专利名称：白介素1β特异分子小鼠光学成像系统的建立及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种转基因非人哺乳动 物的用途，以及利用所述动物筛选抗炎症物质的方法。
背景技术：
炎症，是指组织或器官对有害刺激或损伤所产生的一种防御反应。机体的 这种炎症反应机制，可以抵御微生物的入侵，促进组织损伤的修复，但过于剧 烈的炎症反应，却可使组织坏死，造成功能障碍，甚至可迅速危及病人的生命， 如SARS，急性重症肝炎等；而长期的不适当的炎症反应是许多慢性疾病的重要
病理机制，如肝硬化、慢性肾炎、风湿性关节炎等。最近的研究还显示，许多
肿瘤的发生和发展也与长期的炎症反应有密切的关系；而动脉硬化、神经退行 性疾病、糖尿病等在一定程度上也可以看成一种炎症反应。
炎症反应是一个非常复杂的过程，许多细节还有待进一步的深入研究，其 中最典型的是大量炎症细胞向炎症部位的聚集和侵润，以及大量炎症因子在体 内的表达。
因此，建立可以用于炎症研究和抗炎症药物筛选的模型，对于研究和开发 新的抗炎症类药物，治疗一大类涉及人类重大健康问题的疾病是非常有价值 的。而现有的炎症研究模型往往因不是体内模型而无法真实地反映体内炎症进 程，或者需要通过把动物模型在不同的时间点宰杀进行研究，操作复杂且研究 成本高，限制了抗炎症药物的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因非人哺乳动物的用途。 本发明的另一目的在于提供利用所述转基因动物作为模型，筛选抗炎症药 物的方法。
在本发明的第一方面，提供一种转基因非人哺乳动物的用途，所述动物的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件白 介素1P启动子，报告基因，终止子；所述的转基因动物用于筛选抗炎症的物 质。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴。 优选的，所述的非人哺乳动物是鼠；更优选的是小鼠。
在另一优选例中，所述表达盒中，在白介素1P启动子之前，还含有鸡cHS4 绝缘子基因。
在另一优选例中，所述表达盒从5'到3'端由以下元件构成白介素1P 启动子，报告基因，终止子；或者由以下元件构成鸡CHS4绝缘子基因，白介
素1P启动子，报告基因，终止子。在各元件之间，还可含有不影响基因表达 的一些序列，如为了连接各元件而设置的酶切位点的部分序列。
在另一优选例中，所述的报告基因选自荧光素酶编码基因，绿色荧光蛋 白编码基因，或红色荧光蛋白编码基因。优选的，所述的报告基因是荧光素酶 编码基因。
在另一优选例中，所述的白介素lP启动子具有白介素ie转录起始位点上
游(-100土99b) (-4. 5±0. 5kb);优选的是转录起始位点上游(-50±4%) (-4. 5±0. 2kb)的序列。
在另一优选例中，所述的白介素lP启动子具有从白介素ie转录起始位点 (即-lb)到上游-4. 5kb的序列。
在另一优选例中，所述的终止子是猿猴病毒40的晚聚(A)终止信号(SV40 late poly (A) signal)。
在另一优选例中，所述的炎症是白介素l P介导(或参与)的炎症。
在本发明的第二方面，提供一种制备转基因非人哺乳动物的方法，所述方 法包括将一基因表达盒转入动物的受精卵中，培育所述受精卵从而获得所述 转基因非人哺乳动物；
其中，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件白介素ie启动子，
报告基因，终止子。
在另一优选例中，所述表达盒中，在白介素1P启动子之前，还含有鸡cHS4 绝缘子基因。在本发明的第三方面，提供一种筛选抗炎症的潜在物质(如化合物)的方 法，所述方法包括步骤
(1) 引发转基因非人哺乳动物的炎症反应，所述的转基因非人哺乳动物的 基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件
白介素ie启动子，报告基因，终止子；
(2) 将候选物质给予转基因非人哺乳动物；
(3) 检测动物体内报告基因的表达；其中，若所述候选物质可抑制报告基 因的表达，则表明该候选物质是抗炎症的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(1)和步骤(2)可同时进行；或依次进行，即先进行 步骤(1)再进行步骤(2)，或相反。
在另一优选例中，所述的报告基因是荧光素酶编码基因，并且在步骤(2) 中，在将候选物质给予转基因非人哺乳动物后，给予动物荧光素底物，利用活 体成像系统检测动物体内的荧光素酶表达情况。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的 动物试验、细胞实验和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的抗炎症作 用。
在另一优选例中，给予非人哺乳动物选自(但不限于)下组的试剂引发炎 症反应脂多糖、酵母聚糖、唑酮。
在另一优选例中，引发非人哺乳动物炎症反应的试剂的剂型为肠胃内给 药剂(如口服剂，栓剂)，或注射试剂(如针剂)，或外用剂(如搽剂)。
在另一优选例中，给予非人哺乳动物荧光素底物的剂型为肠胃内给药剂 (如口服剂)，或注射试剂(如针剂)。
在本发明的第四方面，提供一种来源于所述的转基因非人哺乳动物的细 胞，所述的细胞的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次
具有以下元件白介素ie启动子，报告基因，终止子。
在另一优选例中，所述的细胞为非胚胎干细胞或生殖细胞。优选地，所述 的细胞为体细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图i.人的白介素ie基因报告载体的示意图。白介素ie基因表达调控区
约4. 5kb克隆到荧光素酶基因的上游。
图2.含有力/Z-7;驱动的荧光素酶报告基因的载体。人的白介素1P基因 上游调控区约4. 5kb克隆到荧光素酶基因的上游。
图3. PCR鉴定转基因小鼠。1: 2,000 DNA marker; 2， 3， 4:阴性小鼠鉴
定的结果；5， 6， 7， 8:阳性小鼠鉴定的结果。
图4.小鼠体外荧光信号与小鼠内源性白介素1P的表达的情况的一致性验证。
A，体外荧光检测转基因小鼠在LPS刺激下的组织荧光的结果。
B，实时定量PCR检测各个组织中内源性白介素ie在LPS刺激下的变化情况。
图5.体内(In vivo)测定转基因小鼠的体内荧光。
图6.利用体内成像系统显示转基因阳性小鼠在LPS刺激下的时间变化曲 线图。其中，
A，体内成像系统显示转基因阳性小鼠在LPS剌激下不同时间的荧光图； B， Livinglmage软件获取小鼠体内化学发光数值。
图7.检测力iZ7"-Z"c转基因小鼠在急性关节炎中的表达情况。其中， A，在活体成像仪下观察小鼠关节处的荧光变化的情况。 B， Livinglmage软件处理显示小鼠关节处的化学发光情况。
图8.检测力几/P-Z"c转基因小鼠在迟速超敏反应中的表达情况。其中，
A. 小鼠活体成像显示荧光素酶的表达；
B. Livinglmage软件处理定量显示小鼠耳朵处的化学发光情况。图9.地塞米松对LPS诱导的白介素1P的表达抑制。
A. 地塞米松能够显著的抑制小鼠体内受LPS诱导的荧光素酶的表达。
B. 通过Livinglmage软件计算全身小鼠荧光素酶的表达情况。
具体实施例方式
本发明人经过广泛且深入的研究，出乎意料地发现，以人的白细胞介素1 P (白介素IP, Interleukin 113，简称IL-1 P )的启动子驱动报告基因为 载体，通过显微注射的方法获得含有此种载体的转基因动物，这种转基因动物 在活体成像系统中可良好地模拟反映IL-1P在体内的表达情况。转入所述基因 的动物可以作为动物模型，用于筛选抗炎症的药物，该筛选方法操作简单，直 观且灵敏度高，对动物的损伤小，可以实现实时连续地观察动物体内的白细胞 介素1P在有关药物的作用下的一个动态反应过程，无需宰杀动物。在此基础 上完成了本发明。
本发明的方法基于活体动物体内光学成像技术(optical in vivo imaging) 而进行，即通过生物体内的光学成像直接监控活体生物体内的细胞活动和基因 行为。与传统的在不同时间点宰杀动物以获得数据的方式不同，体内成像通过 对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基 因)的移动及变化，所得的数据更加真实可信。并且，不涉及放射性物质和放 射性操作，非常安全。体内光学成像可利用荧光或生物发光来实现，荧光技术 是采用荧光报告基团(GFP、 RFP、 Cyt及dyes等)进行标记，而生物发光是用荧 光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA。
但是，尽管体内光学成像技术已经被用于观测活体动物内肿瘤的生长及转 移、某些特定基因的表达等，然而由于针对的是活体动物，对于不同种基因、 不同种疾病，如何建立合适的动物模型、选择怎样的基因表达方式、是否能够 正确地反映基因表达情况或疾病过程、以及如何使得体内其它不相干因素的干 扰减小，均是需要深入研究和探讨的问题。
模式动物的构建及其用途
本发明人选择人白细胞介素1 P的启动子区域克隆连接到报告基因编码区的5'上游区，意外地发现含有上述载体的转基因动物，在活体成像系统中可 良好地模拟反映IL-1P在体内的表达情况。IL-ie是一种重要的炎症因子，参 与大部分炎症病理过程，而且作为一种前炎症因子对炎症的发生、发展有重要
作用。在许多疾病如类风湿性关节炎、休克中都可检测到iL-ie的表达；而且
许多研究已表明，抑制IL-的表达可以抑制炎症的发生。
本发明中，所述的非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴；所述
的非人哺乳动物在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发
病机制等方面和人类接近。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠；更优选的是小鼠。
作为本发明的优选方式，以小鼠作为模式生物，和人类相比，它无论在基 因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都和人类非 常接近，因此可良好地应用于人类疾病发病机制、药物药理学研究等方面。
所述的转基因非人哺乳动物的构建方法包括将一基因表达盒通过显微注 射的方法导入动物的受精卵中，培育所述受精卵从而获得所述转基因动物；其 中，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件白介素ie启动子，报告基
因，终止子。
所述的白介素l e启动子具有白介素l J3转录起始位点上游(-100±9%) (-4. 5±0. 5kb)(优选的是转录起始位点上游(-50士49b) (-4. 5±0. 2kb)的序 列。该区域为白介素ie的上游调控区，其与报告基因连接后可良好地指导报 告基因在体内的表达，从而可真实地、灵敏地反映动物体内白介素1P的表达 情况。
作为本发明的优选方式，所述的报告基因选自荧光素酶编码基因，绿色 荧光蛋白编码基因、或红色荧光蛋白编码基因。更优选的，所述的报告基因是 荧光素酶编码基因，该基因催化底物所发出的荧光信号受动物体内的自体荧光 的干扰小，可以特异灵敏地被检测到。克隆在白介素l P的上游调控区的3'端， 受白介素1P的上游调控区指导表达。
所述的基因表达还包括终止子，适当终止子的选择和构建是本领域熟知的 技术，本发明中可以采用本领域已知的终止子。优选的，所述的终止子是猿猴 病毒40的late poly(A)终止信号。作为本发明的优选方式，所述表达盒中，在白介素ie启动子之前，还含 有cHS4基因。所述的cHS4基因是一种绝缘子基因，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。cHS4的加入可使得所述基因表达盒在表达时不受染色体构像，特别 是该表达盒周围其它基因的干扰，本发明中在启动子前放置绝缘子的绝缘隔离 作用良好。
所述的基因表达盒被导入动物的受精卵中，通过培育所述受精卵从而获得 所述转基因动物。培育受精卵使之生长发育通常需要将受精卵重新移植到母体 的子宫内进行，成熟后由母体分娩，从而获得可遗传的转基因的动物品系。所 述的转基因动物还可通过交配，从而获得后代动物，可从后代动物中找出基因 组中携带所述表达盒的动物。
在本发明的实施例中，本发明人利用转基因小鼠(报告基因为荧光素酶基 因)建立各种炎症模型，通过活体动物体内光学成像仪器检测这些转基因阳性 小鼠体内的荧光信号，再通过体外实验RT-PCR和蛋白印迹观察内源性IL-1P 的表达情况，结果发现(1)所述转基因小鼠能够成功表达报告基因荧光素酶； (2)通过体内体外实验分析，该转基因小鼠的荧光信号忠实地反映了内源性的 IL-1P在相应的炎症模型下的表达情况；(3)在几种典型的炎症模型-脂多糖 休克、急性关节炎、迟发性超敏反应中，小鼠能够如实地反映相应炎症反应的 过程。
上述结果表明，本发明人已经成功地用报告基因来反映机体中IL-1P基因 在一些典型的炎症模型中的变化情况，具有灵敏，快速，经济等优点。而且， 活体成像系统对动物荧光的检出便捷、无创伤，能够实时连续跟踪各个时间点 的情况。
本发明还提供了所述转基因动物的用途，所述的转基因动物用于筛选抗炎 症的药物。更特别的，所述的炎症是白介素1P介导参与的炎症。
所述的转基因动物可实现在活体中实时观察被标记的炎症细胞在炎症发 生时的迁移状况，观察白介素ie的表达变化，并利用这些指标来研究抗炎症 药物的作用，筛选具有潜在抗炎作用的物质。
此外，本发明还提供了一种来源于所述转基因非人哺乳动物的细胞，所述的细胞的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次具有以 下元件白介素1P启动子，报告基因，终止子。所述的细胞为非胚胎干细胞 或生殖细胞。优选地，所述的细胞为体细胞。
筛选方法
技术领域：
本发明利用转基因技术，获得含有由白介素1P启动子驱动的报告基因的 报告系统的转基因动物，可应用这种动物进行炎症疾病的研究以及相应的抗炎 症药物的筛选。利用本发明构建的转基因动物模型筛选药物，兼有分子或者细 胞筛选模型在机制研究方面的便利，又有动物模型在疾病模拟和药物整体作用 方面的优势，是药物筛选和评价的良好模型，并且对于研究和筛选复合药物， 例如中药及其复方的药物筛选和研究具有重要意义。
作为本发明的一个方面，提供了一种筛选具有抗炎症效应的潜在物质(如
化合物)的方法，所述方法包括步骤(1)引发转基因动物的炎症反应，所述 的转基因动物的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次 具有以下元件白介素ie启动子，报告基因，终止子；(2)将候选物质给予 步骤(l)的转基因动物；和(3)检测动物体内报告基因的表达；其中，若所述 候选物质可抑制报告基因的表达，则表明该候选物质是抗炎症的潜在物质。其 中，步骤(1)和步骤(2)可同时进行；或依次进行，即先进行步骤(l)再进行步 骤(2)，或相反，步骤的先后可视试验情况而定。
由于白介素ie是一种重要的炎症因子，参与绝大多数的炎症病理过程， 因此，绝大多数可导致炎症的物质均可用于本发明来引发动物炎症反应，本发 明不作特别的限定。优选的，所述的炎症反应是白介素1P介导参与的炎症反 应。作为本发明的优选实施方式，可给予动物下组的试剂以引发炎症反应脂 多糖、酵母聚糖、唑酮。
对于引发动物炎症反应的方法也没有特别的限制，可通过注射或肠胃内给 药等方式来引发动物局部或全身的炎症反应。因此，引发动物炎症反应的试剂 的剂型为(但不限于)肠胃内给药剂(如口服剂，栓剂)，或注射试剂(如针剂)， 或外用剂(如搽剂)。
作为本发明的优选方式，所述的报告基因是荧光素酶编码基因，并且在步 骤(2)中，在将候选物质给予转基因动物后，给予动物荧光素(作为荧光素酶 的底物)，利用体内成像系统检测动物体内的荧光素酶表达。荧光素的给予方法没有特别的限制，可通过腹腔注射或静脉注射肠胃内给予等方式来进行。因此， 给予动物荧光素试剂的剂型为肠胃内给药剂(如口服剂)，或注射试剂(如针剂)。 上述筛选出的潜在物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细 胞实验、动物试验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的抗炎症作 用。
与利用传统的动物模型进行药物筛选相比较，利用本发明的转基因动物模 型进行筛选能够实现成体通量地评价有关候选物质。
在本发明的优选实施例中，利用目前已经证实具有抗炎作用的化合物验证 能否抑制发生炎症反应的转基因动物模型当中的报告基因的表达，从而验证本 发明的转基因动物模型的灵敏性，以及抗炎化合物的抗炎作用机制，评价抗炎 化合物的抗炎效果。具体地，本发明人利用已经证实有抗炎作用的地塞米松对 脂多糖(LPS)诱导的炎症转基因小鼠体内荧光素酶表达的影响。实验结果表明，
地塞米松能够抑制白介素ie启动子的活性，从而抑制受白介素ie调控的荧
光素酶的表达。
检测动物体内报告基因的表达可采用本领域已知的技术，优选的是采用活 体内光学成像技术来检测或观察。本发明中，所述的光学成像系统是一种可发 射光并可使光穿透实验动物的组织，同时可由仪器量化检测到的光强度的系 统。通常，所述的光学成像系统主要由镜头、成像暗箱和软件系统组成。所述 的光学成像系统可以通过商购的方式获得。
本发明的主要优点在于
(1) .本发明人出乎意料地发现以人的白介素ie的启动子克隆到报告基因 的5'端上游区驱动相应报告基因的表达的载体，将这样的载体通过转基因技 术导入动物受精卵中获得相应的转基因动物，检测到的相应报告基因的表达情 况能够忠实地反映iL-ie在体内的表达情况，并且受体内其它不相干因素的干
扰少，特异性很强，比通过Northern印迹、Western印迹等传统分子生物学手 段检测内源性的IL-IP响应刺激的反应更加方便。
(2) .因为动物体内的荧光可以通过活体动物体内光学成像系统检测出来， 而不需要解剖动物，这样就能实现实时跟踪各个时间点动物的情况。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的 实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进 行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，所得的数据更加 真实可信。
(3).在活体上直接对报告基因进行测定，因此操作简单、检测方法通用、 速度快、灵敏度高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l构建含有IL-ie驱动的荧光素酶报告基因的载体
设计如下引物
IL-ip上游引物(SEQ ID NO: 2):
5， AAATGAGTGACTTCCCCATGACGGC 3';
IL-lp下游引物(SEQ ID NO: 3):
5' CCCTGGATAAGTGGTACCAGAGCCC 3，；
通过常规PCR技术从人的单核巨嗜细胞系U937 (购于中科院生化细胞所细 胞库)的基因组中扩增出IL-IP从转录起始位点向上约4.5kb的上游调控区 (SEQ ID NO: 8)，然后利用Kpn I和Bgl II双酶切后插入到经过同样酶切的载 体pGL3-Basic (Promega)的荧光素酶报告基因(luciferase)的上游，得到一个 由人IL-1 13上游调控区控制的报告基因载体pGL3-IL-l P 。
设计如下引物
cHS4上游引物(SEQ ID NO: 4):
5， GCTGGTACCTCACTGACTCCGTCCT 3，；cHS4下游引物(SEQ ID NO: 5):
5， ATCGGGCCCGGAGCTCACGGGGACAGC 3，；
通过常规PCR技术从鸡的基因组中扩增出绝缘子cHS4基因，然后利用 Kpnl和Apal双酶切后插入到经过同样酶切的载体pGL3-IL-l 0中，获得载体 pILlP-Luc-SV40 1atepoly(A)，用于后续转基因小鼠的制备。cHS4可防止转基 因插入位点附近的序列对转基因载体的干扰，其基因序列如SEQ ID NO: l所 示。
实施例2获得含有IL-1 e驱动的荧光素酶报告基因的转基因小鼠 2. 1线性化载体
用Not I和Sal酶切载体，获得线性化的pILl P -Luc-SV40 late poly (A)， 并且割胶回收目的片断。
2.2转基因质粒的显微注射
通过显微注射技术得到含有上述载体的转基因阳性小鼠(hILl P -Luc转基 因小鼠)，转基因小鼠制备实验方法具体方法如下
1、 选取7 8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右， 每只小鼠腹腔注射孕马血清PMSG(10U)。
2、 47 48小时后，每只小鼠腹腔注射人体绒(毛)膜促性腺激素HCG(0. 8U)， 并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红， 与结扎公鼠合笼。
3、 第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出 作好隔离措施。
4、 10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶 M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流 出。
5、 仔细观察放在透明质酸酶M2液(Sigma， M5910)中的受精卵，当受精卵 周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液 (Sigma， M7292)中放入5%C02， 37。C培养箱培养。
6、 在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受 精卵待用。7、 安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入 一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。pILl e -Luc-SV40 late poly (A) 的DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、 在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使pILlP-Luc-SV40 1atepoly(A) 的DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射 针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出，注射完毕，放入5%0)2， 37'C培养箱培养。
9、 将受体麻醉，注射剂量为1%戊巴比妥钠0. 01ml/g，腹腔注射。手术取 出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后 经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取 受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段 液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致lcm左右，气泡O. 2cm左 右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹 部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝 合肌肉和皮肤。
10、 受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可 初步判断怀孕。手术后19 21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾， 检测。
2.3转基因小鼠的鉴定
先用PCR的方法鉴定获得的仔鼠中是否存在阳性小鼠，PCR引物为:
Luc-上游引物(SEQ ID NO: 6):
5' TTCCGCCCTTCTTGGCCTTTATGA 3，；
Luc-下游引物(SEQ ID NO: 7):
5， CAGCTATTCTGATTACACCCGAGG 3';
经鉴定，共获得了6个首建者小鼠品系，部分鉴定结果如图3所示。
2.4杂合子小鼠繁育、筛选
将上述鉴定到的阳性小鼠与c57小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任 公司)进行杂交，繁殖出相应的首建者小鼠的下一代；然后对相应小鼠品系的 后代进行体内荧光测试，筛选出最能符合要求的首建者。本发明人选用的筛选模型为脂多糖(LPS)刺激试验。最后获得小鼠首建者 在刚LPS注射完时的荧光信号最低，经LPS刺激5小时候荧光信号最强。为了加 强荧光检测信号的灵敏性，本发明人将此首建者的小鼠与Balb/c小鼠(购自上海 斯莱克实验动物有限责任公司)进行杂交5代后，选择阳性的小鼠(力""-Z"c 小鼠)用于后续试验。
2.5检测转基因小鼠能否反映体内IL-ie的情况
本发明人用于小鼠体内荧光信号的检测的仪器是NightOWL(活体)冷光荧 光影像分析仪。为证明能否利用NightOWL(活体)冷光荧光影像分析仪检测转基 因小鼠的荧光，这种仪器检测到的信号是否与体外常用仪器检测到的信号一 致，以及证明这种仪器检测到的信号是否与内源性的IL-1P转录特性相类似； 即此转基因小鼠到底在多大程度上再现了内源性IL-ie的转录情况，进行了体 外荧光素酶的检测试验和RT-PCR的测定。
转基因阳性的雌性成年小鼠(11=3)，腹腔注射3mg/kg的脂多糖(LPS)， 5小时后，迅速解剖取出各个脏器心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，十二指肠，胃， 大脑，小脑。冰上匀浆器碾磨，迅速冻存在-7(TC。再进行体外荧光试验(Exvivo Luc assay)。再用Bradford法测定相应组织的蛋白含量。相同方法测定未注 射LPS的转基因阳性小鼠相应组织作为对照，见图4A 。
取转基因阳性的雌性成年小鼠(11=3)，腹腔注射3mg/kg的LPS， 5小时后，
迅速解剖取出各个脏器心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，十二指肠，胃，大脑， 小脑。抽取相应的mRNA，然后利用反转录试剂盒反转录成相应cDNA。然后， 通过常规的实时定量PCR的方法确定相应组织中白介素1 e基因的表达情况， 见图4B。
测定结果表明，荧光素酶的表达情况与体内的白介素1P基因表达情况一 致，在脾脏和肺部表达较高。
用LPS刺激转基因小鼠(腹腔注射3mg/kg)，以未刺激的转基因小鼠作为对 照，在活体光学检测下，可以发现转基因小鼠体内荧光素酶迅速升高，如图5 所示，转基因阳性小鼠在LPS刺激5小时后，能够明显的观察到小鼠体内的荧 光素酶的表达，而野生型小鼠则不能检测到任何明显的荧光信号。这说明了 W丄7》-丄wc转基因小鼠能够表达荧光素酶并且能够响应LPS的刺激。
小鼠活体成像的过程如下在小鼠体内腹腔注射150ul的荧光素酶底物(浓度15mg/ml)， 5分钟后开始麻醉小鼠，在12-15分钟的时候将小鼠放于成像系 统(精诺真活体成像系统IVIS 100，购自Xenogen公司)的暗箱中开始成像。
实施例3脂多糖休克的研究
成年雌性力/Z7^-Z"c小鼠通过腹腔注射LPS(3mg/kg)，然后，利用体内成 像系统显示小鼠体内不同时刻的荧光素酶表达的情况。
结果见图6，结果显示，在LPS的刺激下，小鼠体内的荧光素酶在1小时 内就迅速表达，在3小时的时候达到最高峰，然后开始缓慢地降落。
此外，通过与实施例l和2类似的方法，本发明人制备了以SEQ ID N0: 8 序列中第1-4460位驱动的荧光素酶报告基因的载体并转入小鼠，结果该小鼠 体内不同时刻的荧光素酶表达的情况与采用实施例l和2制备的转基因小鼠相 同。
实施例4急性关节炎的研究
进行急性关节炎模型研究，在3只雌性成年力/Z7^-Z"c小鼠的右脚腔内 注射酵母聚糖(300u g/只)，左脚则被注射对照缓冲液(含有5%葡萄糖的PBS)。 然后，在活体成像仪下观察小鼠关节处的荧光变化的情况。
结果见图7，本发明人发现，在酵母聚糖注射1小时的时候不能检测到明 显的荧光信号。在2小时的时候开始检测到荧光信号，到8小时达到最高峰； 然后，开始缓慢地降落。
实施例5迟发性超敏反应的研究
进行迟发性超敏反应的研究，在3只雌性成年力7Z7刀-Z"c转基因小鼠腹 腔注射2%唑酮(oxazolone) 50iU(-6d)。 6天后(0d)，在右耳朵注射10 ul 的1%的唑酮，在左耳朵注射10u 1的丙酮/橄榄油(4: l体积比)。在相应的时 间点检测小鼠耳朵的荧光素酶的变化情况。
结果如图8所示，迟发性超敏反应中，在小鼠耳朵的注射部位可以检测到 荧光素酶的表达，其表达模式和小鼠耳朵肿胀反应一致。
实施例6有关抗炎药物的研究
以地塞米松为试验药物，观察转基因小鼠在抗炎药物研究中的应用。两组雄性小鼠； 一组小鼠腹腔内同时注射LPS(3mg/kg)和地塞米松 (3mg/kg);另一组则同时注射LPS和生理盐水。
结果如图9所示，本发明人的结果表明，地塞米松能有效抑制LPS引起的 转基因小鼠的化学发光的量。药物注射5小时后，发现试验组的荧光素酶的表 达强度比对照组低3倍多。说明地塞米松能够抑制7"启动子的活性，从 而抑制受7"调控的荧光素酶的表达。
据文献报道，地塞米松确实能够抑制体内IL-的表达(Krakauer, T.， Inhibition of toxic shock syndrome toxin-l-induced cytokine production and Tcellactivationbyinterleukin-lO， interleukin_4， and dexaraethasone. J Infect Dis, 1995. 172(4): p. 988-92.)。因此，本发明 的结论是正确的。此外，可根据前述相同的方法，来验证其它试验物质对于
7^调控的荧光素酶的表达的影响，从而筛选出有用的药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110〉上海南方模式生物科技发展有限公司
<120〉白介素l P特异分子小鼠光学成像系统的建立及其应用
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<170〉 Patentln version 3. 3
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cacaggtgtctgaagcagccatggcag卿tacctgagctcgc466权利要求
1. 一种转基因非人哺乳动物的用途，所述动物的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5’到3’端依次具有以下元件白介素1β启动子，报告基因，终止子；所述的转基因动物用于筛选抗炎症的物质。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述表达盒中，在白介素ie 启动子之前，还含有鸡cHS4绝缘子基因。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的报告基因选自-荧光素酶编码基因.绿色荧光蛋白编码基因，或红色荧光蛋白编码基因。
4. 如权利要求i所述的用途，其特征在于，所述的白介素ie启动子具有白介素l e转录起始位点上游(-100土99b) (-4. 5±0. 5kb)。
5. —种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述方法包括 将一基因表达盒转入动物的受精卵中，培育所述受精卵从而获得所述转基因非 人哺乳动物；其中，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件白介素1P启动子， 报告基因，终止子。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达盒中，在白介素1)3 启动子之前，还含有鸡cHS4绝缘子基因。
7. —种筛选抗炎症的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(1) 引发转基因非人哺乳动物的炎症反应，所述的转基因非人哺乳动物的 基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件 白介素ie启动子，报告基因，终止子；(2) 将候选物质给予转基因非人哺乳动物；(3) 检测动物体内报告基因的表达；其中，若所述候选物质可抑制报告基 因的表达，则表明该候选物质是抗炎症的潜在物质。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的报告基因是荧光素酶 编码基因，并且在步骤(2)中，在将候选物质给予转基因非人哺乳动物后，给予动物荧光素底物，利用活体成像系统检测动物体内的荧光素酶表达情况。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，给予非人哺乳动物选自下组的 试剂引发炎症反应脂多糖、酵母聚糖、唑酮。
10. —种来源于所述的转基因非人哺乳动物的细胞，其特征在于，所述的细胞的基因组中含有一基因表达盒，所述表达盒从5'到3'端依次具有以下元件白介素ie启动子，报告基因，终止子。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了白介素1β特异分子小鼠光学成像系统的建立及其应用。本发明还公开了一种转基因动物的用途，用于筛选具有抗炎症效应的物质。本发明以含有白细胞介素1β基因的5’上游调控区作为启动子驱动报告基因为载体通过转基因技术转入动物基因组内，获得转基因动物；所述动物在活体成像系统中可快速灵敏地被检测到体内报告基因的变化，从而实时有效地反映白细胞介素1β在体内的表达情况。转入所述基因的动物可作为模型，用于筛选具有抗炎症效应的物质，该筛选方法操作简单，直观且灵敏度高，对动物的损伤小，可实时连续观察动物体内白介素1β启动子驱动的报告基因在有关物质的作用下的动态反应过程。
文档编号C12Q1/68GK101469346SQ20071017361
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者李利妹, 王铸钢, 俭 费 申请人:上海南方模式生物科技发展有限公司;上海南方模式生物研究中心