混旋物作为废弃物处理，造成了原料的极大浪费和环境污染。对该混旋物进行生物酶法拆分，得到光学纯的右旋体，不仅可以大大降低A生物素的生产降低成本，而且环境友好，具有显著效果，符合绿色、环保的可持续发展战略，具有良好的社会经济效益，发展前景广阔。以前一直采用化学法拆分，如陈芬儿等采用化学晶析法拆分得到e.e值为40%左右的混旋体内酯，其工艺复杂，且拆分不完全，造成原料浪费，成本较高。但到目前为止，生物素的合成方法有很多，但大部分方法都由于成本过高，不适宜工业化。所以若在前几步就得到光学活性的中间体，并能在反应过程中保持其构型，从而直接得到d(+)-生物素，也就是d-生物素，可大大降低成本。1970年，Roche公司的Gerecke等报道了原Goldberg-Stembach路线的一个重要进展光学活性的内酯2与硫代乙酸钾，在DMF中，于150。C下反应，能保持构型，并以较高收率得到光学活性的硫代内酯3。利用3,可以不经拆分直接合成A生物素。于是，光学活性的内酯2的合成就显得极为重要。右旋生物素中间体内酯的制备方法有以下几种已报道的内酯1的合成方法主要有(l)化学拆分；(2)不对称合成(3)生物合成。1、化学方法拆分，如用光活性醇薄荷醇，或手性胺麻黄碱拆分前体物质，再转化得到右旋生物素中间体内酯，化学拆分法的缺点是拆分剂价格昂贵，分离不完全，还有环境污染和毒性问题；2、物理方法拆分，如用诱导结晶拆分前体单曱酯，再还原得到右旋生物素中间体内酯，条件控制要求高，光学纯度差，收率低。3、生物法拆分，如用猪肝酯酶不对称水解前手性二酯得到光学活性的单酯，再还原得到右旋生物素中间体内酯。此方法的缺点是工艺较复杂，得率低，光学纯度不高。具体生物拆分法(见下式)是利用猪肝酯酶(PLE)不对称水解前手性二酯4[和6来合成内酯2的方法。PLE能优先水解4的(5)-氨基酸酯部分从而得到手性单酯5，进一步用LiBH4还原，就可得到2。在上述报道中，水解收率为85%，还原收率为64%,产品e.e.值为75%。利用6来合成内酯2的方法是PLE催化二乙酯6得到醇7(收率70%;e.e.值92%),表明前(/)-构型的乙氧基已优先断裂了。7经Jones氧化，碱水解及内酯化作用得到2。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>生物法发酵生产生物素已取得了一定进展，与化工合成生产生物素相比，其优势日益突出，但以生物技术方法获得基因工程菌，价格仍然昂贵，现在还处于小试研究阶段，要实现工业化，产量仍然有待于提高，很多技术问题还有待于解决。
发明内容本发明的目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选微生物酶，提供了一种以外消旋生物素中间体内酯水解后得到的外消旋有机酸为反应底物，在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯的方法为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种右旋生物素中间体内酯的制备方法，所述方法是以消旋生物素中间体内酉旨1(tetrahydro-l，3-bis(phenylmethyl)-lH-Furo[3，4-d]imidazole-2,4-dione)水解得到的外消旋有机酸2(l,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)为反应底物，在内酯合成酶作用下选一奪性进行合成右旋生物素中间体内酯，所述内酯合成酶来自下列之一①猪肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黄曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、⑦华根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶；o(,本发明流程见下式和图1。其中rac-l为化学法拆分后的消旋体，在碱性条件下自发水解得到有机酸rac-2，经酯酶拆分后得到光学纯的右旋体内酯d-l和左旋的酸/-2。所述内酯合成酶优选来自来自米曲霉WZ007(As7^/^7/w『Z067)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo:M206105，保藏日期2006年10月8日。所述米曲霉WZ007由筛选得到，通过发酵得到菌体，干燥处理得到酶制剂用于酶法拆分生物素中间体内酯，一次酯化率为10-50%，光学纯度e,e.值达到95%以上，精制得到了较高纯度的右旋体内酯。菌种和诱变从土壤中经初筛、复筛及分离纯化，获得一抹产右旋内酯la合成酶的曲霉属爿^erg/〃woryzaeWZ07,该菌4朱产酶量高，产酶稳定，立体选择性好，在产酶培养基上摇瓶发酵的菌丝体作酶源，选择性酯化有机酸2得到右旋内酯la,经提取得到的右旋内酯la光学纯度高。以它为出发菌种，按常规方法进行紫外线、y射线诱变处理。紫外线照射为15W,距离27cm,时间2-3分钟;c06o-y-射线处理条件为:在0.5、1.0、2.0KGY照射，致死率才达到99.2%,正突变率为15%,经处理的孢子悬浮液接种到含混旋生物素中间体内酯和消旋的对应的酸的基本培养基及完全培养基上，20-40。C培养3-7天，检出在含混旋生物素中间体内酯和消旋的对应的酸的基本培养基上不长，在完全培养基上生长的菌落。再在生物素中间体内酯平板中培养，取透明圏大的进行摇瓶发酵，测其酶酶活力。选育出一突变抹A^e^f〃^o"加eWZ007酶活有明显提高。诱变分别提高了44.2%和69.8%的酶活,使出发菌抹的酶活提高了247.4%,其酶活达到10.1U/g菌体。菌种初步鉴定结果菌抹『ZW7群体形态，肉眼观察在斜面生长速度较快，在30。C条件下，一般需3-5天，菌落初期呈白色绒毛状，呈扩散状，表面较干燥，后生出绿色的孢子。菌落在查氏琼脂上25。C7天直径45-65mm,10-14天扩及全皿；质地丝绒状至厚絮状，有的生长较稀疏，具辐射状沟紋；继续培养，呈浅黄褐色，近于浅褐橄榄色。分生孢子结构多或少，颜色初为浅黄绿色至黄绿色.,近于橄榄浅黄色，橄榄黄色或黄桔青色，后呈淡茶褐色，近于淡褐橄榄色或古铜色至浅黄橄榄色；渗出液无或有，呈稀疏小滴，无色；菌落反面无色或呈淡粉红色至浅褐色。分生孢子头球形，后呈辐射形，散乱，直径80250um或更长，也有少数呈短柱形者；分生孢子梗生自基质或气生菌丝，孢梗茎5003000um或更长，直径820um生于气生菌丝者较短，壁通常粗糙，也有近于光滑者；顶嚢近球形或烧瓶形，2045um全面或四分之三的表面可育；产孢结构单层或双层，甚至同一顶嚢上两种情况兼有梗基814umx3.55um,偶有多育现象，瓶梗815umx35um分生孢子球形至近球形58.6um，或椭圓形至洋梨形4.89.6umx44.8um，壁近于光滑或粗糙。菌落在查氏麦芽汁琼脂上25°C7天直径60—65mm,10—12天质地丝绒状生长较稀疏，黄绿色，近于黄橄榄色后变褐橄榄色；菌落反面无色，37。C生长良好。菌林WZ007初步鉴定为曲霉属，米曲霉原变种Aperg/〃w0/7zae。所述方法如下将内酯合成酶的酶制剂加入反应底物外消旋有机酸2溶于有机溶剂得到的溶液中，底物终浓度为130%，酶制剂加入量为0.125U/g底物，305(TC下反应360小时，反应液经分离纯化得到所述的右旋生物素中间体内酯，U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化合成d-内酯Ia的1|imol量的内酯合成酶的量，所述的规定条件为取0.1g冻干菌丝体，向菌体中加入混旋体有机酸2浓度1%的甲苯溶液10ml,40。C条件下，水浴搅拌转速200rpm,反应60min后，过滤除去菌体，取反应液曱苯相用高压液相色谱分析(HPLC)测定转化得到的d-内酯Ia。凡是能溶解反应底物外消旋有机酸2或产物1的有机溶剂都在本发明的保护范围之内，本发明推荐的有机溶剂为下列之一曱苯、苯、二氯曱烷、四氯曱烷、乙醚、丙酮、乙腈或氯仿。更优选曱笨、苯、二氯曱烷、氯仿。本发明中物质百分比浓度均为质量体积百分比浓度，某物质浓度1%表示每100mL溶液中含有该物质lg。所述酶制剂为市售酶制剂或经微生物常规发酵所得湿菌体干燥得到的酶制剂。所述的内酯合成酶的酶制剂按如下方法得到在产酶培养基上接种斜面种子，3037°C、转速150200r/min培养23天，过滤得到菌丝体，离心取沉淀冷冻干燥后即酶制剂，所述产酶培养基组成为葡萄糖2~6%，蛋白胨25%,蔗糖1~6%,尿素0.30.9%，NaCl0.4~0.8%,k2HP040.20.5%,MgSO40.10.3%,,(NH4)2S()40.40.8%，pH自然。本发明培养基中各物质浓度均以终浓度计，下同。具体的，所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCCNo.M206105,所述的制备方法如下(1)斜面培养取米曲霉CCTCCNo.M206105菌落转接斜面培养基，30。C培养3天，作为斜面活化种子，所述的斜面培养基组成为NaN030.10.3%，K2HP040.卜0.2%，KC10.30.7%，FeS()40.0010.002%，MgS040.040.06%，蔗糖25%,琼月旨1.52.0%.PH自然，12rC灭菌20分钟;(2)产酶培养接种斜面种子，30。C培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得到酶制剂；所述产酶培养基组成为葡萄糖26%,蛋白胨25%,蔗糖16%,尿素0.30.9%,NaC10.40.8%,k2HP040.20.5%,MgSO40.10.3%,,(NH4)2SO40.40.8%,pH自然，121C灭菌20分钟；(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2含量130%的曱苯溶液中，酶制剂添加量为0.125U/g底物，3050。C下反应36()小时，反应结束后反应液过滤，滤液减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。优选的，所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCCNo.M206105，所述的制备方法如下(1)斜面培养米曲霉CCTCCNo.M206105转接斜面培养基，3(TC培养3天，作为斜面活化种子，所述的斜面培养基组成为:NaN030.2%,K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%,MgS040.05%，蔗糖3%,琼脂1.5%pH自然，12rC灭菌20分钟；(2)产酶培养接种斜面种子，3(TC培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得到酶制剂；所述产酶培养基组成为葡萄糖2%,蛋白胨2%,蔗糖l。/。g，尿素0.3%,NaC10.5%，k2HP040.2%,MgS040.1%,,(NH4)2SO40.5%，pH自然;121°C灭菌20分钟;(3)取步骤(1)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为2%的曱苯溶液中，酶制剂添加量为0.125U/g底物，40。C条件下，反应12h,反应结束后反应液过滤，滤液在0.1MPa压力下减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。内酯la/b及其对应的有机酸2的HPLC测定条件柱型为shim-pack-CLC-ODS柱；流动相为乙腈水-3:2(v/v);流速为1mL/min;4企测波长225nm。右旋内酯la合成酶酶转化反应摇瓶培养的菌丝体干燥后作为酶源.以外消旋有机酸2为底物，置于曱苯或丙酮等不同的有机溶剂中，底物浓度为1~30%,优选25%,加酶量为0.125U/g底物，酶反应温度为3050°C,酶转化时间为3-60小时，优选624小时。酯化率为1050%,值达到95%以上。右旋内酯la的提取及精制酶转化后过滤除去菌体，产物内酯溶于曱苯，底物酸不溶于曱苯，通过过滤分离可以将二者分离，通过蒸馏除去有机溶剂得到产物右旋内酯la，经过重结晶即可得到较纯的d-内酯la产口口o本发明克服了诱导结晶法制备右旋内酯la收率低，成本高，克服了化学方法拆分剂或手性诱导物价格昂贵，成本高，分离困难，有污染和毒性等不足，对其他生物法拆分的缺点，如收率低，产物光学纯度低等有所改善。本发明所述右旋生物素中间体内酯的制备方法的有益效果主要体现在拆分专一性强，拆分率高，大大降低了生产成本，操作简单，环境污染小，适合工业化生产。(四)图1为本发明反应过程流程图。米曲霉WZ007(^^erg/〃wwyzaefFZ007)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.M206105，保藏日期2006年10月8日。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不〗又限于此实施例1:斜面培养基NaNO30.2%,K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%,MgS040.05%，蔗糖3%,琼脂1.5%,pH自然，121°C灭菌20分钟，灭菌后4妄种米曲霉CCTCCNo.M206105(血pe^,'〃z"'o/jzaeWZ007)，30。C培养3天，作为斜面活化种子。液态发酵培养基为葡萄糖20g，蛋白胨20g，蔗糖IOg,尿素3g,NaC15g,k2HP042g，MgS04lg,，(NH4)2S045g,定容至1L，pH自然，装液量为500ml三角瓶装液80ml，121。C灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，30。C培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得4克作为酶粉L酶活测定方法取0.1g干菌丝体，向菌体中加入l。/。混旋体有机酸2浓度的甲苯溶液10ml，40。C条件下，水浴搅拌转速200rpm,反应60min后，过滤除去菌体，取反应液甲苯相用高压液相色镨分析(HPLC)测定转化得到的d-内酯Ia，上述条件下，每分钟催化合成d-内酯Ia的lpmol量的内酯合成酶的量，记为l个酶活力单位(1U)。测得酶粉1的酶活为10.1U/g。实施例2:O.lgA/e7"g/〃iozjzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40。C条件下，反应12h后，反应转化率32.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约96.2%。实施例3:O.lgJ^erg/〃^o/jzaeWZ007酶粉1加入含有2。/。外消旋有机酸2的20mL曱苯中，4(TC条件下，反应12h后，反应转化转化后的反应液，过滤除去菌体，加入新的反应底物继续反应，如此反复，重复利用5次，得到酶水解结果见表l。经内酯化后产品d-生物素中间体内酯，经0.1Mp减压浓缩至5mL，常温下结晶，得到右旋生物素中间体内酯，对映体过量值达96%以上，收率93%,纯度达98%以上。酶粉1使用5次后，酵转化率仍然没有明显下降。表l:反复分批酶转化结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4:4姿实施例2方法，变，对外消旋有机酸2进行酶法转化。该反应的反应转化率和产物对映体过量值见表2。表2结果表明，在反应转化率和产物对映体过量值方面上，曱苯作为反应溶剂都要优于其他溶剂。表2:反复分批酶转化结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例5:O.lgAperg/〃w。，:aeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率48.9%。反应结束过滤后有机溶剂经过在().lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约94.8%。实施例6:O.lgApwg/〃wso，weWZ007酶粉1加入含有2。/o外消旋有机酸2的20mL曱苯中，30。C条件下，反应24h后，反应转化率40.3°/。。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约95.4%。实施例7:0.2g血perg/〃wo/jzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，3(TC条件下，反应24h后，反应转化率48.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约95.8%。实施例8:0.2gAperg/〃woo^eWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，3(TC条件下，反应24h后，反应转化率37.2%。反应结束过滤后有才/U容剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约93.8%。实施例9:0.2gAperg/〃wswj加eWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率40.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约92.9%。实施例10:5g按实施例1方法制得的J^e^/〃Mo,yz"eWZ007酶粉1-1(酶活10.5U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L曱笨中，4(TC条件下，反应12h后，反应转化率36.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约93.8%。实施例11:5g按实施例1方法制得的A/erg/〃M。0^aeWZ007酶粉1-2(酶活9.8U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲苯中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率40.2°/。。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约94.8%。实施例12:20g4姿实施例1方法制4寻的/^/erg/〃woryzaeWZ007酶4分1-3(酶活10.7U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L甲笨中，30'C条件下，反应12h后，反应转化率39.4%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约95.7%。实施例13:40g按实施例1方法制得的^perg/〃ws0,yzaeWZ007酶粉1-4(酶活11.2U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L曱笨中，30。C条件下，反应12h后，反应转化率44.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约98.1%。实施例14:40g按实施例1方法制得的A/^^〃M。o;z"eWZ007酶粉1-5(酶活10.3U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L曱苯中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率46.3%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约97.1%。实施例15:40g按实施例1方法制得的爿w^g/〃M07zaeWZ007酶粉1-6(酶活10.1U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L二氯曱烷中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率50.3%。反应结束过滤后有泽几溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约91.2%。实施例16:40g按实施例1方法制得的A;^^7/mo;^zaeWZ007酶粉〗-7(酶活10.4U/g,测定方法同实施例2)加入含有5%外消旋有机酸2的1L曱笨中，3(TC条件下，反应24h后，反应转化率41.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，得出对映体过量值为大约95.5%。实施例17:40g按实施例1方法制得的y^/e巧7'〃worj,zoeWZ007酶粉1-8(酶活10.5U/g,测定方法同实施例2)加入含有2%外消旋有机酸2的1L曱苯中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率46.3%。转化后的反应液，过滤除去菌体，经0.1Mp减压浓缩至50mL,常温下结晶，得到右旋生物素中间体内酯，对映体过量值达95%以上，收率92.8%,纯度达96%以上。实施例18:60g按实施例1方法制得的/^/erg/〃wsoo^^WZ007酶粉1-9(酶活10.0U/g，测定方法同实施例2)加入含有5%外消旋有机酸2的1L曱苯中，3(TC条件下，反应]2h后，反应转化率40.8%。转化后的反应液，过滤除去菌体，经0.1Mp减压浓缩至50mL，常温下结晶，得到右旋生物素中间体内酯，对映体过量值达96%以上，收率93%,纯度达99%以上。实施例19:按照实施例2所述方法进行对下述所用皱褶假丝酵母脂肪酶(SIGMA公司，脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)进行酶活测定，测得铍褶假丝酵母脂肪酶的酶活为1.2U/g。O.lg皱褶假丝酵母脂肪酶(SIGMA公司，脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40"C条件下，反应24h后，反应转化率13.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约86%。实施例20:按照实施例2所述方法对下述所用胰酶(杭州三叶生物化工厂，脂肪酶水解活力3,000U/g)进行酶活测定，测得胰酶的酶活为0.8U/g。O.lg胰酶(杭州三叶生物化工厂，脂肪酶水解活力3,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱笨中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率11.4%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约63%。实施例21:按照实施例2所述方法对下述所用青霉脂肪酶(深圳市绿樣吏康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)进行酶活测定，测得青霉脂肪酶的酶活为6U/g。O.lg青霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲笨中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率20.1%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约84%。实施例22:按照实施例2所述方法对下述所用黑曲霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限/〉司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)进行酶活测定，测得黑曲霉脂肪酶的酶活为7U/g。O.lg黑曲霉脂肪酶(深圳市绿微康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，4(TC条件下，反应24h后，反应转化率18.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约80%。实施例23:按照实施例2所述方法对下述所用米曲霉脂肪酶进行酶活测定，测得米曲霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司，脂肪酶水解活力>20,000U/g)的酶活为5.5U/g。O.lg米曲霉脂肪酶加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率19.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光^f义测定，对映体过量值为大约78%。实施例24:由解脂假丝酵母B017(陕西省微生物研究所，编号B017)液态发酵培养基为葡萄糖40g，酵母膏3g，(NH4)2HP0413g，KH2P047g，MgS04.7H2()0.8g,NaClO.lg,定容至1L，pH自然。装液量为500ml三角瓶装液80ml.'12rC灭菌20分钟，灭菌后冷却接种斜面种子，3(TC培养24小时，过滤得到菌丝体，进行干燥作为酶粉2。按照实施例2所述方法对酶粉2进行酶活测定，测得酶粉3的酶活为0.5U/g。取该菌粉20.1g加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱苯中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率9.6%。反应结束过滤后有机溶剂经过在0.1MPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约82%。实施例23:按照实施例2所述方法对下述所用猪肝酯酶(上海丽珠东风生物技术有限公司产品，脂肪酶水解活力〉3000U/g)进行酶活测定，测得猪肝酯酶的酶活为1.4U/g。O.lg猪肝酯酶(上海丽珠东风生物技术有限公司产品，脂肪酶水解活力>3000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL甲苯中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率15.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约65%。实施例26:按照实施例2所述方法对下述所用米根霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司，脂肪酶水解活力>2,000,000U/g)进行酶活测定，测得华4艮霉脂肪酶的酶活为4.8U/g。O.lg米根霉脂肪酶(上海宝丰生化有限公司，脂肪水解活力》2,000,000U/g)加入含有2%外消旋有机酸2的20mL曱笨中，40。C条件下，反应24h后，反应转化率35.2%。反应结束过滤后有机溶剂经过在O.lMPa压力下减压蒸馏得到产物内酯。产物内酯的光学纯度通过自动旋光仪测定，对映体过量值为大约87%。权利要求1.一种右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述方法是以消旋生物素中间体内酯1(tetrahydro-1，3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3，4-d]imidazole-2，4-dione)水解得到的外消旋有机酸2(1，3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)为反应底物，在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯，所述内酯合成酶来自下列之一①猪肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黄曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦华根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶；id="icf0001"file="A2006101548320002C1.gif"wi="106"he="41"top="111"left="53"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.如权利要求1所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述内酯合成酶来自米曲霉WZ007(A;wg/〃z"o,，aeWZW7)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.M206105。3.如权利要求1或2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述方法如下将内酯合成酶的酶制剂加入反应底物外消旋有机酸2溶于有机溶剂得到的溶液中，底物终浓度为130%,酶制剂加入量为0.125U/g底物，3050。C下反应360小时，反应液经分离纯化得到所述的右旋生物素中间体内酯，U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下测定的每分钟催化合成d-内酯Ia的1jamol量的内酯合成酶的量，所述的规定的条件为取0.1g干菌丝体，向菌体中加入混旋体有机酸2浓度为1%的甲苯溶液10ml,4(TC条件下，水浴搅拌转速200rpm，反应60min后，过滤除去菌体，取反应液曱笨相用高压液相色傳分析测定转化得到的d-内酯Ia。4.如权利要求3所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为下列之一曱苯、苯、乙醚、丙酮、乙腈或氯仿。5.如权利要求3所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述酶制剂为市售酶制剂或经微生物常规发酵所得湿菌体干燥得到的酶制剂。6.如权利要求5所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述的内酯合成酶的酶制剂按如下方法得到在产酶培养基上接种斜面种子，3037°C、转速150200r/min培养23天，过滤得到菌丝体，离心^^沉淀干燥后即酶制剂，所述产酶培养基组成为葡萄糖26%,蛋白胨25%,蔗糖b6%,尿素0.30.9%,NaCl0.40.8%,k2HPO40.20.5%,MgSO40.10.3%，，(NH4)2S040.40.8%,pH自然。7.如权利要求2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCCNo.M206105,所述的制备方法io下(1)斜面培养取米曲霉CCTCCNo.M206105菌落转接斜面培养基，30。C培养3天，作为斜面活化种子，所述的斜面培养基组成为NaN030.卜0.3%,K2HP040.10.2%,KC10.30.7%，FeS040.0010.002%,MgS040.040.06%,蔗糖25%,琼脂1.52.0%，pH自然,121。C灭菌20分钟；(2)产酶培养接种斜面种子，30。C培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得到酶制剂；所述产酶培养基组成为葡萄糖26%,蛋白胨25%，蔗4唐16%,/艮素0.30.9%,NaCl0.40.8%，k2HP040.20.5%,MgS040.10.3%,,(NH4)2SO40.40.8%,pH自然，12rC灭菌20分钟;(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为130%的曱笨溶液中,酶制剂添加量为(U25U/g底物，3050°C下反应360小时，反应结束后反应液过滤，滤液减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。8.如权利要求2所述的右旋生物素中间体内酯的制备方法，其特征在于所述的内酯合成酶来自米曲霉CCTCCNo.M206105，所述的制备方法3。下(1)斜面培养米曲霉CCTCCNo.M206105转接斜面培养基，30。C培养3天，作为斜面活化种子，所述的斜面培养基组成为NaNO30.2%，K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%，MgS040.05%,蔗糖3%，琼脂1.5。/。pH自然，121。C灭菌20分钟;(2)产酶培养接种斜面种子，3(TC培养48小时，过滤得到菌丝体，进行干燥得到酶制剂；所述产酶培养基组成为终浓度(g/ml):葡萄糖2%,蛋白胨2%，蔗糖l。/。g,尿素0.3%,NaC10.5%,k2HPO40.2%,MgS040.1%,,(NH4)2SO40.5%,pH自然；121。C灭菌20分钟；(3)取步骤(2)所述的酶制剂加入外消旋有机酸2浓度为2%的甲苯溶液中，酶制剂添加量为0.125U/g底物，40。C条件下，反应12h，反应结束后反应液过滤，滤液在0.1.MPa压力下减压蒸馏得到所述右旋生物素中间体内酯。全文摘要本发明提供了一种右旋生物素中间体内酯的制备方法，所述方法是以消旋生物素中间体内酯1(tetrahydro-1，3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3，4-d]imidazole-2，4-dione)水解得到的外消旋有机酸2(1，3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)为反应底物，在内酯合成酶作用下选择性进行合成右旋生物素中间体内酯，所述内酯合成酶来自下列之一①猪肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黄曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦华根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶。本发明所述右旋生物素中间体内酯的制备方法的有益效果主要体现在拆分专一性强，拆分率高，大大降低了生产成本，操作简单，环境污染小，适合工业化生产。文档编号C12P17/18GK101186938SQ20061015483公开日2008年5月28日申请日期2006年11月17日优先权日2006年11月17日发明者勍朱,钊汪,沈寅初,沈雪亮,章银军,郑建永,鄢洪德申请人:浙江工业大学