基因扩增方法

专利名称：基因扩增方法
基因扩增方法
技术区域
本发明涉及一种高速扩增基因的方法以及使用扩增后的基因来制造蛋 白质的方法。
背景技术：
在为了人为地引起基因扩增而使用动物培养细胞来进行时(专利文献1 等)，有以下几个问题(i)耗时(半年 一年)、(ii)未扩增的克隆也较多、 (iii)扩增机制不明而依赖于经验等。另一方面，没有利用酵母进行基因扩 增的体系，通常都是使用质粒来达到这一目的，但拷贝数达到一定程度以 后就难以再增加。
本发明的体系是基于由生物所具有的被称为BIR (断裂诱导性复制，Break-Induced-Replication)的能力诱导的、被称为DRCR (双滚环式复制， double rolling-circle replication)的复制反应(非专利文献1、 2)。这种复制 反应被认为是当染色体被切断时，被切断的染色体会寻找与自身相同的序 列，利用其同源性而侵入其中以构建复制点并开始复制，从而进行自身救 济。所有生物都被认为具有这种能力。
另外，有报道在自然的环状DNA中，通过重组来引起DRCR (非专利 文献3)。
专利文献l:日本特表平8-504585 (W094/14968) 专利文献2: WO2005/061703
非专利文献1: PNAS， vol.98, no, 15， 8255-8262(July 17， 2001) 非专利文献2: Genes Dev 12, 3831-3842 (1998) 非专利文献3: Cell. 1986 Aug 15; 46(4): 541-50.

发明内容
本发明提供为了高速扩增基因而特别构建的双链DNA和使用了所述 DNA的基因扩增方法以及蛋白质的合成方法。本发明的特征为完全人为地构建扩增体系，能够同步地扩增，扩增时间短(大概l代)，以及扩增机 制清楚等。
本发明的扩增体系利用了被称为双滚环式复制(DRCR)的复制反应。 认为这样可以在一个细胞周期内使其爆发性地扩增，通过重组等来终止反 应，从而将扩增产物维持在细胞内。本发明人等为了有效地诱导这种DRCR 而利用了Cre-lox体系等的位点特异性重组酶及其靶序列。即，本发明人等 在酵母菌内构建了图3所示结构的复制单元，利用当复制叉在一对lox序列 之间行进时由位点特异性重组酶Cre重组酶(以下称"Cre")所引起的重组， 成功地引起DRCR诱导，从而完成了本发明。
艮卩，本发明为一种用a-b-c-d或a-c-b-d表示的双链DNA (式中，a和b 中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一 个表示与该第一耙序列反方向地排列而成的双链DNA片段，c和d中的一 个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示 与该第二靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段，在a-d之间的任何一 处插入复制起始点和至少一个扩增目标基因。也可以在它们之间插入任意 的DNA序列)。
本发明还是一种含有该双链DNA的重组载体，进而，还是一种导入了 该双链DNA的转化体(transformant)。
另夕卜，本发明为一种包含用e-a-A-b-f表示的双链DNA和用g-c-B-d-h 表示的双链DNA的一组双链DNA (式中，a和b中的一个表示包含位点特 异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示该第一耙序列反方 向地排列而成的双链DNA片段，c和d中的一个表示包含位点特异性重组 酶的第二耙序列的双链DNA片段，另一个表示该第二靶序列反方向地排列 而成的双链DNA片段，e h分别表示在设想导入所述的一组双链DNA的 细胞染色体或染色体外因子上按照e、 f、所述细胞染色体或染色体外因子 的复制起始点、g、 h的顺序排列的、包含至少50bp的碱基序列的双链DNA 片段，A和B中的至少一个表示扩增目标基因。其中，该复制起始点或其 一部分也可以包含在f或g中，在它们之间也可以插入任意的DNA序列)。
本发明为一种分别含有所述两种双链DNA的一组重组载体，进而，为 一种导入了所述两种双链DNA的转化体，其是上述复制起始点存在于其宿主染色体或染色体外因子上的转化体。
另外，本发明为一种扩增上述扩增目标基因的基因扩增法，其包括准 备上述任一转化体的步骤以及使位点特异性重组酶作用于该转化体的步 骤，进而，本发明为一种制造扩增目标基因所编码的蛋白质的方法，其包 括将利用上述方法得到的转化细胞进行培养的步骤。
本发明的扩增体系由于确立了高性能蛋白质生产体系而具有优异的特
征。由于DRCR可以在一个细胞周期内实现高速扩增，且扩增机制明确， 因而可以期待目标基因的可靠扩增。并且，虽然目前生物种类不同，但 Cre-lox扩增体系可以以目前使用的动物细胞体系的10 100倍以上的频率 形成高度扩增产物。进而，本扩增体系也可以适用于原本即使选择药剂也 不引起扩增的原代培养的普通细胞，可以在以普通细胞为靶的基因治疗中 应用基因扩增而使导入基因的表达强化并持续化。


图1为表示DRCR反应的图。黑色箭头表示复制叉。 图2为表示使用位点特异性重组酶及其靶序列的扩增起始反应的图。 三角箭头(a d)表示位点特异性重组酶的靶序列(例如loxP序列)及其 方向，X表示复制起始点(以下相同)。x z和x' z'表示扩增目标基因， 黑色箭头表示复制叉。
图3为表示用于扩增的结构的图。CEN:着丝粒，TEL:端粒。 图4为表示用于Cre表达的质粒(pSH47)的图。 图5为表示菌落形成率的图。Glc:葡萄糖，Gal:半乳糖。 图6为表示Southern印迹分析的图。(a)表示使用leu2d探针、用PFGE 分离的染色体DNA， (b)表示用Smal消化后用FIGE分离的染色体DNA。 # 19 58表示由用半乳糖诱导Cre表达后、涂布在不含亮氨酸的筛选培养 基上而出现的菌落制备得到的DNA， NS表示由在非筛选培养基上培养的 对照菌落制备得到的DNA， P表示宿主细胞株。认为在本实验的PFGE条 件下，约650kb以上的染色体集中存在于分离限。
图7为表示染色体上的扩增产物的图。(a)表示通过DRCR最初形成 的结构。a f表示限制性酶Smal的剪切位点，数字表示其片段长度(kb)。但是，由于由d-e剪切产生的5.3kb的片段不含leu2d，因而用Southern印 迹法检测不到。(b)表示在lox间的序列伴有反转(在反方向上重新排列) 时的构造。a' f'表示由于反转而变化的剪切部位，其数字表示可生成的片 段长度(kb)。例如，通过a-b剪切而生成10.9kb的片段，但含有a的区域 发生反转时，由a'-b剪切而生成16.8kb的片段。同样地，由a-b，剪切生成 5.3kb的片段，由a，-b，剪切生成ll.lkb的片段。但是，不含leu2d的5.3kb 的片段用Southern印迹法检测不到。
图8为表示迷你染色体(图6 (ii))上的扩增产物的图。由端粒侧开 始的复制通过loxP间的重组而反方向进行，从而形成两端具有端粒的迷你 染色体(约18kb)。由于Saml剪切位点g i、以及可通过反转而改变的剪 切位点h'，含有leu2d的片段长度变为6.3kb (来源于g-h，或h-i的片段。 即使因反转而位置改变，h或h'的任一个也可以被剪切，因此不会有g-i片 段。)。
图9为表示迷你染色体(图6 (ii))上的扩增产物的图。由端粒侧开 始的复制通过1oxm2间的重组而反方向进行，从而形成迷你染色体(约 40kb)。j n表示Saml剪切部位，k' m'表示可通过反转而改变的剪切部位， 数字表示可生成的片段长度(kb)。但是，不含leu2d的5.3kb的片段用 Southern印迹法检测不到。
图10为表示Cre重组对未扩增结构的影响的图。各个lox间的序列高 频率地发生反转。0 r表示Saml剪切位点，p'和q，表示可通过反转而变化 的剪切位点，数字表示可生成的片段长度(kb)。但是，不含leu2d的5.3kb 的片段用Southern印迹法检测不到。
具体实施例方式
对于本发明的基因扩增法，作为扩增机制，利用的是被认为对出芽酵 母和动物细胞两者都能发挥作用的、可以高速扩增的双滚环式复制 (DRCR)。如图1所示，该扩增体系是两个复制叉连续地复制环状DNA 的反应。首先，复制叉(1)复制w，复制叉(2)复制y ((a)、 (b)、 (c))， 接着，复制叉(1)复制x，复制叉(2)复制z ((c)、 (d)、 (e))。这样， 用于一个复制叉的模板由另一个复制叉依次合成，因此复制持续地继续下去。扩增进行后，认为可以通过重组反应等来除去中央的环状构造，从而 反应结束(f)。
在本发明的扩增体系中，为了诱导DRCR，设计了利用已知在动物细 胞中也能有效发挥作用的位点特异性重组反应的体系。其是将在复制叉通 过一组耙序列时发生重组的反应和发生复制叉反方向进行的反应两者组合 来利用。
艮P，在本发明的扩增体系中，在图2 (a)所示构成的扩增单元中开始 复制之后，在黑色箭头表示的复制叉通过两组位点特异性重组酶的靶序列 (lox序列)之间时，在位于亲本DNA链x和新生DNA链y的靶序列(例 如loxP序列)间、以及位于亲本DNA链x'和新生DNA链y'的靶序列(例 如loxP序列)间引起利用位点特异性重组酶(例如Cre)进行的重组(b)。 通过重组x和y链替换，x'和y'链也替换，则一个复制叉由x链合成y、 z 链，另一个复制叉由x，链合成y，、 z，链(c)。由此，叉反方向进行，将己经 复制过的DNA链再次复制(d)。通过这两个反应来诱导DRCR。
本发明中使用的双链DNA可以用a-b-c-d或a-c-b-d表示，优选用a-b-c-d
表不o
a和b中的一个表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA 片段，另一个表示该第一靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段。
c和d中的一个表示包含位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA 片段，另一个表示该第二靶序列反方向地排列而成的双链DNA片段。
第一耙序列和第二靶序列可以相同，但优选不同。
并且，也可以在它们之间插入任意的DNA序列。
也可以所述b兼作c，用a-b-d (这种情况下，d表示与a方向相同的同 一靶序列)表示。
并且，该序列也可以用a-b-X-c-d或a-c-X-b-d表示，优选用a-b-X-c-d表不。
此处，X表示复制起始点。对于复制起始点，存在于二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因的3'下游区域的Ori beta、 EBV的latent origin (OriP)、 c-myc 基因附近的origin等可以作为候补，但只要在动物细胞内具有复制起始活性 就可以是任意位置。进而，该序列也可以用a-A-b-X-c-B-d或a-A-c-X-b-B-d表示，优选用 a-A-b-X-c-B-d表示。
此处，A和B中的至少一个表示扩增目标基因。使用多个扩增基因的 情况下，它们可以相同或不同。
对于这些，上述(图2)说明的DRCR也可以同样被诱导。
位点特异性重组酶对两个短的共有(consensus) DNA序列(靶序列) 之间的重组进行催化。该位点特异性重组酶在靶序列之间引起位点特异性 重组，可以进一步改变这些靶位点或对插入的基因加以变化。
本发明中，可以使用以下的位点特异性重组酶以及对该酶特异性的耙 序列(例如参照Developmental Cell, Vol. 6， 7-28, January, 2004等)。 ()Cre重组酶或其衍生物
细菌病毒Pl的Cre重组酶被最广泛地用于小鼠的基因导入或基因破 坏。Cre蛋白对两个长度为34个碱基的loxP识别位点之间的重组进行催化。 所述loxP的序列采取了用两个13个碱基的回文序列夹住成为8个碱基的核 的序列而形成的独特的构造。这8个碱基的非对称序列对loxP位点赋予方 向性。利用Cre酶进行的loxP位点之间的DNA链的剪切和重组发生在核 序列的8个碱基中的第一个碱基之后和最后一个碱基之前。
对该Cre酶利用氨基酸取代而制备衍生物。所谓衍生物是指，在野生 型Cre重组酶中导入氨基酸取代而使功能、性质发生了改变的位点特异性 重组酶，以及在野生型Cre重组酶基因的碱基序列中导入突变而使与CpG 含量、翻译起始效率相关的Kozak序列、密码子使用(codon-usage)在宿 主细胞中最优化、从而提高了表达效率和表达量的位点特异性重组酶及其 基因。至今为止，对Cre酶已经制备了至少29种衍生物。这些衍生物有的 活性不同，有的可以识别不同的靶序列。并且，对Crc酶识别的靶序列lox 也同样制备了很多突变序列。本发明中，这些全部可以使用。
作为这样的靶序列，可以列举出loxP、 lox511、 lox5171、 lox2272、 lox2372、 1oxm2 (也称m2)、 loxFAS、 lox71、 lox66以及它们的突变体。所 谓突变体是指，在野生型的loxP序列等的一处以上的碱基中导入了突变的 位点特异性重组反应的靶序列。
一般来说，无论Lox序列如何改变，重组效率也都非常敏感，但发现了保持功能的突变。在这种情况下，相同序列彼此的loxP之间可以在细胞
内有效地发生重组，但在不同序列彼此之间，重组效率显著降低。
(2) Flp重组酶或其衍生物
该重组酶是取自出芽酵母的Flp重组酶。该酶的活性与Cre/loxP相同或 差一些。但是，最近开发出的活性型Flp (Flpe)使这种酶的效率得到改良， 与Cre的效率相同。34个碱基的共有性重组序列被称为FRT。 FRT与loxP 具有相同的构造，但序列不同。
所谓衍生物是指，在野生型Flp重组酶中导入氨基酸取代而使功能、形 质发生了改变的位点特异性重组酶，以及在野生型Flp重组酶基因的碱基序 列中导入突变而使与CpG含量、翻译起始效率相关的Kozak序列、密码子 使用在宿主细胞中最优化、从而提高了表达效率和表达量的位点特异性重 组酶及其基因。至今为止，对Flp酶已经制备了至少28种衍生物。
对该Flp酶及其识别序列也制备了很多衍生物。作为靶序列，可以列举 出FRT、 F3、 F5、 FRT突变体一 10、 FRT突变体+ 10以及它们的突变体。 所谓突变体是指，在野生型的FRT序列等的一处以上的碱基中导入了突变 的位点特异性重组反应的靶序列。
与Cre相同，Flp酶对FRT位点的序列变化非常敏感。但是，若几个突 变FRT位点是相同的序列对，就能有效地鉴定发生重组的序列对。但是， 不同的突变FRT位点之间或野生型位点和突变位点之间几乎不发生重组。
(3) PhiC31整合酶或其衍生物
PhiC31整合酶来源于链霉菌的细菌病毒，并在人的细胞内发挥作用。 作为该耙序列，可以列举出attP、 attB及它们的突变体。所谓突变体是
指，在野生型的attP序列等的一处以上的碱基中导入了突变的位点特异性
重组反应的靶序列。
该体系是在attPP，和attBB，之间的ttg三个碱基引起重组的酶。由于该
ttg的重组序列的两侧是独特的序列，因此在重组之后形成了与最初的识别
序列不同的序列。由此，该酶的识别序列已经没有了。因此，该酶的重组
只能进行一次。
所谓PhiC31整合酶体系的衍生物是指，在野生型PhiC31整合酶中导 入氨基酸取代而使功能、性质发生了改变的位点特异性重组酶，以及在野生型PhiC31整合酶基因的碱基序列中导入突变而使与CpG含量、翻译起始 效率相关的Kozak序列、密码子使用在宿主细胞中最优化、从而提高了表 达效率和表达量的位点特异性重组酶及其基因。
在这些位点特异性重组酶及其靶序列中，优选Cre/Lox体系。 另外，也可以在这些构造内的任意位置插入想要使其表达的目标基因、 用于筛选染色体或染色体外因子上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传 霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌素等的耐药性基因等)、用于筛 选发生了基因扩增的细胞的标记基因(二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰 胺合成酶(GS)、天冬氨酸转氨甲酰酶(CAD)、金属硫蛋白(MT)、腺苷 脱氨酶(ADA)、腺苷酸脱氨酶(AMPD1,2)、 UMP合成酶、P-糖蛋白(P-gp)、 天冬酰胺合成酶(AS)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)等)。优选也能插入被认为 对于动物细胞的扩增很重要的核基质附着区域(nuclear matrix attachment region, MAR)。
另外，在这些各片段之间也可以插入任意的DNA序列。 适当依照常用的基因工程学的方法来结合这些片段。 用病毒、脂质体法、电穿孔法等方法将这样得到的双链DNA片段导入 适宜的细胞内。进而，优选用与用于筛选染色体或染色体外因子上插入了 主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟菌 素等的耐药性基因等)相对应的药物来进行筛选以建立细胞株。作为其宿 主，可以列举出酵母细胞或动物细胞等，但在生产作为药品的蛋白质时， 优选动物细胞，这是出于可以对蛋白质附加与人型类似的糖链、且诱发不 需要的免疫反应的危险性较低的理由。作为动物细胞，可以使用以蛋白质 生产中常用的CHO (中国仓鼠卵巢)细胞为代表的人、小鼠、大鼠和其他 动物来源的所有细胞。
并且，本发明的双链DNA也可以是将上述的任何一个双链DNA分割 为至少2个、优选2 5个、更优选2个而成的一组双链DNA片段，该片 段在其两端分别具有包含宿主的染色体或染色体外因子的部分序列、且具 有至少50bp、优选500 1Kbp的碱基序列的同源性重组用双链DNA片段。 所述的同源性重组用双链DNA片段可以通过其同源性重组而在宿主的染 色体或染色体外因子上形成上述双链DNA。该复制起始点可以是该宿主的染色体或染色体外因子的复制起始点， 也可以是外来的复制起始点。
另外，所谓染色体外因子是指可以在宿主细胞内复制的质粒、病毒来 源的序列、宿主染色体部分片段以及人工染色体。
作为这样的一组双链DNA片段，例如可以列举出以下例子。
(1) 用e-a-A-b-f表示的双链DNA,以及用g-c-B-d-h表示的双链DNA
(2) 用e-a-A-f表示的双链DNA，以及用g-b-c-B-d-h表示的双链DNA
(3) 用e-a- f表示的双链DNA,以及用g-A-b-c-B-d-h表示的双链DNA
(4) 用e-a-A-b-c-f表示的双链DNA，以及用g-B-d-h表示的双链DNA
(5) 用e-a-A-b-c-B-f表示的双链DNA，以及用g-d-h表示的双链DNA
(6) 用e-a-A-b-B-f表示的双链DNA，以及用g-d-h表示的双链DNA
(7) 用e-a-A-f表示的双链DNA，以及用g-B-d-h表示的双链DNA
(8) 用e-a-f表示的双链DNA，以及用g-A-b-B-d-h表示的双链DNA等。
其中，a d、 A、 B与上述相同。但是，(6) (9)中的d表示与a 方向相同的同一靶序列。
e h分别表示在细胞染色体或染色体外因子上按照e、 f、复制起始点、 g、 h的顺序(中间也可以插入任意的序列。另外，复制起始点或其一部分 也可以包含在f或g中。)排列的、包含至少50bp、优选500 lKbp的碱基 序列的双链DNA片段。
这些片段按照上述相同方法结合。
将如此得到的至少2个双链DNA片段用病毒、脂质体法、电穿孔法等 方法导入适宜的细胞内。进而，优选用与用于筛选染色体或染色体外因子 上插入了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、 杀稻瘟菌素等的耐药性基因等)相对应的药物来进行筛选以建立细胞株。 作为其宿主，可以列举出酵母细胞或动物细胞等，但在生产作为药品的蛋 白质时，优选动物细胞，这是出于可以对蛋白质附加与人型类似的糖链、 且诱发不需要的免疫反应的危险性较低的理由。
通过e h按照该顺序排列，它们与宿主染色体或染色体外因子的相当 的部分进行同源性重组，从而与上述相同的结构被配置在宿主的染色体或说明书第10/14页
染色体外因子上。
使位点特异性重组酶作用于如上所述得到的转化细胞。此时，由于优
选细胞周期处于复制期(s期)的细胞的比例较多，因此优选使位点特异性
重组酶作用于处于旺盛增殖、细胞周期正在进行中的状态的细胞，或者作
用于进入s期时与细胞周期同步的细胞。
作为使上述位点特异性重组酶作用的方法，例如可以列举出以下方法。
(1) 将以使位点特异性重组酶表达的方式而构建的质粒导入 在宿主细胞内发挥作用的启动子序列的下游，在各种表达载体中插入
连接了编码位点特异性重组酶的基因的结构。将其通过脂质体法、电穿孔 法等方法导入至上述的转化细胞中。此处，为了能在复制活跃进行的状态
下使位点特异性重组酶发挥作用，优选使用能够诱导表达的启动子。
(2) 将上述转化体进一步进行转化以使位点特异性酶表达。 在宿主细胞内发挥作用的启动子序列的下游，构建含有连接连编码位
点特异性重组酶的基因的片段、用于筛选在染色体或染色体外因子上插入 了主构造的细胞的基因(针对遗传霉素、新霉素、潮霉素、Zeocin、杀稻瘟 菌素等的耐药性基因等的任一种)的结构，将其通过脂质体法、电穿孔法 等方法导入至上述的转化细胞中。此时，为了提高在染色体或染色体外因 子中的插入效率，导入的结构优选为线状。另外，此处，为了能在复制活 跃进行的状态下使位点特异性重组酶发挥作用，优选使用能够诱导表达的 启动子。
(3) 直接导入位点特异性重组酶的蛋白质 准备使位点特异性重组酶大量表达并精制而得到的产物，将其用市售
的蛋白质导入试剂(例如Targeting system公司、Profect、 Genlantis公司、 BioPORTER Protein Delivery Regient)等导入上述的转化细胞中。此处， 为了能在复制活跃进行的状态下使位点特异性重组酶发挥作用，优选将位 点特异性重组酶导入处于旺盛增殖、细胞周期正在进行中的细胞，或者导 入进入S期时与细胞周期同步的细胞。
使位点特异性重组酶发挥作用的时期需要处于复制开始后一个复制叉 在两个第一靶序列之间、且另一个复制叉在两个第一靶序列之间(图2(b))。 但是，不需要在准备的细胞全部处于这个严密的时期下才使位点特异性重组酶起作用。这是由于，实际上在大部分细胞中，复制进行的时间各不相 同，只要其中的一部分细胞处于这样的状态即可。虽然偶尔只有复制叉满 足上述条件的细胞才爆发性地进行基因复制，但即使准备的细胞中的一部 分是这样，为了扩增也是足够的。
如上所述诱导扩增，优选使用与扩增标记基因(二氢叶酸还原酶
(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬氨酸转氨甲酰酶(CAD)、金属硫 蛋白(MT)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷酸脱氨酶(AMPD1，2)、 UMP合成 酶、P-糖蛋白(P-gp)、天冬酰胺合成酶(AS)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)等) 相对应的药物来进行筛选。这样可以筛选目标基因的表达量高的细胞株， 通过培养该细胞、并由其培养基或其上清液、或者将它们进行精制来大量 制造扩增目标基因所编码的蛋白质。
以下，用实施例举例证明本发明，但并不用于限制本发明。 实施例1
在本实施例中构建用于扩增的结构(图3)。
首先，构建含有相互反方向的一对loxP序列、扩增筛选标记基因leu2d 以及TRP1基因的DNA片段结构1 (端粒侧的构造)(序列号1，其1-34 为loxP序列，36-1988为扩增标记基因leu2d， 1993-2845 (互补链)为TRP1 基因，5699-5732为反方向的loxP序列。)。
制备在该DNA片段结构1的上游侧连接第VI染色体(Genebank Accession No. NC_001138)的碱基序列263177-264016 (序列号3)的PCR 片段、在下游侧同样连接264017-264685 (序列号4)的PCR片段而成的片 段，通过该片段，使用Frozen-EZ酵母转化II( Yeast Transformation II， ZYMO RESEARCH公司)进行宿主酵母细胞株的转化。通过TRP1标记基因的作 用，筛选能够在不含色氨酸的琼脂培养基上形成菌落的细胞，分析其染色 体结构，确立插入了被loxP对夹住的结构的细胞株。
接着，构建含有相互反方向的一对1oxm2序列、扩增筛选标记基因leu2d 以及LYS5基因的DNA片段结构2 (着丝粒侧的构造)(序列号2，其1-34 为loxm2序列，3936-5888 (互补链)为扩增标记基因leu2d， 2891-3930为 LYS5基因，5890-5923为反方向的loxm2序列。)。
制备在该DNA片段结构2的上游侧连接有碱基序列257941-258821(序列号5)的PCR片段、在下游侧连接有258822-259719 (序列号6)的PCR 片段而成的片段，通过该片段，与具有上述DNA片段结构1 (用loxP对夹 住的构造)的细胞同样地进行转化。通过LYS5标记基因的作用，筛选能 够在不含赖氨酸的琼脂培养基上形成菌落的细胞，分析其染色体结构，建 立插入了被loxP对夹住的结构和被1oxm2对夹住的结构的细胞株。
另外，扩增筛选标记基因leu2d由于缺少启动子序列的大部分，因而表 达量非常低，它只在扩增为多拷贝时才能够与亮氨酸需求性相互补。
在位于以上两个构造之间的区域(碱基序列258822-264016)中曾观察 到与复制起始相关的蛋白质Orcl发生结合(Nature, 424: 1078,2003)，认为 其作为复制起始点发挥作用。另外，在该区域中含有出芽酵母酿酒酵母菌
(5^cc/zflraw;;cM cerev&z'ae)内的复制起始点的共有序列WTTTAYRTTTWB
(序列号7)(碱基序列258889-258900)。
实施例2
在本实施例中，将实施例1中得到的结构(图3)插入出芽酵母第VI 染色体中，使Cre基因表达，从而诱导双滚环式复制(DRCR)。
使用Frozen-EZ酵母转化II (Yeast Transformation II， ZYMO RESEARCH公司)，将Cre基因(序列号8)连接到GAL启动子下游而形 成的质粒(图4， pSH47， Genebank Accession No. AF298782，由华盛顿大 学Yeast Resource Center提供)导入实施例1中得到的出芽酵母细胞株中。 然后，通过URA3标记基因的作用，筛选能够在不含尿嘧啶的琼脂培养基 上形成菌落的细胞。
在如上所述得到的导入了质粒的Ura+细胞的液体培养基中添加诱导 Cre表达的半乳糖或作为对照的抑制Cre表达的葡萄糖，培养3小时。将这 些细胞涂布在不含亮氨酸的葡萄糖琼脂培养基上，计数出现的Leu+菌落。 继续培养得到的Leu+菌落的细胞，在低熔点琼脂糖内制备染色体DNA。
通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE、 BIO-RAD公司，CHEF Mapper XA， Auto Algorithm,范围220-500kb)分离该染色体DNA，或者通过电场转 换凝胶电泳(FIGE、 BIO-RAD公司，CHEF Mapper XA， Auto Algorithm, 范围3-50kb)分离被限制性酶SmaI消化了的DNA，并通过Southern印迹法进行分析。
结果及其解释
计数出现的Leu+菌落，结果可见，与对照实验(添加葡萄糖)比较， 诱导了 Cre表达时，如图5所示，菌落形成率大幅度上升至约7倍。这强 烈表明利用Cre的重组有助于扩增。
接着，使用leu2d探针、通过Southern印迹法对由PFGE分离的染色 体DNA进行结构解析，结果如图6 (a)所示。
由图6(a)可知，插入了用于扩增的结构的第VI染色体增长而成的扩 增产物(i)和多拷贝化而成的迷你染色体(ii)被检测到。进而，在345kb 中发现了含有leu2片段的宿主细胞株的第III染色体(*)、在290 320kb 中发现了具有用于扩增的结构的第VI染色体(NS)微量扩增而成的染色 体。
接着，用限制性酶(Smal)消化上述染色体DNA，用FIGE分离Smal 片段，将得到的染色体DNA片段用leu2d探针、通过Southern印迹法进行 结构解析，结果如图6 (b)所示。
由这些结果可以明确扩增产物的结构。
从染色体上的扩增产物(i)中显示了大分子尺寸的强信号的菌落(图 6 (a) (i) #32、 48、 52、 53:黑道)检测到了约11Kb (10.9、 11.1Kb) 和17Kb (16.8Kb)的Smal片段。如图7所示，这些是来源于计划的DRCR 扩增中伴随了 lox序列间的反转(在反方向上重新排列)的结构的片段， 认为其具有含有至少数十拷贝以上的leu2d的高度重复序列。
另一方面，在超过半数的菌落(灰道)中发现的迷你染色体(图6 (ii)) 形成了约6.3kb的Smal扩增片段。如图8所示，认为这是通过由用于扩增 的结构引起的自端粒侧开始的复制和利用Cre-loxP重组引起的副反应而形 成的片段，在多拷贝中存在。
除此之外，还发现了不伴有反转的染色体上的扩增产物(图7 (a)， # 34、 41、 47)以及通过与上述类似的副反应生成的其它迷你染色体(图9， #29-31， 49， 56)，并且还有很多菌落都同时具有染色体上的扩增产物和 迷你染色体(#22， 31， 34， 41， 47， 58)。另外，由未扩增的构造可以确 认，除了来源于宿主细胞株的两个SmaI片段(图6 (b)的*)以外，有4个片段显示了较弱的信号(图6 (b)的NS，图IO)。
如上所述，观察到了被认为与设想的分子机制相关的高度扩增反应(# 32， 48， 52,， 53)。由于在10%的分析菌落中可见该高度扩增反应，因此该 反应以整体的菌落形成率4.4%的1/10、即0.44%的高频率发生。
权利要求
1. 一种以a-b-c-d或a-c-b-d表示的双链DNA，式中，a和b中的一个 表示包含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示使 所述第一耙序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；c和d中的一个表 示包含位点特异性重组酶的第二耙序列的双链DNA片段，另一个表示使所 述第二靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；在a-d之间的任一处 插入复制起始点和至少一个扩增目标基因；并且，在所述片段之间也可以 插入任意的DNA序列。
2. 权利要求1中记载的双链DNA，其中，所述b兼作c，所述双链 DNA以a-b-d表示，式中，d为与a相同方向的同一靶序列，其余字母的定 义与所述权利要求1中的定义相同。
3. 权利要求1中记载的双链DNA，其以a-b-X-c-d或a-c-X-b-d表示，式中，X表示复制起始点，其余字母的定义与所述权利要求1中的定义相 同。
4. 权利要求3中记载的双链DNA，其以a-A-b-X-c-B-d或a-A-c-X-b-B-d 表示，式中，A和B中的至少一个表示扩增目标基因，a、 b、 X、 c以及d 的定义与所述权利要求1中的定义相同，并且，在所述片段之间也可以插 入任意的DNA序列。
5. 权利要求l、 3或4中记载的双链DNA，其中，所述位点特异性重 组酶的第一靶序列与第二靶序列不同。
6. 权利要求1 5任意一项中记载的双链DNA，其中，当所述位点特 异性重组酶为Cre重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二靶序列分 别选自loxP、 lox511、 lox5171、 lox2272、 lox2372、 1oxm2、 loxFAS、 lox71、 lox66以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为Flp重组酶或其衍生 物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自FRT、 F3、 F5、 FRT突变体—10、 FRT突变体+10以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为 phiC31整合酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二耙序列分别选自attB、 attP以及它们的突变体。
7. —种重组载体，其含有权利要求1 6任意一项中记载的双链DNA。
8. —种转化体，其导入了权利要求1 6任意一项中记载的双链DNA。
9. 权利要求8中记载的转化体，其中，宿主为动物细胞。
10. —组双链DNA片段，其是将权利要求1 6任意一项中记载的双 链DNA分割成至少2个而形成的一组双链DNA片段，其特征在于，所述 片段在其两端分别具有包含至少50bp的碱基序列的同源重组用双链DNA 片段，该同源重组用双链DNA片段包含宿主的染色体或染色体外因子的部 分序列，且通过其同源重组，能够在所述宿主的染色体或染色体外因子上 形成权利要求1 6任意一项中记载的双链DNA;其中，所述复制起始点 可以是所述宿主的复制起始点，也可以是外来的复制起始点。
11. 权利要求10中记载的一组双链DNA，其包含以e-a-A-b-f表示的 双链DNA和以g-c-B-d-h表示的双链DNA，式中，a和b中的一个表示包 含位点特异性重组酶的第一靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第 一靶序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；c和d中的一个表示包含 位点特异性重组酶的第二靶序列的双链DNA片段，另一个表示使所述第二 耙序列在反方向上排列而成的双链DNA片段；e h分别表示在设想导入 所述的一组双链DNA的细胞染色体或染色体外因子上按照e、 f、所述细胞 染色体或染色体外因子的复制起始点、g、 h的顺序排列的、包含至少50bp 的碱基序列的双链DNA片段；A和B中的至少一个表示扩增目标基因； 并且，所述复制起始点或其一部分也可以包含在f或g中；在所述片段中 也可以插入任意的DNA序列。
12. 权利要求10或11中记载的双链DNA,其中，所述位点特异性重 组酶的第一靶序列和第二靶序列不同。
13. 权利要求10 12任意一项中记载的双链DNA，其中，当所述位点 特异性重组酶为Cre重组酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二耙序列 分别选自loxP、 lox511、 lox5171、 lox2272、 1ox2372、 1oxm2、 loxFAS、 1ox71、 lox66以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为Flp重组酶或其衍生 物时，所述第一靶序列和第二靶序列分别选自FRT、 F3、 F5、 FRT突变体 一IO、 FRT突变体+10以及它们的突变体；当所述位点特异性重组酶为 phiC31整合酶或其衍生物时，所述第一靶序列和第二耙序列分别选自attB、 attP以及它们的突变体。
14. 一组重组载体，其分别含有权利要求10 13任意一项中记载的2 种双链DNA。
15. —种转化体，其导入了权利要求10 13任意一项中记载的2种双 链DNA，其中，所述复制起始点存在于其宿主的染色体或染色体外因子上。
16. 权利要求15中记载的转化体，其中，宿主为动物细胞。
17. —种基因扩增方法，其用于扩增所述扩增目标基因，其包括准备 权利要求8、 9、 15或16中记载的转化体的步骤；和使位点特异性重组酶 作用于所述转化体的步骤。
18. 权利要求17中记载的方法，其中，使所述位点特异性重组酶发生 作用的方法是下述的任一种(1 )导入按照使位点特异性重组酶表达的方式而构建的质粒；(2) 将所述转化体进一步进行转化，以使位点特异性重组酶表达；(3) 直接导入位点特异性重组酶的蛋白质。
19. 一种制造扩增目标基因所编码的蛋白质的方法，其包括将通过权利 要求17或18中记载的方法而得到的转化细胞进行培养的步骤。
全文摘要
本发明提供为了高速扩增基因而特别构建的双链DNA以及使用所述双链DNA的基因扩增方法以及蛋白质的合成方法。本发明的扩增体系为了有效地诱导被称为双滚环式复制(DRCR)的复制反应而利用了Cre-lox体系等的位点特异性重组酶及其靶序列。在动物细胞等细胞内构建图2(a)所示结构的复制单元，当复制叉在一对靶序列(lox序列)之间进行时通过位点特异性重组酶引起重组，利用该重组而引起DRCR诱导。
文档编号C12N15/00GK101313064SQ20068004392
公开日2008年11月26日 申请日期2006年7月18日 优先权日2005年11月24日
发明者堀内嵩, 渡边孝明 申请人:大学共同利用机关法人自然科学研究机构