涉及不对称细胞分裂的基因的制作方法

专利名称：：涉及不对称细胞分裂的基因的制作方法涉及不对称细胞分裂的基因本发明涉及分离涉及不对称细胞分裂过程中的基因。本发明还涉及使用该方法分离的基因，和它们在控制根形成，优选側根形成中的用途。为了产生多细胞生物中存在的多种不同的细胞类型，导致具有不同命运的子代细胞的细胞分裂在多种发育过程中是重要的和决定性的(Scheres&Benfey，1999)。该类型的分类被称作不对称的，无论不对称在分裂时是否在形态学上可见(Horvitz&Herskowitz,1992)。特别在植物中，细胞移动受到限制，通常认为细胞分裂平面的控制对于规则模式的形成，即胚胎发生或气孔形成、分生組织中有序细胞列的形成中正确的分裂是重要的(Scheres&Benfey，1999)。在植物生命周期中，发生几种不对称分裂(a)合子的首次分裂(Mansfield&Briarty，1991);(b)胚胎分裂，其产生静止中心的透镜状祖细胞(Dolan等人，I993);(c)雄性小孢子分裂(Twell等人，I998);(d)气孔复体形成期间的分裂(Larkin等人，1997);(e)早期胚中的定向平周分裂，其分离三种主要组织表皮、基本組织和维管组织的祖细胞(Jurgens&Mayer，1994);(f)干细胞分裂，其分离根中分化活性子细胞和新的干细胞(Dolan等人，1993;vandenBerg等人，1995);和(g)也在侧根起始期间(Casimiro等人，2003)。不对称分裂与标准增殖分裂根本不同之处在于它们的发生受到时空方面。此外，涉及的细胞数目是最少的。这些特征使得难以分析在该过程中(基因组范围)转录物表达。迄今在多种生物中关于涉及不对称细胞分裂的过程仅仅进行了很少的转录物分布实验，例如，果蝇中gliogenesis期间(Egger等人，2002)，拟南芥花粉发育(Honys&Twell,2003，2004;Becker等人，2003)和侧根起始(Himanen等人，2004)。然而，这些方法都没有针对或导致鉴定驱动不对称分裂自身的遗传途径。对于侧才艮起始的情况，一些中柱鞘细胞背斜和不对称地分裂(Casero等人，1993)。这不是连续的过程并且暴露于多种环境线索和内源信号。此外，这些分裂仅仅在与木质部极密切接近的那些中柱鞘细胞列中发生(Casimiro等人，2003)。微阵列方法已经揭示向LRI的生长素信号传递的更宽的视野(Himanen等人，2004)。对于这些分析，使用侧根谦导系统。在该系统中，在补充NPA的培养基上生长的幼苗中生长素运输、信号传递和Gl-向-S细胞周期转换^皮阻断。随后，将这些幼苗转移到含有生长素(NAA)的培养基中1-12小时。这允许生长素信号传递的可诱导的开始和通过G向S转换进展(Himanen等人，2002)。该侧根诱导系统的改进系统也可用于研究不对称细胞分裂。我们给出了一种独特方法，其允许我们避开像组织特异性和与在LRI期间在木质部极特异分离不对称分裂的中柱鞘细胞相关的细胞的有限数目等问题。因此，我们組合了4种策略1)最近开发的侧根诱导系统，其在LRI期间同步诱导不对称分裂(Himanen等人，2002)，2)木质部极中柱鞘特异性GFP标记林系(markerline)(J0121),3)荧光辅助的细胞分选方法(Birnbaum等人，2003)，和4)对分离的木质部极中柱鞘细胞的基因组范围的微阵列分析。该组合的策略允许我们不仅鉴定直接参与LRI过程的那些基因，而且将结果外推到不对称分裂的一般概念。我们发现作为不对称分裂的潜在调节子的涉及细胞周期调节的基因和与细胞骨架组织和动力学相关的高百分比的基因。本发明的第一方面是提供分离涉及不对称细胞分裂的基因的方法，其包括(1)将野生型植物的根进行处理，诱导以同步方式发生侧根起始；(2)将由于生长素信号传递缺陷而不产生侧根的突变体的根进行以同步方式诱导野生型中侧根起始的处理；(3)鉴定在野生型但不在突变体中被诱导的基因；(4)鉴定在侧根起始期间在野生型的木质部极中柱鞘中被诱导的基因。如这里所用的早期侧根起始指刚好在中柱鞘中第一次分离前的不同阶段的事件。优选地，这在側根的生长素诱导后10小时内，更优选在所述诱导8小时内，甚至更优选在所述诱导后6小时。优选地，使用的突变体1/〃-/突变体。优选地，所述方法还包括使用木质部极中柱鞘标记林系，接着进行细胞分选。甚至更优选地，所述标记是GFP。最优选地，通过微阵列分析在基因组范围分析所分离的细胞。本发明的另一方面是涉及早期侧根形成的基因，其通过本发明的方法分离。优选地，所述基因编码转录因子。甚至更优选地，所述转录因子选自SEQIDN。1到SEQIDN。19。由于转录因子通常在活性组织中表达，所以它们的启动子可能具有经济用途。此类启动子可以用于几种策略中来增强植物的病原体耐受性/抗性。本发明的另一方面是用根据本发明的方法分离的涉及不对称细胞分裂的基因。优选地，所述方法还包括使用木质部极中柱鞘标记林系，接着进行细胞分选。甚至更优选地，所述基因包含编码选自SEQIDN。20-SEQIDN。34的蛋白质的序列，或者其同源物。本发明的再一方面是涉及早期側根形成的转录因子，其中所述转录因子选自SEQIDN。1到SEQIDN。19。优选地，用本发明的方法分离编码所述转录因子的基因。本发明的另一方面是用本发明的方法分离的基因调节早期侧根起始的用途。如这里使用的调节可以是侧根数目的增加或减少，它可以是侧根大小的增加或减小，或者它可以是侧根形成时间的偏移(植物发育中更早或更晚)。优选地，所述调节是侧根的增加或减少，甚至更优选地，它是侧根的增加。优选地，所述基因编码转录因子。甚至更优选地，所迷基因编码选自SEQIDN。1到SEQIDN。34的转录因子，或其同源物。所述基因可以组合4吏用以增加对侧才艮形成的效果。这里使用的基因指基因组序列(包括可能的内含子)以及从经剪接的信使RNA衍生的cDNA。它也可以指启动子序列。然而，本领域技术人员清楚对于一些应用，编码序列，如来自cDNA的编码序列，可以优选连接合适的启动子。有效连接指并列，其中所述组分处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系。"有效连接，，编码序列的启动子序列以这种方式连接使得在与启动子序列相容的条件下实现编码序列的表达。如此处所用的同源物指如通过BLASTP搜索测量的(Altschul等人，1997)，所述基因编码的蛋白质具有至少75%同一性、甚至更优选至少80o/o同一性、甚至更优选至少85%同一性、甚至更优选至少90%同一性、甚至更优选至少95%同一性、甚至更优选至少96%同一性、甚至更优选至少97%同一性、甚至更优选至少98%同一性、甚至更优选至少99%同一性的氨基酸序列。附图简述图1:侧根诱导系统(A-G)NAA处理的12小时时间系列(蓝色染色=Arath的P::GUS报道子活性；CYCB1;1标记G2/M转换)。生长素转运抑制阻断所有侧根起始，允许通过生长素同步诱导侧根，导致转移到生长素培养基后6到8小时G2纟M转换的开始(D,E)。图2:侧根起始期间主要事件的方案。图3:对20个聚蔟范围的品质因数计算。图4:交叉表表示，具有表达镨所有组合的频率。图5:如与野生型相比，在10天龄幼苗中CYCD3;1、E2Fa/DPa和CDKB1;1的过表达表型。图6:J0121xUAS:M/(0.0士0.0)中BDL蛋白质的稳定化突变形式的木质部极中柱鞘特异性表达，导致无侧根的表型，而对照林系Col-0(3.0士0.1)、J0121(4.1士0.1)、UAS:^//(3.1±0.1)、UAS:BDL(2.8±O,l)和J0121xUAS:BDL(3.6±O.l)不显示出侧根数目/cm的减少。图7:CYCA2;4家族中多种成员的组合突变导致侧根密度显著减小(左图Col-0对照；右图多个突变体)。图8:来自多个聚簇的几种同源SALKT-DNA插入突变体的侧根表型的分析。突变体的代码在表5中列出。图9:在完整数据集中多种上调和下调基因的早期侧根形成期间的详细分析(不对称细胞分裂通过箭头指出)。数字指表6中列出的融合。实施例颠觸辨沐才法差f『rO/-slr比较的方法承存在侧根诱导系统中，在生长室中垂直方向的正方形平板(GreinerLabortechnik，Frickenhausen，德国)上含有10|LiMN-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)的标准Murashige&Skoog培养基上在连续光照(110^lE.m-2.s-lPAR,通过冷白色焚光鴒管提供[Osram，Mtinchen，德国])下22。C使种子(Col-0&s/r-7)萌发(Himanen等人，2002)。萌发后72小时(0h时间点)，仅仅将完全接触培养基的那些幼苗(野生型和突变体)转移到含有IOiliM萘乙酸(NAA)的培养基中并在2小时和6小时后收获。为野生型和突变体提供这3个时间点。通过将幼苗转移到没有加入NAA的标准Murashige&Skoog培养基，为野生型包括仅仅假处理。对于所有时间点，仅仅侧根可诱导的节段用于分析。为此目的，手工除去根顶端分生组织和下胚轴以减小其他细胞类型的污染。重复所有处理。微萍^/和炎^使用RNeasyMinikit(Qiagen)提取RNA。使用RNA6000NanoLabChipKit(AgilentTechnologies,德国)分析RNA质量和数量。5.8|ag总RNA用于樣史阵列。用LifeTechnologiescDNA合成试剂盒(SynthesisKit)合成双链cDNA。将双链cDNA转化成生物素标记的cRNA(来自Enzo(LOXOGmbH)的AmbionMEGAscriptT7体外转录试剂盒和含有生物素的核糖核苷酸)。15片段化的cRNA用于与ATH1Affymetrix⑧基因芯片杂交。用藻红蛋白-链霉抗生物素蛋白标记显示生物素标记的RNA。ATH1基因芯片(Affymetrix)代表22747种拟南芥基因(拟南芥基因组中~85%预测的基因)。使用MicroarraySuite5.0软件(Affymetrix)将不同芯片的总体信号归一化。原始数据呈指数分布并且因此在进一步统计分析前进行21og-转化。通过方差分析(ANOVA)分析每个基因的统计学显著性。这导致方差的三个来源的p值时间过程的影响、基因型的影响和它们的相互作用的影响。对于基因组范围的转录物分布，严格性增加到p<0.001。这等价于如果进行22747个测试，那么有23个假阳性测试。在该显著性水平，标记了3110种基因。由于我们需要检测两种基因型中表达谱之间的差异，我们需要工具来最佳显示这些差异。我们通过按照时间点为两种基因型合并时间过程数据得到该工具。随后处理该合并的数据集，就好像它是单个时间过程(重复的时间点用*指出)(0/0*/2/2*/6/6*)。在聚蔟前，对一系列聚簇计算聚簇算法的预测力的估计(品质因数)。品质因数越低，聚簇的预测力将越高(Yeuiig等人，2001)。选自聚簇数(其最小的增量不导致品质因数的降低)作为最佳聚蔟数。使用TIGRMulti-experimentViewer2.2師p:〃www.tigr.org/,10/11/2003)进行所有聚簇计算。每个基因与两个聚蔟相关，代表它在野生型和突变体中的平均表达谗。以交叉表形式表示组合潜力，指出每个组合的发生频率。应用色码作为聚簇之间差异的指示器。对于所有聚簇，将平均镨的0小时和2小时之间和0小时和6小时之间表达谱的相对诱导/减小率相互比较。如果这些相对诱导/减小率在这些比较水平之一相差两倍或以上，那么对该聚蔟组合分配橙色或蓝色。如果这些相对诱导/减小率在两个水平相差两倍或以上，那么对该聚蔟组合分配红色。当表达水平的诱导率对于两个时间间隔(0-2和0-6)大于2倍，那么认为聚蔟被上调。仅仅聚簇l、2、3和4满足这些标准。细應为、逸才法承脊在侧根诱导系统中，将种子(J0121,http:〃www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/catalogues/Jlines/record/recordO.html)萌发(ffimanen等人，2002)。如上所述，在2小时和6小时后收获幼苗。对于所有时间点，将根切成小的0.5mm碎块，并将这些节段根据Birnbaum等人(2003，2005)进行原生质体化。在焚光激活细胞分选仪(BectonDickinsonFACSVantage)上分离表达GFP的细胞。将细胞直接分选到裂解緩冲液(QiagenRLT緩沖液)中，混合并在-80。C立即冷冻用于以后的RNA提取。重复所有处理。然后将小样品的标准Affymetrix方案用于扩增、标记和杂交RNA样品(http:〃www.wi.mit.edu/CMT/protocols/AffySmlSamplProto.pdf)。如GeneChip②表达分析技术手册(ExpressionAnalysisTechnicalManual)中所述的将杂交的cRNA片段化。根据Affymetric方案(http:〃www.wi.mit.edu/CMT/protocols/Affvmetrix%20User%20Manual.p必进行杂交、洗涤和染色步骤。使用混合模型(MixedModel)处理数据。进行该混合模型方差分析以鉴定不同处理之间差别表达的基因(Chu等人，2002，2004)。在该方法中，通过为每个阵列将log2转化的值的平均值以0为中心，应用全局归一化步骤减小一般的阵列水平影响(Chn等人，2002)。然后除去具有与探针组平均值相比大于两个标准差的值的异常值探针。接着，对从总体归一化值得到的经转化和中心化的强度值应用混合模型ANOVA。该基因模型是基于Chu等人(2002)开发的，可以用公式表示为10g2(户A^,"7}++J,仿+其中PM变量指每个基因的总体归一化步骤的输出，如上述。符号T、P和A分别代表处理、探针和阵列效应。认为阵列效应A仿^正态分布的随机效应(Chu等人，2002)。对该才莫型应用标准误术语￡,/。此外，下标j、k和1代表对kth探针和lth平行测定的jth处理(Chu等人，2002)。该模型的输出是基于全局模型的每个基因的平均表达值，以及从该基因模型得到错误排除非差异表达的0假设的概率的p值(01=.05)。用统计学软件SAS(版本8.2)在Linux服务器上运行全局和基因模型。使用TIGRMeV3.0.3(Saeed等人，2003)进行来自统计分析的1920种显著差别表达的基因分组成10个聚簇。实施例1采样和微阵列分析最近，我们开发了基于生长素的侧根诱导系统(Himanen等人，2002)。基于该独特的植物内(inpanta)可诱导的系统，我们进行了基因组范围的转录物序型分析，以鉴定侧根起始的关键调节子。为了方便鉴定在与侧根起始相关的生长素信号传递中具有作用的那些基因，我们包括突变体作为阴性对照。选择该突变体(solitaryroot(单根))主要是因为它不能形成侧根和因为受影响的基因涉及生长素信号传递的已知部分(Fukaki等人，2002)。侧根诱导系统中野生型和突变体的比较对于选择突变体(IAA14/SLR)中受影响的蛋白质下游的涉及侧根起始的基因是重要的。以这样的方式选择时间点使得我们可以监测刚好在中柱鞘第一次分裂前的不同阶段的基因表达。Himanen等人(2002)表明在转移到含有生长素的培养基之后8到10小时发生该事件。0时间点(72hNPA)与Gl/S-阻断状态相一致，而转移到生长素后6小时，与木质部极相邻的中柱鞘细胞接近开始G2/M转换。此外，生长素处理后1.5到2小时报导用DR5::GUS显示了根中最早的生长素应答(图2)。因此，包括一个时间点(2hNAA)以代表该最早的生长素调节的转录。对野生型和突变体(slr-1)都进行这些处理。此外，为野生型包括假处理以评估由于转移引起的差别基因表达。所有处理都在生物学上重复，增加数据的统计学显著性。实施例2统计学分析和聚簇归一化和转换后，将数据进行ANOVA分析。以前限制的转录物序型分析(对4600个基因)(Himanen等人，未公布的结果)与当前的比较清楚地表明我们的侧根诱导系统是高度可再现的，因为当在相同显著性水平(pO.005)上检查时，证实了64%的差别表达的基因。为了进一步减小假阳性的量，我们应用比以前的转录物序型分析中高5倍的严格性(pO.OOl)。在该高严格性水平仍然有3110种基因被差别调节。野生型和单根所有数据点分别的聚簇不能满足我们评估两种基因型中表达镨中差别的需要。为了满足该标准，将两种基因型的数据在一个数据集中组合。每个基因在组合的数据集中被代表两次，导致6220个表达谱。为了估计聚簇的最佳数目，为一系列聚簇计算品质因数(FOM)。在14个聚簇处估计最小的FOM，代表对应于最高预测力的聚簇的最优数目(图3)。随后，将所有6220个表达i普聚簇到14个聚簇。以这种方式，每个基因分配两个坐标，代表两种基因型中的表达谱。所有196(14x14)个可能的组合与每个组合中基因的绝对频率一起在图4中表示。聚蔟之间的不同通过色码表示。红色表示的基因(305)代表野生型基因表达总是高于单根中的基因。在野生型中诱导并且在单根中较少诱导的这种类型的基因最可能涉及侧根起始。因此，我们集中在以野生型中以聚簇l、2、3和4表示的基因。以这种方式，我们可以将被显著调节的基因的总数(3110)减少到266(~9%)种，它们可能在侧根起始中具有关键作用。实滋辦j:过滤;^于一袭^維类^/^彩询根据MATDB(MIPS拟南芥数据(MIPS爿mW^pws77ifl//flflDataBase))聚簇之前和之后属于一个功能类别的基因百分数的比较很好地阐明我们的基于交叉表的聚簇的有效性(表1)。该过滤步骤清楚地导致涉及细胞周期、RNA加工、DNA合成和信号传递和发育的基因的富集。这些特征证实使用我们的侧根诱导系统，监测中柱鞘中细胞周期的进展是可能的。此外，我们发现较高百分比的基因涉及转录调节，表明对增加的转录活性的总体需要。未分类和未知的基因的百分比保持在约相同水平。而且，通过所应用的选择标准实现了涉及胁迫、转运和代谢的基因的强烈的相对减少。此外，涉及转运的基因数目的下降也可以被分类为涉及解毒和胁迫应答的基因数目下降。^T滋辦心懈银趟始欢々7细應yf痴源伊选择的详细实验揭示了Gl/S和S期标记，如爿m^;CTO)3;2和爿m沩/CTC42，'(此外，与S-期进入/进展的联系从不遥远，因为存在涉及DNA复制和蛋白质合成的基因的多数表示。这强调了我们的方法研究生长素介导的细胞周期调节的合适性。与核心细胞周期事件一样有趣的是，它们需要上游信号级联，如生长素信号传递。《滋辦5:#/旅趟始痴/《种^长;#^~子#遽在我们的严格选择中，检测到一些基因属于在生长素信号传递中具有已知作用的基因家族，如Aux/IAA、ARF、ATGH3和ATSAUR(Hagen&Guilfoyle，2000)。属于Aux/IAA基因家族基因中的不同突变具有侧根表型(Fukaki等人，2002;Park等人，2002)。它们的基因产物抑制ARF转录因子二聚体的活性(Leyser，2002)。最近，研究人员通过分析活性标记的林系研究了ATGH3基因产物的功能(Takase等人，2004)。这些GH3蛋白质的一些已经显示出腺苷酸化植物激素并且基于它们的底物特异性和蛋白质结构，它们被细分成三个主要类另'j(Staswick等人，2002)。组I的成员，如ATGH3-1、ATGH3画5和ATGH3-6/DFL1可以腺苷酸化IAA,负调节生长素活性(Takase等人，2004)。对于小生长素UpRNAs(ATSAUR)，关于它们在生长素应答中的功能知之甚少。然而，几年前就已经报导了它们的生长素可诱导性(1\^(:1111^&Guilfoyle,1989)。,滋辨6:浙模趟始^的新差厉由于转录因子在图式形成和发育中起关键作用(Sabatini等人，2003)，所以显然我们的选择中此类基因(19)在侧根起始期间信号级联中将是尤其重要的(表1)。该选择中多数基因在最近通过拟南芥根尖的转录物序型分析研究中表明在中柱组织(包括中柱鞘)中被特异表达(Birnbaum等人，2003)，证明我们的研究中使用的选择标准是合理的。有趣的是，两个AP2结构域转录因子属于相同的亚进化枝。这暗示这些基因可能具有冗余功能。此外，有一个AP2结构域转录因子属于三种基因组成的相同的亚进化枝，其没有在微阵列上代表(Alonso等人，2003)。我们假i殳该基因(At4g27950)也可以与该亚进化枝的两种其他成员一样是功能冗余的。因此，将该基因加入我们的选择中，使我们选择的最后数目达到20种基因。在我们的数据集中，有15种转录因子在生长素信号传递中的角色还没有被提出。关于验证的开始，最重要的是对这些转录因子在侧根起始方面进行功能分析。许多这些转录因子很有可能涉及侧根发育，因为已经报导了它们的同源物在器官发育中的角色。^必"基因以前被描述为种子特异性基因，但是最近已经表明它在生长素信号传递和侧根发育中起作用(Brady等人，2003)。而且，已经表明AP2和几种同源异型框基因涉及花器官发育，其暗示同源物很可能在其他器官如侧根的发育中必要的(Carpenter&Coen，19卯；Maes等人，1999)。有趣的是，有一种转录因子MYB124，其突变体具有异常的气孔发育。由于所述突变，形成了具有四个而不是两个保卫细胞的气孔(￥&1^&Sack,1995)。当用生长素处理根时它的上调暗示MYB124基因产物与它在气孔发育中的一样可能在中柱鞘的形成分裂(侧根起始)中具有关键作用。《滋辨7:婆定不对#*^#袭差萄使用LRI作为模型以在遗传学上仔细分析不对称细胞分裂，我们在我们的IO个聚蔟中进行了研究，所述聚蔟含有该类型分裂的推定的调节子。首先，我们分析哪个聚簇与G2到M转变强烈连锁，通过为同步化的拟南芥细胞悬浮液使用基因组范围表达数据研究细胞周期进展期间的表达谱进行所述分析(Menges等人，2003)。我们发现聚簇3中48%的基因在G2到M转变达到峰值。这与在所有其他聚簇中少于10%的基因在该转变达到峰值相反。与其他聚簇相比，这是该聚簇中G2到M转变的强烈过量代表。此外，这占整个数据集中存在的G2到M特异性基因的59%。其次，我们分析了哪个聚簇可能与不对称细胞分裂相关。为此，我们使用被分配功能类别的基因的蛋白质序列(http:〃www.godatabase,org/cgi-bin/amigo/go.cgi)多种生物(如线虫(Cflewo尸/ra緒船e/eg做s)、黑腹果錄(附e/awoga他)、栗酒裂殖酵母(5W^/^yffcc/^n附K^/0附&)、小鼠…)中"不对称细胞分裂，，和/或"细胞极性的建立和/或保持"。我们用多种生物的蛋白质序列和被分配析。这导致聚簇3中推定与"不对称细胞分裂"、"细胞命运定型"和/或"细胞极性的建立和/或保持"相关的54种基因的过量代表。为了进一步分析不对称细胞分裂过程，我们因此集中于聚蔟3内的340种基因。在该聚簇中，已经描述了25%的基因；剩余的75%是未知的、表达的、假设的或推定的。为了进一步减少感兴趣的候选者数目；我们扣除了涉及正常细胞分裂的那些基因(同步化的、正分裂的拟南芥细胞悬浮细胞)(Menges等人，2003)。该分析后，我们以潜在涉及不对称细胞分裂的l卯个候选者告终。-滋辨J:y^:f攻迷潜采^尤为V/f广附g似-朋a/y^sJ以前已经阐明中柱鞘中细胞周期进展对于拟南芥中SOLITARYROOT/IAA14介导的侧根起始不是足够的(Vanneste等人，2005)。为了支持该发现，我们分析了过表达(35S)细胞周期基因的转基因抹系的根表型。基于Himanen等人(2002)中所示和我们的数据集中的侧根诱导时细胞周期阶段特异性表达镨，我们选择了CYCD3;1(Gl-向-S和G2-向-M，Dewitte和Murray，2003),E2Fa/DPa(Gl-向-S，DeVeylder等人，2002)和CDKB1;1(G2-向-M，Boudolf等人，2004)。分析了所有林系的10天龄幼苗中的过表达表型并且与WT比较(图5)。没有一个转基因林系显示出側根密度的显著增加。E2Fa/DPa的双转基因过表达林系甚至显示出与野生型Col相比側根数目的强烈减少。CDKB1;1的过表达也导致较少的侧根。此夕卜，对于CDKB1;1的情况，CDKB1;1(CDKB1;1.N161)(Boudolf等人，2004)的显性失活等位基因的过表达导致侧根数目的更强烈的减少。接着，我们分析了生长素(NAA)应用与增加的细胞周期基因表ii^目组合是否可以导致与仅仅生长素或细胞周期相比更多的侧根数目。我们因此转移了E2Fa。E、DPaOEOE、CYCD3;lOE和CDKBl;lOE的上述转基因拟南芥林系的5天龄幼苗以增加生长素浓度(1(T8、10^和10"MNAA)并另外生长5天后分析它们起始侧根的能力。我们发现与野生型相比CYCD3;lGE的显著增加。类似地，在E2Fa/DPaOE转基因株系中LRs/cm的数目可以显著增加，直到超过高生长素浓度下的野生型数目。甚至CDKB1;1^也超过了生长素应用时的WT数目，而CDKB1;1DNGE林系则不是这样。上面的结果表明刺激基本细胞周期机器对于从头侧根起始不是足够的，但是当提供额外的生长素时，可以利用增强的细胞周期能力来产生新的器官。这确证了Vanneste等人(2005)的意见，即细胞周期激活后，需要另一种因子来特异性驱动侧根起始。尽管CDKB1;l在側根起始中的推定的功能，但是细胞周期基因显然不是侧根起始的关键调节子。所以，我们在我们的数据集中通过元分析搜索侧根起始的潜在特异调节子。进行该元分析以将基因数目从1920种重要的基因减少到15种非常重要的候选者(表3)。该分析涉及随后的重叠步骤和基因子集的深度分析，如下述。1)Affymetrix拟/^^ATH-l基因组阵列f22758种基因):2)独特的显著差别表达的基因(1920):3)基于下面的标准使用深度分析使用功能类别术语选择1个聚簇后在侧根起始期间不对称细胞分裂中被上调的基因:*最高的。/oG2-M基因*最高的％涉及不对称的基因*最高的％涉及极性的基因*最高的％涉及细胞命运的基因；4)基于Menges等人(2003)扣除有丝分裂器后潜在涉及细胞命运和细胞极性的基因(190);5)与剩余的l卯种基因重叠后涉及在侧根起始期间木质部极中柱鞘中生长素诱导的细胞命运和/或细胞极性的基因(15)与取决于快速SLR/IAA14降解用于正常生长素应答的那些側根起始基因(913)，如来自交叉表(图4)。实施例9:BDL涉及侧根起始如以前确定的(Vanneste等人，2005)，侧根起始的一种重要的调节子机理是生长素信号传递和转运。表4列出了涉及那些事件的基因并且表明它们多数在早期被上/下调。已经表明许多基因涉及侧根形成(ALF1/RTY/SUR1，Celenza等人，1995，King等人，1995，Boerjan等人，1995;DFLl，Nakazawa等人，2001)，并且对于几种Aux/IAAs和ARFs，在以前表明了在侧根起始和/或形成中的角色(IAA19/MSG2，Tatematsu等人，2004;ARF19，Wilmoth等人，2004;IAA1/AXR5,Yang等人，2004;IAA3/SHY2，Tian和Reed，1999)。对于BDL/IAA12(与MP/ARF5的一对转录调节子的部分)，我们阐明其涉及侧根起始。BDL蛋白质的已经建立的突变形式在J0121xUAS:6必中的木质部极中柱特异性表达(O.O±O.O)导致无侧根的表型，而对照林系Col-0(3.0±0.1)、J0121(4.1±0.1)、UAS:M/(3.1±0.1)、UAS:BDL(2.8±0.1)和J0121xUAS:BDL(3.6±O.l)没有显示出每cm侧根数目的减少(图6)。实施例10:CYCA2;4在侧根形成中的作用CYCA2;4被鉴定为侧根起始期间细胞分裂的推定的重要调节子(Vanneste等人，2005)。然而，CYCA2;4的过表达不诱导侧根的增加(类似于其他细胞周期基因的过表达)，而它刺激细胞周期前进，如通过子叶中核内再复制水平的强烈降低所例证。而且在敲除体中，我们没有观察到侧根密度的明显改变。但是，CYCA2;4属于由4个成员组成的小基因家族。组合该家族的多种成员中的突变导致侧根密度的显著降低(图7)。这些数据一起表明A2型细胞周期蛋白是所需的，但是对于发生側才艮起始不是足够的。有趣的是，CYCA2;4-—种核心细胞周期基因-在元分析后保持在基因列表中。不幸的是，在过表达林系中侧根表型的缺少可能提示需要基因/因子的组合来特异驱动不对称细胞分裂和側根起始。当組合时将诱导侧根起始的最可能的候选者在实施例8鉴定的15种基因的子集内。《宽琳谬逸使来自多种聚簇中基因的许多SALKT-DNA插入突变体变得纯合并分析它们的侧根表型(图8)。在该图中，具有侧根数目显著增加或减少的突变体的条形分别为绿色或红色。该图部分周围的绿色或红色框分别指出来自上调或下调聚簇的基因。除了侧根表型外，还检测了需要不对称细胞分裂的其他过程，如气孔形成和胚发生中的缺陷。贫滋^":遞迎Gt/5/6^尸融会^衷迷为、浙使来自多种聚簇中基因的许多启动子-GUS/GFP融合变得纯合并且详细分析它们的表达图式(图9)。GUS/GFP表达图式主要与微阵列数据集中基因的上调或下调相一致。对于4种基因，详细分析了表达图式，并且揭示了在不对称细胞分裂时侧根起始位点中GUS/GFP的特异上调或下调与微阵列中检测到的转录物水平相一致(图10)。表l:过滤后功能类别中的偏移概述<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以"側根起始"基因加密的侧根起始表2:在突变体Qy/r)中不应答的被上调的转录因子列表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3.在木质部极中柱鞘中被上调、在sfr突变体中不应答和可能涉及不对称细胞分裂的基因列表<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表4:如通过细胞分选方法确定的涉及生长素信号传递和运输的早期基因中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>图上的代码AGIH21Atlgl4720tt6Atlg29050H29Atlg53500HIAtlg60610H26At2g45470H28At3gl0810H5At3g52370H18At4g03960H9At4gl4130H27At5gl8650H13At5g38895H17At5g54160H16At5g57740H22At5g036506At2g3383022At2g33830H7At3g54920H24At3g54920表6:用于GUS融合中的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>参考文献Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Ldsse，T.J.，Kim,C.J.，Chen，H.，Shinn,P.，Stevenson,D.K.，Zimmerman,J,，Barajas，P.，Cheuk，R.，Gadrinab，C.，Heller,C.，Jeske,A.，Koescma,E.，Meyers，C.C.，Parker,H.，Prednis5L.，Ansari，Y.，Choy，N.，Deen，H.，Geralt，M.，Hazari,N.，Hom，E.，Karnes,M.Mulholland,C.，Ndubaku，R.,Schmidt,I.，Guzman,P.，Aguilar-Henonin，L.，Schmid,M.，Wdgel，D.，Carter,D.E.，Marchand，T.，Risseeuw,E.，Brogden,D.，Zeko，A.，Crosby,W丄.，Berry,C.C.&Ecker，J.R.(2003)Genome-wideinsertionalmutagenesisofJmA/^/w/s,/rtf"ff冊.Science,301:653-657.Altschul，StephenF.，ThomasLMadden,AlejandroA.SchSffer，JinghuiZhang,ZhengZhang,WebbMiller,andDavidJ.Lipman(1997)，GappedBLASTandPSI画BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms,NucleicAcidsRes.25:3389-3402.BeckerJD，BoavidaLC，CarneiroJ，HauryM，FdjoJA(2003)Transcriptionalprofiling'ofArabidopsistissuesrevealstheuniquecharacteristicsofthepollentranscriptome.PlantPhysiol133:713—725.Birnbaum,K.，Shasha，D.E.，Wang,J.Y.，Jung,J.W.，Lambert,G.M.，Galbraith,D.W.&Benfey，P.N.(2003)AgeneexpressionmapoftheArabidopsisroot.Science,302:1956-1960.BirnbaumK，JungJW，WangJY,LambertGM,HirstJA，GalbraithDW，BenfeyPN.(2005).Celltype-specificexpressionprofilinginplantsviacellsortingofprotoplastsfromfluorescentreporterlines.NatMethods.2(8):615-619.Boerjan，W.，Cervera，M.画T.，Delarue，M.，Beeckman，T.，Dewitte，W.，Bellini,C.，Caboche,M，VanOnckelen,H.,VanMontagu,M.andInz6,D.(1995).Superroot,arecessivemutationinArabidopsis,confersauxinoverproduction.PlantCell7:1405—1419.BoudolfV.,Vlieghe，K,，Beemster，G.T.，Magyar,Z.，TorresAcosta，J.A.，Maes,S.，VanDerSchueren,E.，Inze，D.andDeVeylder，L.(2004)Theplant-specificcyclindependentkinaseCDKBl;landtranscriptionfactorE2Fa-DpacontrolthebalanceofmitoticallydividingandendoreduplicatingcellsinArabidopsis.PlantCell16:2683-2692.Brady，S.M.，Sarkar，S.F.,Bonetta，ri.&McCourt，P.(2003)TheABSCISICACIDINSENSIT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