专利名称：一种用于基因扩增的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于进行高速基因扩增的方法以及一种利用所扩增的基因制备蛋白质的方法。
背景技术：
在动物细胞培养物中诱导人工基因扩增(例如，专利参考文献1)伴有一些麻烦，例如(i)费时(半年到1年)；(ii)伴有许多未扩增的克隆；(iii)依赖于经验性的专业窍门，但不能解释扩增机制等等。另一方面，尚没有利用酵母进行基因扩增的系统，而质粒通常被用于这个目的，但其只有有限的拷贝数。
本发明的系统基于于被称作为BIR(断裂诱导性复制(Break-Induced-Replication))的生物学能力(非专利参考文献1、2)。所述生物学能力被视为染色体的自我补救能力，包括当染色体被断裂时找到同样的染色体序列、利用同源性侵入该位点、构建复制点并开始复制。所有的活生物体都被认为具有这种能力。
专利参考文献1WO94/14968。
非专利参考文献1PNAS，vol.98，no.15，8255-8262(July 17，2001)。
非专利参考文献2Genes Dev 12，3831-3842(1998)。
本发明欲解决的问题本发明提供了一种为高速基因扩增而特别构建的双链DNA以及一种利用所述双链DNA进行基因扩增的方法。本发明的特征在于完整地构建了一种人工扩增系统，在于能够同步扩增，在于可以在短期内扩增(可能在1代以内)，以及在于被阐明的扩增机制。
解决问题的手段本发明人基于活生物体体内的被称作为BIR的基因复制的机制构建了一种人工高速基因扩增系统。
本发明人构建了第一种双链DNA(A-B-C)，其含有用于扩增的靶基因(B)以及位于所述靶基因(B)两端的扩增所必需的基因节段(A和C)；和以相同的方式构建的第二种双链DNA(A’-B’-C’，B’可以是用于扩增的靶基因，A和A’、以及C和C’能进行相互同源重组(reciprocalhomologous recombination))，如图1(1)所示；并且进行了一种基因扩增测试(如在图1(2)中所示，在此可以去除B和B’，在这种情况中，A或C可以是用于扩增的靶基因)。结果证实了当在特定位点上诱导断裂时，这将启动高速基因扩增(见实施例2到4)。
换句话说，本发明是一种双链DNA，包括(a)A-C排列和(b-1)A’-C’排列或(b-2)A’-C’的反向排列，其中A和A’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且A和A’中的其中一个序列是另一个的反向方向；C和C’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且C和C’中的其中一个序列是另一个的反向方向；并且A和C中的至少一个包括用于扩增的靶基因，并且在A、A’、C和C’之间可以插入任何DNA序列。
本发明也是一种双链DNA，包括(a)A-B-C排列和(b-1)A’-B’-C’排列或(b-2)A’-B’-C’的反向排列，其中A和A’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且A和A’中的其中一个是另一个的反向方向；B和B’是扩增节段，其中B和B’中的至少一个含有至少一种用于扩增的靶基因；C和C’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且C和C’中的其中一个是另一个的反向方向；并且在A、A’、B、B’、C和C’之间可以插入任何的DNA序列。
B和B’可以是扩增节段，每个节段都含有至少一种以相同方向排列的用于扩增的靶基因，并且能进行相互同源重组。此外，B和B’还可以含有一种以相同方向排列的用于扩增的选择基因。
双链DNA的优选实例包括下面的排列(1)A-C-A’-C’；(2)A-C-D-A’-C’；(3)(i)E’-A-C和(ii)A’-C’-E或A’-C’-E的反向排列、或(iii)A-C-E和(iv)E’-A’-C’或E’-A’-C’的反向排列；(4)D-E’-A-C-D-A’-C’-E-D、D-E’-A-C-D-E’-C”-A”-D、D-A-C-E-D-E’-A’-C’-D、D-A-C-E-D-C”-A”-E-D、或D-A-C-E-D-C”-A”-E-D；(5)A-B-C-A’-B’-C’；(6)A-B-C-D-A’-B’-C’；(7)(i)E’-A-B-C和(ii)A’-B’-C’-E或A’-B’-C’-E的反向排列、或(iii)A-B-C-E和(iv)E’-A’-B’-C’或E’-A’-B’-C’的反向排列；或(8)D-E’-A-B-C-D-A’-B’-C’-E-D、D-E’-A-B-C-D-E’-C”-B”-A”-D、D-A-B-C-E-D-E’-A’-B’-C’-D、或D-A-B-C-E-D-C”-B”-A”-E-D。
在这些通式中，D代表具有至少一个核酸内切酶的断裂位点的双链DNA片段，E代表端粒序列，E’代表E的反向序列，其他的标识与上面所述的标识相同。C”-A”代表A’-C’的反向排列，C”-B”-A”代表A’-B’-C’的反向排列。
例如，(1)与AC-C’A’-AC排列事实上是相同的，所述AC-C’A’-AC通过在设置三个相同的排列(AC)之后将中间排列倒转成(C’A’)可以容易地构建。此外，在中间排列(C’A’)的中间插入一个断裂位点可以生成AC-C’DA’-AC，这与(2)相同。此外，在这些实例中，A和C可以相同。例如，在这种情况中，(1)成为了A-A-A’-A’，(2)成为了A-A-D-A’-A’，(5)成为了A-B-A-A’-B’-A’，(6)成为了A-B-A-D-A’-B’-A’。
本发明也是一种含有上面(1)到(8)中的任一种双链DNA的重组载体。
此外，本发明是一种用上面的(1)、(2)、(5)或(6)的双链DNA所转导的转化体。所述(1)、(2)、(5)或(6)的双链DNA适合于被转导到染色体内。
此外，本发明是一种基因扩增的方法，包括制备转化体并扩增靶基因(例如，用于扩增的靶基因)的步骤。
优选的是，当双链DNA被表示为A-C-D-A’-C’或A-B-C-D-A’-B’-C’(其中标识与上面的标识相同)时，在扩增靶基因的步骤中用核酸内切酶处理转化体。
另外，本发明是一种含有上面的(3)、(4)、(7)或(8)的双链DNA的重组质粒。(3)、(4)、(7)或(8)的DNA适合于被导入质粒内。
另外，本发明是一种用于基因扩增的方法，包括用权利要求15的质粒转导细菌并培养所述细菌的步骤。
本发明也是一种生产用于扩增的靶基因所编码的蛋白质的方法，包括培养用这些方法中的任一方法获得的细胞或细菌的步骤。
图1显示了BIR反应的机制。
图2显示了本发明的双链DNA的优选的构建。A和A’、C和C’是能进行相互同源重组的序列，B和B’是扩增节段，其中它们中的至少一个含有用于扩增的靶基因，D是核酸内切酶的断裂位点，E和E’代表端粒序列。排列的方向代表着基因的排列方向。在去除了B和B’的情况中，A或C可以是用于扩增的靶基因。
图3显示了本发明的基因扩增的过程。CEN代表着丝粒，TEL代表端粒。DSB(双链断裂(Double Strand Break))代表双链断裂的位点。
图4显示了基因扩增的终止。
图5显示了用Southern印迹法对扩增产物的结构分析的结果。(A)显示了经PFGE分离后的结果；(B)显示了经XhoI消化后的结果。组(A)的数字表示菌落数目。
图6显示了用Southern印迹法对扩增产物的结构分析的结果。(A)显示了在经PFGE分离之后用RET2探针所检测到的结果；(B)相似地显示了用leu2d探针所检测到的结果。
图7显示了在比较例1和例2中生成的细胞的数目。横坐标表示每105个活细胞经HO诱导所生成的菌落数目。
图8显示了在比较例1和例2中生成的菌落的照片。
图9显示了在比较例1中所用的扩增单位。
图10显示了在实施例3中所用的双链DNA的构建。
图11显示了用Southern印迹法对扩增产物的结构分析的结果。(A)显示了经PFGE分离的结果；(B)显示了经XhoI消化后的结果。组(A)的数目代表菌落数目。
图12显示了实施例4所用的质粒pBIA和pNotBIA的组织结构。
图13显示了用Southern印迹法对扩增产物的结构分析的结果。(A)显示了经PFGE分离的结果；和(B)显示了经XhoI消化后的结果。组(A)的数目代表菌落数目。
图14显示了质粒pBIA的扩增产物。
图15显示了从含有质粒(pBIA和pNotBIA)的细胞株(LS20)中获得的Leu+Ura+菌落的数目。
发明详述本发明的用于基因扩增的双链DNA用排列(i)A-B-C和(ii)A’-B’-C’或A’-B’-C’的反向排列(在这种形式中，可以去除B和B’。在这种情况中，A或C可以是用于扩增的靶基因)，以及优选地上面(1)到(8)中的任一双链DNA表示。
在图2中显示了一些实例。
在本说明书中，这些双链DNA包括以从5’末端到3’末端(从左到右)呈现的核苷酸序列。用遗传工程的传统方法可以进行每种组分的组合。
A和A’都是双链DNA片段，都能进行相互同源重组并且优选地具有相同的核苷酸序列。优选地，A和A’的序列具有超过90％的同源性。此外，在A和A’的断裂位点(例如C-A’或D之间)的近端部分(例如，10到30个碱基对)特别优选地具有高度同源性。此外，A和A’的长度优选地超过500个碱基对。在基因扩增之后，短片段可以产生许多副产品，并可以造成在不希望的位点上的同源重组。
另外，A和A’以彼此反向的方向排列。C和C’的关系与A和A’的关系相似。A也可以与C相同。
B和B’中的至少一种是扩增节段，优选地B和B’都是扩增节段，并且每个节段不仅可以仅含有一种用于扩增的靶基因，也可以含有多种用于扩增的靶基因。至少一种用于扩增的靶基因优选地能进行相互同源重组，并且更优选地是相同基因。
任何基因都可以被用作所述用于扩增的靶基因。理论上，用于稳定扩增的基因长度没有限制，对于超过10kb的基因的扩增是可能的。
此外，所述用于扩增的靶基因优选地含有至少一种用于扩增的选择基因，并且B和B’更优选地含有以相同方向排列的用于扩增的选择基因。用于扩增的选择基因包括leu2d、删除了启动子的trp1、ura3、DFR1基因以及后面描述的其他基因。
可以去除B和B’。在这种情况中，A和C中的至少一种可以是用于扩增的靶基因。
D是HO核酸内切酶(在此后称为“HOcs”)的断裂识别序列，并且具有至少一个断裂位点。其可以被其他的在基因组中没有识别序列的核酸内切酶(I-SceI等)与断裂识别序列的组合所取代。通过取代，可以显著地提高扩增效率。D可以含有两个断裂位点以及两者之间的标记基因。
HO核酸内切酶和I-SceI酶都被优选地用作核酸内切酶，它们比普通的核酸内切酶能识别更长的序列，普通核酸内切酶识别约5碱基对的序列。
E是端粒序列(在此后被称作“TEL”)。端粒序列是一种能形成端粒的简单重复的DNA序列，其不必是相同的序列，尽管用相同的标识E表示。端粒使得扩增产物能以线性染色体的形式被保留在酵母细胞内。E’是E的反向序列。
此外，根据扩增的效率，本发明的双链DNA中的A和C之间的距离优选地与A’和C’之间的距离近似相同。因此，因为其他的原因，在上述元件之间可以插入任何DNA序列。这些插入物的实例包括着丝粒(在此后被称作为“CEN”)、自主复制序列(在此后被称作为“ARS”)、选择标记等等。
CEN序列可以是染色体上任何着丝粒序列(在下面的实施例中，所述染色体是第4号染色体)。CEN使得选择压力可以变得更强，并且可以稳定地保持扩增产物。在A-B-C(或A-C)和TEL之间、或A’-B’-C’(或A’-C’)或其反向排列和TEL之间的任何位点优选地插入一个CEN序列。在插入CEN和ARS时，在载体中应该不含有它们，因此优选地使用常用的传统载体(即pBR322、pUC系列、pBluescript系列、pGEN系列等等)。
ARS序列是酵母复制起点，其可以是染色体的任何ARS序列。扩增产物通过ARS序列维持。在A-B-C(或A-C)和TEL之间、或A’-B’-C’(或A’-C’)或其反向排列和TEL之间的任何位点优选地插入一个ARS序列。
选择标记包括URA3、HIS3、TRP1、ADE2、LYS2等等。所述选择标记优选地是一种具有与选择在B中用于扩增的选择基因不同的选择方法的标记。所述选择标记使得在扩增开始之前可以选择出含有质粒的细胞并使得扩增反应能有效地进行。优选地，不将选择标记插入到在两种结构元件和HOcs之间，即A-B-C和TEL之间、或A’-B’-C’或其反向排列和TEL之间的位点内。
因此，在基因扩增之前将所构建的双链DNA转导到在其中诱导了实际的基因扩增的细菌、细胞或动物个体内。宿主包括细菌例如大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(B.subtilis)、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞、哺乳动物个体等等，优选地使用酵母和动物细胞。根据遗传工程的常用技术，用本发明的双链DNA以及包含转录起始信号例如启动子、增强子等等的载体转化这些宿主细胞，如果需要，载体还可以含有终止子序列。
优选地将单拷贝质粒用作携带用于基因扩增的双链DNA的质粒。所述单拷贝质粒是一种含有CEN序列和ARS序列的质粒，包括例如酵母单拷贝载体(例如YCp50、pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS317、pRS412、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pAUR112、pAUR123等等)。此外，利用各种常规载体(例如，pBR322、pUC系列(pUC18、pUC19)、pBluescript系列(pBluescriptII)、pGEM系列(pGEM-3Zf))可以进行酵母复制起点ARS序列和酵母CEN序列的附加插入。
通过将质粒转导到细菌等体内可以实现基因扩增。所述细菌包括大肠杆菌，真核生物包括酵母等。
将如在序列(1)和(5)中所描述的双链DNA向染色体内转导诱导基因扩增。在这种情况中，随机诱导的双链断裂可能造成了C和A’之间的偶然断裂，这可以造成暴露的同源序列之间(A和A’、C和C’之间)的配对，在相同时间在两个位点上引起被称作BIR的反应，诱导出具有两个复制叉的滚环，并诱导基因复制。
另一方面，优选地引入核酸内切酶，以将如在序列(2)和(6)中所描述的这些序列转导到染色体内。核酸内切酶的引入可以诱导双链DNA的断裂位点(D)上的断裂，这可以造成暴露的同源序列之间(A和A’、C和C’之间)的配对，在相同时间在两个位点上引起被称作为BIR的反应，诱导出具有两个复制叉的滚环，并诱导基因复制。图3说明了这个过程。通过将核酸内切酶直接引入到细胞内或通过在细胞内表达编码所述酶的基因都可以实现核酸内切酶的作用。扩增所需的时间是12到14个小时。
另外，使用在序列(1)和(5)中所描述的那些双链DNA所扩增的菌落的出现频率要比将在序列(2)和(6)中所描述的那些序列与核酸内切酶一起使用所扩增的菌落的出现频率低，前者是后者的约1/5。但是，两种DNA的扩增所需的时间是相似的。
对于携带有上面序列(3)、(4)、(7)和(8)的质粒的转导，将发生与上面的反应基本相似的反应。携带有序列(4)和(8)的质粒的扩增时间是1到24个小时。
在上述反应的最后阶段中，在诱导了两个位点上的扩增基因(B和B’)之间的重组之后，去除上述的滚环，就可以获得含有扩增基因的双链DNA(图4)。因此，当B和B’是位于反向的方向或不含有对方的序列时，就没有去除滚环的最后的反应。
在培养细胞并从培养基或上清液中纯化之后，也可以生成大量的用于扩增的靶基因所编码的蛋白质。
本发明的实用性通过使用本发明的双链DNA，可以高度有效地并在短时间内实现基因扩增。因为用本发明的双链DNA所转导的细胞能生成大量的有价值的蛋白质，因此本发明的双链DNA可用于制备蛋白配制品和人工抗体。此外，因为这些细胞能保持大量的和长时间的稳定状态的基因表达，本发明的双链DNA也可用于基因治疗。此外，基因扩增与诱变作用的偶联可以产生具有预期功能的基因。
本发明的方法不仅能制备无糖基侧链的肽和蛋白质例如胰岛素，也能制备生产促红细胞生成素、G-CSF、抗体试剂等的高产微生物。
下面的实施例举例说明了本发明，但并不为了限制本发明的范围。
实施例1如图3的上面部分所示，构建了一个扩增单位，其包括URA3基因(SEQ ID NO2)、两种芽殖酵母基因组的同源序列(YF257394-YF258454(SEQ ID NO3)和YF267165-YF268121(SEQ IDNO4)，Gene bank登录号NC001138)、和位于2个HO序列(DSB，SEQ ID NO1)之间的用于扩增的选择标记基因lue2d(SEQ ID NO5)。用于扩增的选择标记基因lue2d起到了作为用于扩增的靶基因的双重作用。
用于扩增的选择标记基因lue2d是一组合成亮氨酸的酶中的一种。该基因的缺失抑制细胞在没有亮氨酸的培养基中的生长。因为所应用的leu2d缺失的基因缺少启动子序列的绝大部分，所以该酶的表达水平是非常低的，但是其仍保留了有限的酶活性。因此，该单个基因不足以让细胞在没有亮氨酸的培养基中生长，但是基因的扩增造成了具有弱活性的酶的积累并使得细胞能在没有亮氨酸的培养中生长。这个特点被用于选择具有扩增基因的细胞。
URA3基因被用于细胞选择，其中保留了基因的扩增单位而没有缺失，虽然在leu2d基因之间具有同源重组。在扩增单位的HO序列中诱导了DNA的双链断裂，并且所暴露的同源序列的末端与基因组的同源序列配对之后，生成了新的复制叉。如图3的中间部分所示，在两个位点上发生这种BIR反应，并且可以开始滚环型复制。在细胞周期内爆炸式地扩增滚环内的节段，并且所扩增的产物可以保留在细胞内。
实施例2将在实施例1中构建的扩增单位转导到芽殖酵母细胞株(LS20)内，其染色体含有具有被插入到GAL启动子下游的HO核酸内切酶基因的结构。分离出Ura+菌落，其中保留了基因的扩增单位而没有缺失，虽然在leu2d基因(标记基因)之间具有同源重组，将分离出的菌落接种在无亮氨酸的半乳糖培养基上，并诱导HO核酸内切酶的表达。培养来源于Leu+菌落的细胞，并在低熔点琼脂糖凝胶上制备染色体DNA。培养时间(包括在扩增后用于细胞生长的时间)约为4天。
用PFGE(脉冲场凝胶电泳)或FIGE(倒转电场凝胶电泳)分离染色体DNA，用琼脂糖凝胶电泳分离并用Southern印迹法分析经限制性内切酶XhoI消化过的DNA。
对于培养在无尿嘧啶的葡萄糖琼脂培养基上的菌落(无SD-Ura、HO核酸内切酶的诱导表达)和培养在无亮氨酸的半乳糖琼脂培养基上的菌落(有SG-Leu、HO核酸内切酶的诱导表达)，用PFGE分离出它们的染色体DNA，并用leu2d作为探针分析经琼脂糖凝胶电泳分离的XhoI消化过的DNA。在图5中显示了结果。(A)显示了经PFGE分离的染色体DNA的结果；和(B)显示了经琼脂糖凝胶电泳分离的XhoI消化过的DNA的结果。
在图6中显示了用Southern印迹法对扩增产物的结构分析。(A)显示了RET2探针对经PFGE分离的染色体DNA的分析结果；和(B)显示了用leu2d探针对经FIGE分离的染色体DNA的分析结果。
根据分析结果(图5)，用leu2d片段作为探针在宿主细胞株LS20中检测到了345kb的第3号染色体、8.9kb和约12.5kb的XhoI片段，其中第3号染色体被部分修饰。另一方面，在阴性对照(图5的第3和4列)检测到了292kb的第6号染色体(其中插入了扩增单位)、和插入所造成的11.6kb的XhoI片段，其中没有诱导HO核酸内切酶的表达。在图5B中，如用leu2d探针所检测的，观察到了XhoI片段(4.4kb、6.4kb、8.2kb、10.3kb)。
相反地，上述结果中的具有不同大小的条带在来源于具有HO核酸内切酶的诱导表达的菌落的细胞株中显示强信号。基于信号的模式，这些细胞株被粗略地分成4组。
第一组(第35、43、44、47、54、58、63列)显示了对扩增过程的假设所预期的模式，根据大小可以推论出其在第6号染色体中含有5到7个leu2d。
第二组(第45、49、56、57、66、70、72列)显示了在PFGE分析中的具有大分子尺寸的DNA条带的强信号，它们是非预期的XhoI片段。后续分析说明这些条带含有高度重复序列(包括预期序列的部分反向序列)，并且它们含有超过数十个leu2d拷贝。
用位于扩增单位的插入位点的着丝粒侧的RET2探针的分析也说明这些条带是在染色体上被扩增的(图6A)。这些条带显示了(A)中在超过约650kb的分离阈值的区域内和孔(well)附近的强信号，并可能反映了极高的扩增。从(A)中的扩增产物的大小上看，提示菌落66含有13个leu2d拷贝，菌落49含有29个拷贝，菌落57含有38～54个拷贝，并且其他的菌落含有更多的leu2d拷贝。因为(A)中的这些条带都是清晰条带，因此它们的结构可能是相对稳定的。
第三组(第36、38、42、46、48、50、51、53、55、59-62、64、65、67-69列)显示含有扩增单位的第6号染色体的大小没有变化，但是显示出了XhoI片段模式上的差异。FIGE分析使得在该组中检测到了约23.5kb的分子(图6B)。后续分析提示所述分子是小染色体，其中扩增单位的插入位点的端粒侧的序列具有回文样结构。通过没有leu2d扩增的重排可以生成含有除上述细胞株以外的其他细胞株的第四组。
如在本发明的基因组上的基因扩增系统中所看到的，在第二组中观察到了特别高的扩增反应。
比较例1如在实施例1中所述构建一个扩增单位，其中芽殖酵母基因组的两种同源序列按彼此正向排列。如与在实施例2中所述相同的方式处理扩增单位。
在图7和8中显示了在比较例1和在实施例2中所生成的菌落以及它们的细胞数目。根据菌落计数，实施例2比比较例1生成了大约多6.3倍的菌落。
在这个比较例1中，可能没有发生BIR反应，因此可能没有发生基因复制。
实施例3在从图1构建的扩增单位中去除位于两个HO序列(SEQ ID NO1)之间的URA3基因(SEQ ID NO2)之后，构建出一种扩增单位，其包括芽殖酵母基因组的两种同源序列(YF257394-YF258454(SEQ IDNO3)和YF267165-YF268121(SEQ ID NO4，Gene bank登录号NC001138))和一种用于扩增的选择标记基因leu2d(SEQ ID NO5)，如图10所示。
如与在实施例2中所述相同方式处理扩增单位。换句话说，将扩增单位转导到芽殖酵母细胞株(LS20)内，并将其接种在葡萄糖培养基(无尿嘧啶)上以及半乳糖培养基(无亮氨酸)上。从前者和后者的平板中分别挑起两个菌落(第7和8列)和四个菌落(第77到80列)，使得它们生长在相同的培养基上，并用脉冲凝胶电泳分析，以便检查每个菌落的染色体。总的培养时间约为4天。
图11显示了结果。在图中，(A)代表直接电泳的结果，和(B)代表经限制性内切酶XhoI消化后的电泳的结果。来自前者平板的菌落表现出与原始细胞相同的模式，而所有的后者菌落都表现出leu2d的扩增。特别地，第78和80列的菌落显示出染色体上的leu2d的高度扩增。
实施例4如在图12(A)所示的，通过整合扩增单位构建出用于扩增的质粒pBIA，其包括3个HO序列(DSB，SEQ ID NO1)、URA3基因(SEQID NO2)、ARS1基因(SEQ ID NO6)、LUC基因(SEQ ID NO7)、CEN4基因(SEQ ID NO8)、GFP基因(SEQ ID NO9)和用于扩增的选择标记基因leu2d(SEQ ID NO5)。
通过使用基于醋酸锂法的转化试剂盒(Frozen-EZ YeastTransformation IIZYMO RESEARCH，Cat No.T2001)，将质粒pBIA转导到具有含有HO核酸内切酶基因被插入到GAL启动子的下游的结构的染色体的芽殖酵母细胞株(LS20)内。将该酵母细胞在无尿嘧啶的培养基中生长到对数期中期，离心收集，用无菌水洗涤两次，稀释到不同的浓度，将其涂布到具有与上述相同的培养基(除了含有作为糖源的半乳糖以及不含有尿嘧啶和亮氨酸)的琼脂培养板上，并在30℃或25℃下培养。总的培养时间约为4天。在4-5天之后，计数菌落数目。在涂布到具有完全合成葡萄糖(2％)的琼脂培养基上之后，计数活细胞数目。
在用PFGE(脉冲场凝胶电泳)或FIGE(倒转电场凝胶电泳)分离染色体DNA以及用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶XhoI消化过的DNA之后，用Southern印迹法分析。在图13中显示了Southern印迹法对扩增产物的结构分析的结果。(A)显示了用RET2探针对经PFGE分离的染色体DNA的分析结果；以及(B)显示了用leu2d探针对经FIGE分离的染色体DNA的分析结果。SD-Ura代表在无Ura和SG-Ura的葡萄糖培养基中培养的菌落，而Leu代表在Leu-Ura-半乳糖培养基中所选择出的菌落。
电泳的结果显示通过断裂pBIA(本发明的一种质粒)的双链断裂位点(DSB)可以将leu2d基因扩增到3-5个拷贝。在图13(A)的SD-Ura样品的大小范围约为17～19kb的线性DNA中观察到了环型质粒pNotBIA和pBIA。相反地，在图13(A)的SG-Ura，Leu的约12～20kb的位置上，观察到BIA样品中仅涂布在无亮氨酸培养基上的菌落所具有的唯一条带。因为线性DNA通常造成比环型DNA更强的条带，因此根据与上述的环型质粒pBIA的比较，该条带被归结于线性DNA。如图14所示，条带的大小与扩增直接相关，13.39kb的条带可能意味着3个拷贝的leu2d基因，18.85kb可能意味着5个拷贝。
图13(B)显示了在用ClaI切割之后的琼脂糖凝胶电泳的结果，并且条带的强度和尺寸的相关性与上述的结果一致。
比较例2如图12(B)的结构所示，利用与实施例4相似的质粒和基因构建质粒pNotBIA。用与实施例4相同的方法处理该质粒。比较了在半乳糖的诱导下从含有实施例4和比较例2的质粒(pBIA和pNotBIA)的细胞株(LS20)中获得的Leu+Ura+菌落的数目。在图15中显示了结果。该图显示质粒pBIA的应用造成了更多的扩增。
利用本发明的方法，通过检查作为扩增部位的染色体和质粒(实施例2到4)确认了高水平的扩增。用本发明的方法获得了至少扩增到数十个拷贝的菌落。其中，一些菌落被扩增到多于100个拷贝。与质粒的整合使得能容易地改变扩增单位的结构并且改变待转导的宿主。
权利要求
1.一种包括(a)A-C排列和(b-1)A’-C’排列或(b-2)A’-C’的反向排列的双链DNA，其中A和A’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且A和A’中的其中一个是另一个的反向方向；C和C’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且C和C’中的其中一个是另一个的反向方向；并且A和C中的至少一个包括用于扩增的靶基因，并且在A、A’、C和C’之间可以插入任何DNA序列。
2.一种包括(a)A-B-C排列和(b-1)A’-B’-C’排列或(b-2)A’-B’-C’的反向排列的双链DNA，其中A和A’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且A和A’中的其中一个是另一个的反向方向；B和B’是扩增节段，其中B和B’中的至少一个含有至少一种用于扩增的靶基因，C和C’都是双链DNA片段并能进行相互同源重组，并且C和C’中的其中一个是另一个的反向方向；并且在A、A’、B、B’、C和C’之间可以插入任何的DNA序列。
3.权利要求2的双链DNA，其中B和B’是扩增节段，每个节段都含有至少一种以相同方向排列的用于扩增的靶基因，并且B和B’能进行相互同源重组。
4.权利要求3的双链DNA，其中B和B’都含有一种以相同方向排列的用于扩增的选择基因。
5.权利要求1的双链DNA，包括A-C-A’-C’排列，其中的符号的意义与前面相同。
6.权利要求5的双链DNA，包括A-C-D-A’-C’排列，其中D代表含有至少一个核酸内切酶的断裂位点的双链DNA片段，其他的标识与上面的标识相同。
7.权利要求2到4任一项的双链DNA，包括A-B-C-A’-B’-C’排列，其中标识与上面的标识相同。
8.权利要求7的双链DNA，包括A-B-C-D-A’-B’-C’排列，其中D代表含有至少一个核酸内切酶的断裂位点的双链DNA片段，其他的标识与上面的标识相同。
9.权利要求1的双链DNA，包括(a)E’-A-C排列和(b-1)A’-C’-E排列或(b-2)A’-C’-E的反向排列或者包括(c)A-C-E排列和(d-1)E’-A’-C’排列或(d-2)E’-A’-C’的反向排列，其中E代表端粒序列，E’代表E的反向序列，其他的标识与上面的标识相同。
10.权利要求9的双链DNA，包括排列D-E’-A-C-D-A’-C’-E-D、D-E’-A-C-D-E’-C”-A”-D、D-A-C-E-D-E’-A’-C’-D或D-A-B-C-E-D-C”-B”-A”-E-D，其中C”-A”代表A’-C’的反向排列。
11.权利要求2到4任一项的双链DNA，包括(a)E’-A-B-C排列和(b-1)A’-B’-C’-E排列或(b-2)A’-B’-C’-E的反向排列或者包括(c)A-B-C-E排列和(d-1)E’-A’-B’-C’排列或(d-2)E’-A’-B’-C’的反向排列，其中E代表端粒序列，E’代表E的反向序列，其他的标识与上面的标识相同。
12.权利要求11的双链DNA，包括排列D-E’-A-B-C-D-A’-B’-C’-E-D、D-E’-A-B-C-D-E’-C”-B”-A”-D、D-A-B-C-E-D-E’-A’-B’-C’-D或D-A-B-C-E-D-C”-B”-A”-E-D，其中C”-B”-A”代表A’-B’-C’的反向排列。
13.一种含有权利要求1到12任一项的双链DNA的重组载体。
14.一种导入了用权利要求1到8任一项的双链DNA的转化体。
15.一种导入了权利要求9到12任一项的双链DNA的重组质粒。
16.一种基因扩增的方法，包括制备权利要求14的转化体的步骤和扩增该基因的步骤。
17.权利要求16的基因扩增的方法，其中当双链DNA被表示为A-C-D-A’-C’或A-B-C-D-A’-B’-C’时，在扩增所述基因的步骤中用核酸内切酶处理转化体，其中标识与上面的标识相同。
18.基因扩增的方法，包括将权利要求15的质粒转导入细菌的步骤和培养该细菌的步骤。
19.生产由用于扩增的靶基因所编码的蛋白质的方法，包括培养用权利要求16到18任一项的方法获得的细胞或细菌的步骤。
全文摘要
本发明提供了一种为高速基因扩增而特别构建的双链DNA，一种利用双链DNA进行基因扩增的方法以及一种生产蛋白质的方法。根据体内基因复制的机制构建了一种诱导高速人工基因扩增的系统(BIR)。构建了包括排列A－B－C和A’－B’－C’或A’－B’－C’的反向排列的双链DNA。A和A’是能进行相互同源重组的双链DNA片段，并且所述DNA片段以反向方向相互排列；B和B’是扩增节段，其中所述基因中的至少一个或另一个含有用于扩增的靶基因；C和C’是能进行相互同源重组的双链DNA片段，其中所述DNA片段以反向方向相互排列，在C和C’之间可以插入任何DNA序列。可以去除B和B’，在这种情况中，A或C可以是用于扩增的靶基因。将双链DNA整合到染色体或质粒内，并且对切割任意的特异序列的酶的诱导诱导特异位点上的断裂，这就启动了高速的基因扩增。
文档编号C12N1/21GK1886504SQ20048003473
公开日2006年12月27日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月25日
发明者堀内嵩, 渡边孝明 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构