专利名称：一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种高效、无毒副作用和环保型的绿色饲料添加剂植酸 酶，具体是一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，特别是该技术 体系在植酸酶体外定向改造中的应用。
背景技术：
植酸酶通过消除植酸盐的抗营养作用来实现它的价值，目前发现植酸酶 的功效包括(l)提高饲料中磷的利用率常用饲料谷物玉米，大麦，豆粕， 麸皮中56-70 %的磷是植酸磷，动物无法利用，饲料中必须添加磷酸盐。一 般来讲，日粮中添加植酸酶，植酸磷的利用率可以提高30 50%。 (2)替代无
机磷无机磷在饲料中的使用造成了如下两方面的问题， 一是为了满足词料
业和养殖业的需求，消耗了大量昂贵的磷资源。无机磷资源在全世界已处于 匮乏状态， 一克无机磷的价格远远超过了一克优质蛋白质的价格。二是日粮 中的磷只有很小部分沉积到体内和畜产品中，因而对环境，特别是集约化饲 养时，对地下水和土壤造成污染。随着生物技术的发展，人们发现植酸酶成
为解决词料用磷问题最有吸引力的途径。(3)解除饲料中抗营养因子，提高 饲料中营养物质的利用率植酸磷会与饲料中的蛋白质、钙、锰、铁等无机
元素和氨基酸、维生素、淀粉、脂质等螯合，使它们不能被利用。植酸酶可 分解植酸磷，解除螯合，营养物质利用率得以提高。近几年植酸酶研究的重 点己经集中在对蛋白质、氨基酸利用率的影响和对猪生长性能的改善上。现
在大量的试验数据和实际应用结果都肯定和支持了植酸酶的作用效果。(4) 降低动物粪便中磷的含量，减轻对环境的污染动物粪便中的磷泄入水源会 造成水的磷富化，植酸酶的应用可以大大缓解污染程度，减少量达25~65%。
(5)腾出饲料空间植酸酶替代磷酸氢钙可腾出饲料空间(约1%)，这给饲料
加工工业和养殖业带来意想不到的好处。若维持日粮营养水平不变，可调整 饲料原料及其用量比例，如增加棉、菜粕的用量，降低成本。可增加玉米用量，提高日粮能量和蛋白营养水平。(6)显著提高动物日增重和饲料转化率:
在仔猪和生长猪饲料中添加植酸酶，可显著提高日增重和饲料转化率。此外 在鸡饲料中添加植酸酶可提高产蛋率和蛋壳品质。
我国是全世界首屈一指的饲料需求大国，2000年我国配合饲料年产量 达到6850万吨，根据词料工业规划，2010年和2020年，我国的饲料需求 量分别为3.4亿吨和4.08亿吨，植酸酶添加量以0.1 %。计算，到2010、 2020 年植酸酶纯蛋白的需求量应达到3~5万吨以上，由此产生的直接经济效益每 年将超过30亿人民币，具有良好的市场前景。饲料工业对微生物植酸酶的 认识和接受，不仅取决于它的作用效果，还决定于植酸酶价格、产品稳定性 和易操作性。植酸酶能否取得和添加无机磷一样的经济效益，决定于植酸酶 的额外效应，特别是可促进蛋白质和氨基酸的利用方面。如果在综合评定时 考虑后两个因素，植酸酶的经济效益将更明显。综上所述，使用植酸酶促进 营养物质的利用，降低磷排出，减少环境污染的潜力是巨大的。
体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法，提供了一种 高效获得多样性的方法。DNA改组是重要的体外分子进化技术，结合高通 量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等商业酶。近年来，许多 体外分子进化的新策略和新方法层出不穷。推理设计是基于基因和蛋白质信 息进行基因和蛋白质序列的改造，作为基因和蛋白质体外快速改造有其重要 的一面。利用基因定向分子进化技术，通过反复突变和繁殖，不断增强希望 获得的基因特性，往往只需经过一两轮进化，研究人员就可以在几个星期或 几个月的时间里使一种目标化合物的性能大大提高。体外定向分子进化技术 己引起陶氏化学公司等多家公司的兴趣。仅仅经过10年试验，定向进化已 取得瞩目的成果。Maxygen公司是一家在定向进化领域中处于领先地位的企 业，最近的实验表明通过分子定向进化可以把a干扰素的药力提高20万倍， a干扰素是一种重要的抗癌和抗病毒药，但是其毒性迫使医生们只能限量使 用，高活性干扰素的获得可降低成本和毒性。诺和诺德公司对存在于蘑燕中 的一种酶做了进化处理，使之能够消除排入水中的染料的活性，这种酶能够 阻止红衬衫的颜料沾染白色衣物。Ixsys公司的研究人员经过一轮进化就制 造出一种称为Vitaxin的抗肿瘤药物，性能是早期抗肿瘤复合物的2000倍， 该抗癌药物已投入患者早期治疗试验。利用这项技术，丹麦Nova公司研制成功一种洗涤剂酶；美国圣迭戈在今后的两年时间里，预计将有几十种新产
品陆续问世，其中包括Maxygen公司、Phylos公司和Diversa公司生产的工 业酶和经过改进的新型疫苗。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的筛选容量小，筛选时间长，筛选步骤 较复杂等不足，提供了一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系。
发明构思本发明通过对突变植酸酶库的硝酸纤维素膜影印、显色、筛 选，获得目标产物植酸酶突变个体。 本发明是这样实施的 1.植酸酶U59804突变基因的获得
本步骤通过植酸酶改组突变过程获得来源于烟熏曲霉04^^^7/ws /wm'gafw)植酸酶U59804改组突变片段。植酸酶U59804改组突变过程包括 植酸酶U59804基因片段的扩增、植酸酶基因片段PCR产物用DNA酶降解 得到小片段、小片段进行无引物的PCR扩增以及取无引物PCR产物为模板 进行引物PCR扩增四步。
以来源于烟熏曲霉C4we^7/船/w脂'g"m力植酸酶U59804为突变库建立 的其始材料(具体参考文献彭日荷，熊爱生，李贤，范惠琴，姚泉洪。应 用毕赤酵母高效表达耐高温植酸酶，生物化学与生物物理学报， 2002,34(6):730曙735.)。
(1) 植酸酶U59804片段的扩增
通过引物U59804Z1: AAGGATCCATGGTGACTCTGACTTTCCTGCTT TCG和U59804F1 : TGAACTAAAGCACTCTCCCCAG进行烟熏曲霉 (A/ eg///^/w脂'g^zw) cDNA中扩增得到植酸酶U59804基因(图la)。
(2) 回收植酸酶U59804扩增产物，回收的植酸酶基因的DNA片段用 DNA酶进行降解，形成长度为30-200bp的弥散小片段，通过透析袋回收 50-100bp的小片段(图lb)。
(3) 回收产物进行无引物PCR扩增，获得无引物PCR扩增产物，该产 物在2 %琼脂糖凝胶电泳检测形成200-400bp的弥散条带(图lc)。
(4) 以无引物扩增产物为模板，加入U59804Z1和U59804F1引物进行 PCR扩增，其扩增产物即为植酸酶U59804改组突变基因(图ld)。2. 植酸酶大肠杆菌突变库的建立
本步骤是将回收的改组突变的植酸酶U59804基因库经过BamHI和SacI 双酶切后，植入同样经过双酶切的含有氨苄青霉素抗性基因的表达载体 pYPX251(GenBank登陆号AY178046)中，该质粒为带庆大霉素抗性基因原 核启动子及tlt2终止子的原核表达载体(具体参考文献Ai-Sheng Xiong, Ri-He Peng, Jin-Ge Liu， Jing Zhuang， Yu陽Shan Qiao, Fang Xu， Bing Cai, Zhen Zhang， Jian-Min Chen and Quan-Hong Yao. High efficiency and throughput system in directed evolution W的of reporter gene. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(1): 160-168,)。
通过电击的方法，将含有突变的植酸酶U59804基因库的表达载体质粒 转入宿主菌大肠杆菌DH5ct中，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养 基上培养过夜，长出转化子(具体电击的方法参考文献Sambrook J, Frets E F, Mannsdes T et al'. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)。
3、 基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选
试验方法将37 "C培养过夜的含有植酸酶U59804突变基因的大肠杆 菌转化子培养皿正面朝上放置于超净台上。打开培养皿，用镊子将硝酸纤维 素膜放置于大肠杆菌转化子上。用镊子轻轻压，使硝酸纤维素膜被菌落浸湿。 用镊子夹住被菌落浸湿硝酸纤维素膜的一角，轻轻掀起硝酸纤维素膜。超净 台风机风干含有菌落的湿硝酸纤维素膜。含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝 上放置于含有1 %植酸钾(或者植酸钠溶液)溶液的滤纸上反应30分钟。再将 含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含有钼酸铵(1.5g/100ml)、硫酸 (3%)、硫酸亚铁(7.3g/100ml)的显色液中显色。植酸酶酶活性测定方法采取 钼蓝法(具体参考文献Engelen AJ , van der Heeft FC ， Randsdorp PH , Smit EL. Simple and rapid determination of phytase activity. J AOA C Int , 1994 , 77(3): 760-764.)。 本发明的有益效果
本发明公开了一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系。该体系 能够进行大规模的植酸酶突变个体的筛选，能够获得比单个突变体分别筛选 更优的筛选能力。
图1.植酸酶U59804改组突变过程电泳图 图la:植酸酶U59804片段的扩增；
图lb:扩增产物通过DNA酶进行降解，形成弥散小片段； 图1C:降解产物的无引物PCR扩增产物；
图Id:无引物扩增产物的PCR扩增得到植酸酶U59804改组突变基因； 图2.植酸酶U59804突变基因大肠杆菌原核表达质粒的构建电泳图； 图3.植酸酶U59804电击大肠杆菌DH5a的转化子； 图4.基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但实施例不限制本发明的 保护范围。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括
1. 细菌菌株和质粒
大肠杆菌DH5a购自宝生物工程大连有限公司，烟熏曲霉菌株购自美国 ATCC公司。
2. 化学试剂和酶制剂
各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、 10xPCRbuffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学 公司和上海国药化学试剂购买。
3. 引物合成
本发明涉及的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 下述实施例中常规的基因操作方法参照分子克隆文献Sambrook J, Frets
EF, Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989.。
实施例l:植酸酶U59804基因改组突变获得突变基因
(一)试验方法
1、植酸酶U59804基因的PCR扩增以烟熏曲霉(A/ ergz7/ws/wm'gafws) cDNA为模板，以U59804Z1和 U59804F1为引物，扩增得到长度为1300bp的植酸酶U59804基因的扩增产 物。
扩增反应程序为94。C， 10min预变性，94。C变性30s， 62 。C复性30s 和72。C延伸2min，共30循环，最后再72'C延伸10 min。采用1%琼脂糖 凝胶电泳鉴定PCR产物，用DNA胶回收试剂盒回收得到1300 bp目的基因 片段(图la)。
2、 植酸酶U59804基因DNA片段的DNasel降解及回收
1) DNaseI降解
用100 ^ DNase I缓冲液溶解回收的植酸酶基因DNA片段，加入0.1U DNaseI， 25。C处理15min后70。C处理10 min (失活DNA酶)。采用10% 丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物，降解产物为30-200bp的弥散小片段(图 lb)。本步骤中，DNase I缓冲液的组成为50mmol/L Tris-Cl pH7.4+lmmol/L MgCl2。
2) 降解产物回收
用透析袋法回收50-100 bp的小片段。用10 |il 10x无引物PCR缓冲液 (50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+l%Triton)溶解沉淀。
3、 降解产物的无引物PCR扩增
1) 反应体系降解小片段DNA模板5m!; dNTPs (2.5mmol/L) : 4^1; MgCl2 (2.5mmol/L) : 4.5^1; Taq聚合酶:2U;加ddH20至终体积为50W。
2) 反应程序为94°C， 30s; 40°C， 30s; 72°C， 30s;共45个循环。
3) 采用2。/。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，扩增产物为200-400bp 的弥散片段，用透析袋法回收DNA。
4、 无引物PCR扩增产物的引物PCR扩增
1) 反应体系无引物PCR扩增产物模板5^1; U59804Z1: 0.2ng; U59804F1: 0.2ng; lOxPCR buffer: 5pl; dNTPs (2.5mmol/L) : 4jil; Taq 聚合酶2U;加ddH20至终体积为5(Hll。
2) 反应程序为94°C， 30s; 62°C， 30s; 72°C， 2min;共35个循环。
3) 采用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，扩增产物为1300bp 的基因片段，用透析袋回收DNA。(二)试验结果
1、 采用1 。/。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，得到1300 bp目的基因片 段(图la)。
2、 采用丙烯酰胺凝胶电泳鉴定降解产物可以看出，植酸酶U59804基 因的DNA片段经DNaseI降解后，形成长度为30-200bp的弥散小片段(图 lb)。回收的降解产物经过无引物PCR扩增后得到200-400bp的弥散片段
(图,lc)。
3、 用琼脂糖凝胶电泳检测引物PCR扩增结果可以看出，无引物扩增产 物经过引物PCR扩增后，得到长度为1300 bp左右的片段。此片段即为多 个基因改良的家族改组的植酸酶突变体库(图ld)。
实施例2:含植酸酶U59804突变基因的大肠杆菌转化子的构建
(一) 试验方法
1、 突变体库大肠杆菌质粒的构建
按Sambrook分子生物学基本操作(Sambrook J， Frets E F， Mannsdes T et al, In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)， 先通过BamHI和Sacl将回收的改组突变植酸酶U59804基因体库进行酶切， 再将含有氨苄青霉素抗性基因的表达载体pYPX251酶切，然后用T4 DNA 连接酶将植酸酶U59804突变基因DNA片段连接到表达载体pYPX251中， 得到的连接产物即为含植酸酶U59804突变基因DNA片段的突变体库的大 肠杆菌表达质粒。
2、 突变体库转化子的构建
将构建好的含植酸酶U59804突变基因DNA片段的突变体库的大肠杆 菌表达质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5a，转化物涂布在含有100mg/L 氨苄青霉素的LB固体培养基上，37'C培养过夜，长出克隆，即为含有植酸 酶U59804突变基因的大肠杆菌转化子库。
(二) 试验结果
采用1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定含植酸酶U59804突变基因DNA片段的 突变体库的大肠杆菌表达质粒，得到1300 bp目的基因片段和2.8 kb的载体 (图2)。
实施例3:基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选(一) 试验方法
1、 将37'C培养过夜的含有植酸酶U59804突变基因的大肠杆菌转化子 培养皿正面朝上放置于超净台上。
2、 打开培养皿，用镊子将硝酸纤维素膜放置于大肠杆菌转化子上。
3、 等待3-5分钟后，用镊子轻轻压，使硝酸纤维素膜被菌落浸湿。
4、 用镊子夹住被菌落浸湿硝酸纤维素膜的一角，轻轻掀起硝酸纤维素膜。
5、 超净台风机风干含有菌落的湿硝酸纤维素膜。
6、 含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含有1 %植酸钾溶液的 滤纸上反应30分钟。
7、 再将含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含有钼酸铵 (1.5g/100ml)、硫酸(3%)、硫酸亚铁(7.3g/100ml)的显色液中显色。
(二) 试验结果
1、 大肠杆菌库容达到每个9cm的培养皿上约2万左右(图3)。
2、 通过硝酸纤维素膜可以很好的将大肠杆菌转化子影印到膜上(图3)。
3、 通过钼蓝法染色，可以较好的将显色快的突变个体筛选出来(图4)。序列表
<110〉上海市农业科学院
<120> —种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系 <130> 0711668 <160> 4
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1 <211〉 1398 <212>隨
<213〉按甲醇酵母偏爱密码子设计并合成的植酸酶AY136631基因
〈210> 2 <211> 466 〈212〉 PRT
<213>按甲醇酵母偏爱密码子设计并合成的植酸酶AY136631基因编码的氨基酸序列 <400>
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466 GECFS —
<210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> U59804Z1 <223>引物 <400>
AAGGATCCAT GGTGACTCTG ACTTTCCTGC TTTCG 35
<210> 4 〈211〉 22 <212〉画 <213> U59804F1 <223>引物 <400〉
TGAACTAAAG CACTCTCCCC AG 2权利要求
1. 一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，包括下列步骤(1)获得植酸酶U59804突变基因通过引物U59804Z1aaggatccatggtgactctgactttcctgctttcg和U59804F1tgaactaaagcactctccccag从烟熏曲霉cDNA中扩增得到植酸酶U59804基因，回收的植酸酶基因的DNA片段用DNA酶进行降解，回收的降解产物进行无引物PCR扩增，再以无引物扩增产物为模板加入引物U59804Z1和U59804F1，进行PCR扩增获得植酸酶U59804突变基因；(2)上述获得的植酸酶U59804突变基因，经BamHI和SacI双酶切后，植入含氨苄青霉素抗性基因的载体pYPX251中，获得带庆大霉素抗性基因原核启动子及t1t2终止子的植酸酶U59804突变基因原核表达载体质粒，再经电击将质粒转入宿主菌大肠杆菌DH5α中，在氨苄青霉素的固体培养基上培养得转化子；(3)上述长出的U59804突变基因的大肠杆菌转化子，影印至硝酸纤维素膜上，以植酸钾为底物进行高通量筛选；(4)用钼蓝法测定方法测植酸酶酶活性。
2. 根据权利要求l所述的硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，其特征在于 转化子带有庆大霉素抗性基因原核启动子及tlt2终止子的原核表达载体质 粒。
3. 根据权利要求l所述的硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，其特征在于 转化子影印至硝酸纤维素膜上，进行高通量筛选底物为植酸钾，植酸酶酶 活性测定方法采取钼蓝法。
4. 权利要求1所述的硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系的用途，在于在植 酸酶改造中进行高通量筛选体系中应用。
全文摘要
本发明涉及一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系。该体系中经过体外定向分子进化或化学诱变得到的植酸酶突变库，涂布于固体培养基上，通过硝酸纤维素膜影印后进行显色筛选，该方法能够获得比试管培养更大的筛选能力，能够在短时间内进行大量的植酸酶突变库筛选。通过该基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，开展植酸酶突变和高通量筛选，可以较大幅度的提高植酸酶的突变筛选效率。
文档编号C12Q1/44GK101469343SQ20071017338
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 贤 李, 熊爱生, 田永生, 永 薛, 伟 赵, 峰 高 申请人:上海市农业科学院