人肺腺癌干细胞的分离鉴定方法

专利名称：：人肺腺癌干细胞的分离鉴定方法
技术领域：
：本发明属于细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及肺腺癌干细胞(群)的分离鉴定方法。
背景技术：
：肺腺癌是肺癌最常见组织类型之一，其发病率约占肺癌总数的3040%。肺腺癌在外周气道、尤其是细支气管和肺泡多发，其癌前期病变称为不典型性腺瘤样增生(Atypicadenomatoushyperplasia,AAH)，表现为异常增生细胞沿肺泡壁排列，形态类似非纤毛柱状(Clara)细胞或II型肺泡(AT2)细胞。但此类早期腺癌的细胞起源尚不清楚。美国研究者Kim等通过实验研究，首次揭示肺腺癌是一种干细胞疾病，其起源细胞(Originatingcells)是位于小鼠肺脏气道末段细支气管-肺泡导管连接处(BADJ)的细支气管肺泡干细胞(BranchioaveolarStemCells,BASC)。BASC经恶性转化后成为肺腺癌干细胞，其特征是同时表达细支气管非纤毛柱状上皮(Clara细胞)标志(即Clara细胞分泌蛋白，CCSP)和II型肺泡细胞标志(即C型肺泡活性蛋白，SP-C)。而加拿大研究者Ho等则报道，人体肺癌(包括肺腺癌)干细胞主要富集在侧群(Sidepopulation,SP)细胞组分中。最近，意大利研究者Eramo等发现人体肺癌(包括肺腺癌)干细胞属于CD133阳性细胞。鉴于目前关于肺腺癌干细胞(LungAdenocarcinomaStemCells,LASC)的特性和起源不尽清楚，各家说法不同，因而分离与鉴定肺腺癌干细胞仍然是本领域迫切需要研究的问题。
发明内容本发明的目的在于提供肺腺癌干细胞(群)的分离鉴定方法。本发明的另一目的在于提供可用于分离鉴定肺腺癌干细胞(群)的试剂或试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种从肺腺癌细胞群中分离肺腺癌干细胞(群)的方法，所述方法包括从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)的细胞(群)，该细胞(群)是肺腺癌干细胞(群)。在另一优选例中，所述的CD24和IGF-1R表达在细胞的表面。在另一优选例中，所述的肺腺癌干细胞是人肺腺癌干细胞。在另一优选例中，所述的肺腺癌干细胞表达胚胎干细胞标志0CT4和Bmi-1;且表达肺干细胞标志CCSP(Clara细胞分泌蛋白)，SP-C(C型肺泡活性蛋白)，TTF-l(甲状腺转录因子)和Gremlin。在另一优选例中，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞(群)的方法是(1)先利用CD24的特异性抗体从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24的细胞(群)，然后利用IGF-1R的特异性抗体从所获得的表达CD24的细胞(群)中分离出同时还表达IGF-1R的细胞(群)；或者(2)先利用IGF-1R的特异性抗体分离出表达IGF-1R的细胞(群)；然后利用CD24的特异性抗体从所获得的表达IGF-1R的细胞(群)中分离出同时还表达CD24的细胞(群)。在另一优选例中，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞(群)的方法是(a)将肺腺癌细胞群与表面携带第一抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(b)从步骤(a)获得的复合物上去除"第一抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞群；(c)将步骤(b)获得的肺腺癌细胞群与表面携带第二抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(d)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。或者，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞(群)的方法是(i)将第一抗体加入肺腺癌细胞群，孵育后加入表面携带抗第一抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(ii)从步骤(i)获得的复合物上去除"第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞群；(iii)将第二抗体加入步骤(ii)获得的肺腺癌细胞群，孵育后加入表面携带抗第二抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(iv)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。在另一优选例中，所述的固相载体是免疫磁珠。优选的，所述免疫磁珠的直径为10nm-lmm;更优选的直径为50nm-500um。在本发明的第二方面，提供一种CD24和IGF-1R或它们的特异性抗体的用途，用于从肺腺癌细胞群中分离肺腺癌干细胞(群)；或者用于体外(非治疗性地)检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)；或者用于制备分离肺腺癌干细胞(群)的试剂或试剂盒；或者用于制备体外(非治疗性地)检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)的检测试剂或试剂盒；或者用于制备选择性杀灭肺腺癌干细胞(群)或诱导肺腺癌干细胞(群)分化的药物。在本发明的第三方面，提供一种体外(非治疗性地)检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)的方法，所述方法包括体外检测待测肺腺癌细胞(群)是否表达CD24和IGF-1R，如果待测肺腺癌细胞(群)同时表达CD24和IGF-1R，则该细胞(群)是肺腺癌干细胞(群)。在另一优选例中，所述检测待测肺腺癌细胞(群)是否表达CD24和IGF-1R的方法选自(但不限于)聚合酶链反应(PCR)法，抗体特异性结合法，或流式7细胞术。在本发明的第四方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒含有特异性抗CD24的抗体，和特异性抗IGF-1R的抗体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示了干细胞标志表达分析的结果。A，用RT-PCR检测A549禾口SPC-A1肺腺癌细胞系中CD133禾BABCG2mRNA的表达。B，利用流式细胞分析验证CD133和ABCG2在A549和SPC-A1肺腺癌细胞系表面的表达。图2显示了SP细胞及其表面标志分析的结果。SPC-A1肺腺癌细胞用Hoechst33342染色，SP(蓝色区域)和non-SP(红色区域)部分分别被圈出，SP部分能够被Reserpin(ABCG2转运抑制剂)部分阻滞，然后使用荧光标记的特异性抗体分析两个部分中ABCG2，CD24，IGF-1R和EGFR的表达。图3显示了细胞亚群的干细胞基因表达分析的结果。通过MACS从A549肺腺癌细胞中分选相应的标记，用PCR检测干细胞相关基因。其中，泳道1为18srRNA,泳道2为OCT4;泳道3为Bmi-l，泳道4为SP-C，泳道5为CCSP，泳道6为Gremlin,泳道7为TTF-1。图4显示了肺腺癌细胞中CD24+IGF-1R+亚群的含量及其与SP的关系。A，A549和SPC-A1细胞分别用抗CD24(PE标记)和IGF-1R(FITC标记)抗体染色，CD24+IGF-lR+亚型用流式细胞分析。B，SPC-A1细胞用Hoechst33342染色，SP和non-SP部分分别被圈出以判断CD24和IGF-1R的表达。图5显示了致瘤性分析的结果。Al，分选自A549细胞系的CD241GF-lR-细胞分别以1X105(上)或1X104(下)细胞被注射到NOD-SCID小鼠体内，在4周后检测肿瘤的生长情况。分选自A549(A2)或SPC-A1(A3)细胞系的CD24+IGF-lR+细胞分别以1X103(上)或1X102(下)细胞被注射到NOD-SCID小鼠体内，在4周后检测肿瘤的生长情况。Bl，SPC-A1母细胞以1X10"上)或1X1()4(下)注射到N0D-SCID小鼠体内，在4周后检测肿瘤的生长情况。B2，分选自SPC-A1细胞系的ABCG2+(上)或ABCG2—(下)细胞以5X103细胞注射到NOD-SCID小鼠体内，在4周后检测肿瘤的生长情况。B3，分选自SPC-A1细胞系的EGFR+或EGFR;细胞以5X103细胞注射到同一NOD-SCID小鼠体内(注射点分别位于双侧腹壁)，在4周后检测肿瘤的生长情况。B3下图为代表性的腺癌病理切片图。图6显示了自主生长机理分析A，分选自A549细胞系的CD24+IGF-lR+细胞在无血清条件下培养2周后的情况。B，利用RT-PCR分别检测分选自A549和SPC-A1细胞系的CD24+IGF-1R+中IGF-1，IGF-2，和EGFR配基二性调节素(Amphiregulin，AR)的表达情况。C，利用抗IGF-1R或EGFR的封闭抗体来评估CD24+IGF-lR+细胞的生长影响。D，评估重组人IGF-1或EGF对CD24+IGF-lR+细胞生长的影响。图7显示了体外培养的。024+10—111+细胞的特性分析。CD24+IGFlR+在无血清条件下培养3个月后进行细胞的特性分析。A，用流式细胞术分析分选自A549细胞系的CD24+IGF1R+细胞上表面标记的表达。B，通过Matrigel侵袭试验评估分选自A549和SPC-A1细胞系的CD24+IGFlR+细胞的侵袭性分析。C，以图中所示剂量(单位个细胞)将分选自A549细胞系的CD24+IGF—1R+细胞皮下注射入NOD-SCID小鼠体内，以亲代细胞A549为对照。9具体实施例方式本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示一种致瘤性和/或侵袭性高的细胞，该种细胞具有特别的标志物CD24和IGF-1R(即其表型表现为CD24+IGF-lR+)。所述标志可用于从常规肺腺癌细胞群中分离出致瘤性和/或侵袭性高的细胞(群)，以及用于致瘤性和/或侵袭性高的细胞(群)的鉴定。并且，本发明人还发现，所述的致瘤性和/或侵袭性高的细胞(群)表达多种胚胎及肺干细胞标志。在此基础上完成本发明。如本发明所用，所述的"致瘤性和/或侵袭性高的细胞"是指一类CD24+IGF-1R+的肺腺癌细胞，其与CD24—IGF-1R—的细胞相比，致瘤性高10倍以上，优选的高100倍以上，更优选的高1000倍或更高；或者，与CD24—IGF-1R—的细胞相比，其侵袭性高2倍以上，优选的高5倍以上，更优选的高10倍或更高；本发明中，该致瘤性和/或侵袭性高的细胞即有肿瘤干细胞的特性，因此也可被称为"肺腺癌干细胞"。如本发明所用，所述的亲代肺腺癌细胞是指未经过特定的标志物筛选的肺腺癌细胞。CD24和IGF-1R的用途本发明人首次发现CD24和IGF-1R是肺腺癌干细胞的特定标志，从而可基于此对肺腺癌干细胞进行分离鉴定。具体地，本发明人经过反复研究，从肺腺癌细胞群中分离鉴定了一个高致瘤性的细胞亚群，此类癌细胞的表型特征为CD24+IGF-1R+，具有高侵袭性和高致瘤性，在免疫缺陷小鼠中仅需移植少量细胞即可形成肿瘤，其致瘤能力是上述CD24—IGF-lR—细胞的IO倍以上(优选的IOO倍以上，更优选的1000倍以上)。本发明人还从基因表达水平上验证了CD24+IGF-1R+细胞具有干细胞特征，发现CD24+IGF-1R+细胞是唯一表达CCSP、SP-C及TTF-1的细胞亚群。此外，CD24+IGF-lR+细胞还表达0CT4、Bmi-1和GRM等干细胞标志。其中，所述的0CT4和Bmi-l是胚胎干细胞标志；所述的CCSP，SP-C，TTF-1和Gremlin是肺干细胞标志。因此，本发明提供了一种CD24和IGF-1R或它们的抗体的用途，用于从肺腺癌细胞(群)中分离肺腺癌干细胞(群)；或者用于体外(优选非治疗性地)检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)。应用本发明提供的CD24和IGF-1R标志分离或鉴定肺腺癌干细胞(群)后，这类细胞(群)既可以用于制备体外检测肺腺癌干细胞(群)的特异性检测试剂或试剂盒，也可以用于研制(或筛选)选择性地杀灭肺腺癌干细胞(群)或诱导肺腺癌干细胞(群)分化的治疗性药物。此外，CD24和IGF-1R或它们的抗体还可用于制备分离肺腺癌干细胞(群)的试剂或试剂盒；或者用于制备体外(优选非治疗性地)检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)的检测试剂或试剂盒。此外，CD24和IGF-1R或它们的抗体还可用于制备选择性杀灭肺腺癌干细胞(群)或诱导肺腺癌干细胞(群)分化的药物。本发明所述的肺腺癌细胞(群)优选的是人肺腺癌细胞(群)；所述的肺腺癌干细胞(群)优选的是人肺腺癌干细胞(群)。肺腺癌干细胞的分离基于CD24和IGF-1R可作为肺腺癌干细胞标志物的特点，本发明提供了一种从肺腺癌细胞(群)中分离出肺腺癌干细胞(群)方法，所述方法包括从肺腺癌细胞(群)中分离出表达(优选表面表达)CD24和IGF-1R的细胞(群)，该细胞(群)即为肺腺癌干细胞(群)。本发明对于分离表达CD24和IGF-1R的肺腺癌细胞(群)的方法没有特别的限制，可以采用本领域已知的各种分离方法。较为经典的方法如流式细胞分选法或磁性细胞分选法，也即利用抗CD24的抗体和抗IGF-1R的抗体从肺腺癌细胞(群)中分离表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。优选的方法是磁性细胞分选法，即先用其中一种标志物的特异性抗体分离表达该标志物的细胞(群)，然后用另一种标志物的特异性抗体分离同时还表达该另一种标志物的细胞(群)，其优点是毋须昂贵的流式细胞仪，适合各实验室使用。作为本发明的优选方式，所述的从肺腺癌细胞(群)中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞(群)的方法是(a)将肺腺癌细胞群与表面携带第一抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(b)从步骤(a)获得的复合物上去除"第一抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞群；(c)将步骤(b)获得的肺腺癌细胞群与表面携带第二抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(d)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。另一种可选择的分离方法是(i)将第一抗体加入肺腺癌细胞(群)，孵育后加入表面携带抗第一抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(ii)从步骤(i)获得的复合物上去除"第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞(群)；(iii)将第二抗体加入步骤(ii)获得的肺腺癌细胞(群)，孵育后加入表面携带抗第二抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(iv)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。抗体和抗抗体的选择是本领域人员已知的。例如，当所述的第一抗体是鼠抗人CD24抗体时，所述的抗第一抗体的抗体可以是抗鼠IgG的抗体；当所述的第二抗体是鼠抗人IGF-1R抗体时，所述的抗第二抗体的抗体可以是抗鼠IgG的抗体。所述的固相载体没有特别的限制，只要其能够被用于与第一抗体或抗第一抗体的抗体相偶联(连接)并且可通过适当的方式被识别和分离。优选地，所述的固相载体是免疫磁珠，所述免疫磁珠的直径通常为lOnm-lmm;更优选的直径为50mn-500um。将抗体或抗抗体偶联(连接)于固相载体的方法是本领域已知的技术。12从肺腺癌细胞(群)h去除抗体和/或固相载体的方法也是本领域已知的。例如，可以采用一类能特异性水解抗体的蛋白酶进行水解。所述的酶例如靡蛋白酶。作为本发明的优选实施例，采用磁性细胞分选(MACS)技术进行分离，所述的方法如下(al)将鼠抗人CD24抗体加入肺腺癌细胞(群)，孵育后加入抗鼠IgG免疫磁珠，用MiniMACS分离柱分离，获得表达CD24的细胞(群)；(bl)用靡蛋白酶水解步骤(al)获得的细胞表面结合的抗体，获得经处理的表达CD24的细胞(群)；(cl)将鼠抗人IGF-lR抗体加入步骤(bl)获得的细胞(群)中，孵育后加入吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠，用MiniMACS分离柱分离，获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)；或者，所述方法是(a2)将鼠抗人IGF-1R抗体加入肺腺癌细胞(群)，孵育后加入吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠，用MiniMACS分离柱分离，获得表达IGF-1R的细胞(群)；(b2)用靡蛋白酶水解步骤(a2)获得的细胞表面结合的抗体，获得经处理的表达IGF-1R的细胞(群)；(c2)将鼠抗人CD24抗体加入步骤(b2)获得的细胞(群)中，孵育后加入抗鼠IgG免疫磁珠，用MiniMACS分离柱分离，获得表达CD24和IGF-1R的细胞(群)。本发明所述的(抗)CD24的抗体或(抗)IGF-1R的抗体可以是对于CD24或IGF-1R具有特异性的单克隆抗体。"特异性"是指抗体能结合于CD24或IGF-1R基因产物或片段。较佳地，指那些能与CD24或IGF-1R基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CD24或IGF-1R基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达CD24或IGF-1R蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。肺腺癌干细胞的检测本发明还提供了一种检测待测肺腺癌细胞(群)是否是肺腺癌干细胞(群)的方法，所述方法包括检测待测肺腺癌细胞(群)是否表达CD24和IGF-1R，如果待测肺腺癌细胞(群)同时表达CD24和IGF-1R，则该细胞(群)是肺腺癌干细胞(群)。所述检测待测肺腺癌细胞(群)是否表达CD24和IGF-1R的方法没有特别的限制，所述方法例如可选自(但不限于)PCR法，抗体特异性结合法，或流式细胞术。基于所述的检测肺癌干细胞(群)的方法，还可以(i)进行肺腺癌的分型、鉴别、和/或诊断；(ii)评估肺腺癌恶性程度或发生转移的风险度，待测肺腺癌细胞(群)中肺腺癌干细胞的比例越高，则恶性程度越高且越易于发生转移；(ii)评估相关人群的肺腺癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法，从而避免盲目给药或盲目治疗。作为本发明的优选方式，还可进一步分析鉴定待测肺腺癌细胞(群)的干细胞标志基因，例如选自下组的标志基因0CT4、Bmi-1、CCSP、SP-C、TTF-1、Gremlin。试剂盒本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒是检测试剂盒或分离试剂盒。所述的试剂盒中含有检测待测肺腺癌细胞(群)是否表达CD24和IGF-1R的试剂；或含有可从肺腺癌中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞(群)的试剂。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒含有抗CD24的抗体，和抗IGF-1R的抗体。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还可含有特异性扩增胚胎干细胞基因(如OCT4和Bmi-l)、或转录本的引物，和特异性扩增肺干细胞基因(如CCSP、SP-C、TTF-1和Gremlin)、或转录本的引物；或者特异性结合胚胎干细14胞基因的探针，和特异性结合肺干细胞基因的探针。此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定或分离用的试剂，如(但不限于)(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取细胞DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于酚、氯仿等；(C)进行琼脂糖凝胶电泳所需的试剂，例如但不限于琼脂糖粉、电泳缓冲液、溴化乙啶等；或(D)特异性水解抗体的蛋白酶。此外，所述的试剂盒中还可含有指示鉴定或分离方法的使用说明书，从而指导技术人员正确使用所述试剂盒。所述的试剂盒可实现快速检测、批量分离或检测的目的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法一1.肿瘤细胞人肺腺癌细胞株A549和SPOAl购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，肿瘤细胞在常规的10y。胎牛血清-DMEM培养基(为Hyclone公司产品)中传代培养，取活跃增殖期细胞进行实验。2.流式细胞检测将细胞调整至1X107个/ml，取lOOul细胞分别加入lug荧光素标记的鼠抗人CD133、EGFR、IGF-1R、CD24或ABCG2单抗(BectonDickinson公司产15品)，对照组加入同型鼠IgG(BectonDickinson公司产品，同型是指与上述特异性抗体属于相同的免疫球蛋白亚型，如IgGl等)，室温放置30分钟后用PBS离心洗涤2次，重悬细胞于500u1PBS中，在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson公司产品)上检测CD133、EGFR、IGF-1R、CD24或ABCG2各标志的阳性率。3.SP细胞检测将细胞调整至1X107ml，加入5ug/mlHoechst33342(Sigma公司)，37。C温育90分钟后用PBS离心洗涤2次，重悬细胞于100"1PBS中，分别加入1yg特异性抗体后4'C放置20分钟，PBS离心洗涤2次，重悬细胞于500U1PBS中，置冰浴中待测。SP细胞及其表面标志阳性细胞检测参照文献Ho丽等，Sidepopulationinhumanlungcancercelllinesandtumorsisenrichedwithstem-likecancercells[J].C雄ervas，2007，67(10):4827-4833中所描述的，在BeckmanCoulterAltra流式细胞仪上进行。4.磁性细胞分选(MACS)细胞在EDTA消化液(含2.5raMEDTA及1%胎牛血清的PBS，pH7.27.4)中4"C温育30分钟，收集细胞后调整至1X107ml，按2ug抗体/106细胞标准分别加入鼠抗人EGFR、IGF-1R和CD24(BectonDickinson公司产品)单抗，4。C温育10分钟后用1%血清-DF12离心洗涤1次，然后加入抗鼠IgG免疫磁珠(Miltany公司产品)，按照生产商提供的操作指南用MiniMACS分离柱分选细胞；并根据操作指南的方法将细胞与抗体和磁珠分离。双阳性细胞分选系在第一标志阳性细胞分选后，用糜蛋白酶水解细胞表面结合的抗体，然后以同样方法标记分选第二标志阳性细胞。5.RT-PCR分析细胞收集后采用TriZol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，取gRNA逆转录成cDNA(釆用Fermemtas公司RevertAicTM首链cDNA合成试剂盒)后进行PCR扩增。PCR引物采用美国ABIPrismPrimerExpress软件设计，其序列见表1。PCR扩增选用TakaraExTaqTM试剂(大连宝生物工程有限公司)，反应液内含IOX缓冲液2.5ul，2.5mmol/LdNTP2ul，上下游引物(2016Umol/L)各1U1，Taq酶(5U/u1)0.2u1，cDNA2u1,用DEPC-H20补足至25ul。反应条件为95°C5分钟变性；然后95。C45s,57°C45s，72°C60s，45个循环；72'C延伸7分钟。扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳100V30分钟后EB染色摄片。表1PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>6.致瘤性分析812周龄N0D-SCID免疫缺陷小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供(也可购自中科院上海实验动物中心)，性别不限。细胞收集后调整至所需浓度，按1:1比例与Matrigel(BectonDickinson公司产品)混合，于腹壁皮下注射lOOul。每周1次观察肿瘤生长状况，至肿瘤直径》lcm或者观察期达4周时将小鼠断颈处死，摄片后摘取皮下肿瘤。7.细胞增殖试验细胞收集后用1%血清-DF12培养基(DMEM/F12，Hyclone公司)调整至1X107ml，96孔板内每孔加入100u1，然后分别加入100nl不同浓度的重组人IGF-l(胰岛素样生长因子-l)或EGF(表皮生长因子)(均为Serotec公司产品)，对照组加入等量1%血清-DF12。37。C培养96h后每孔加入25ulMTT(5mg/ml)作用4h，经二甲基亚砜显色后在570nm波长测定光密度。抗体阻断试验在相同实验条件下加入10ug/ml的IGF-1R阻断抗体(BectonDickinson公司，克隆1H7)或EGFR阻断抗体(Upstate公司，克隆LA1)，对照组加入等量小鼠同型IgG(Upstate公司)。8.Transwell侵袭试验8um孔径Transwell小室(Corning公司产品)包被30u1经稀释的Matrigel，37'C温育30分钟使胶固化。24孔板(Corning公司产品)小孔内加750u1含10%血清和100ng/ml重组人IGF-1(Serotec公司产品)的DF12培养基后将小室放入备用。待测细胞用1%血清-DF12培养基调整至3X10Vml，在小室中加入500"1细胞悬液，37'C温育48小时后撤去小室，穿越Matrigel生物胶落入小孔的细胞经甲醇固定后结晶紫染色摄片，然后加入lml3%乙酸溶解细胞，在570nm波长测定光密度。II.实施例实施例1肺腺癌细胞中干细胞标志的表达分析CD133和ABCG2在多种实体肿瘤的癌干细胞表面表达，是一类广谱的干细胞标志。因而本发明人通过RT-PCR法和流式细胞法检测了CD133和ABCG2在A549和SPC-Al肺腺癌细胞中的表达。图1A结果显示，A549和SPC-A1细胞均表达ABCG2特异性mRNA，但不表达CD133。采用流式细胞术进一步检测其蛋白表达，证实A549和SPC-Al细胞群中ABCG2+细胞比例分别为6%和10%，而CD133抗体染色未检测到阳性细胞，见图1B。实施例2ABCG2及相关标志表达与SP的关系肺脏中ABCG2+细胞分属末端气道(Distalairways)和肺泡上皮细胞，前者不具有SP特征，而后者则是具有SP特征的肺干细胞(SummerR等，SidepopulationcellsandBcrplexpressioninlung[J].力历/户力75v;WZw《#o72003，285(1):L97-L104)。为了确定肺腺癌细胞中的ABCG2+细胞属于何种类型，本发明人对SPC-Al细胞进行了Hoechst染色和ABCG2抗体标记。图2结果显示，SPC-A1中SP细胞范围为3.27.4%，平均为5%，并且SP和非SP(non-SP)组分中ABCG2+细胞比例分别为3.1%和2.2%，即ABCG2主要表达在non-SP细胞表面。已知癌细胞表面ABCG2表达受生长因子受体酪氨酸激酶的调控，因而本发明人分别检测了SP和non-SP细胞表面表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)和胰岛素样生长因子-1受体(Insulin-likegrowthfactor-lrec印tor，IGF-1R)表达。同时根据Ho等(HoMM等，Sidepopulationinhumanlungcancercelllinesandtumorsisenrichedwithstem-likecancercells[J]C露e"es，2007，67(10):4827-4833)报道，本发明人也分析了干细胞标志CD24在SP和non-SP组分中的分布。图2结果显示，上述蛋白在SP和non-SP细胞中的阳性表达率基本相同，因而均非SP细胞特异性标志。实施例3CD24+IGF-1R+细胞亚群的干细胞基因表达分析为了寻找肺腺癌细胞中的LASC，本发明人釆用MACS技术将A549细胞分成ABCG2+、EGFR+、CD24+和IGF-lR+细胞亚群，然后采用RT-PCR技术检测了一组干细胞基因的表达，这类基因涉及自我更新(0CT4和Bmi-l)，分化调控(TTF-1和GRM)以及BASC标志(CCSP和SP-C)。图3结果显示，未经分选的A549亲代细胞(Parent)表达SP-C和Bmi-1，而所有标志阳性细胞均表达Bmi-1、SP-C和Gremlin(GRM)。此外，CD24+细胞还表达0CT4，IGF-lR+细胞还表达CCSP和TTF-1。进一步从CD24+细胞亚群中分离IGF-1R+细胞，所得的CD24+IGF-1R+细胞表达全部干细胞基因，尤其是CCSP和SP-C同时表达提示这类细胞与Kim等报道的小鼠肺脏BASC相似。实施例4CD24+IGF-1R+细胞含量及其与SP的关系本发明人还利用流式细胞分析法检测了肺腺癌细胞A549和SPC-Al中CD24+IGF-1K+亚群的含量及其与SP的关系。图4A显示，A549和SPC-A1细胞中CD24+IGF-1R+细胞亚群比例分别为2.76%和10.14%。进一步分析SPC-Al细胞中该亚群与SP的关系，结果见图4B，发现在SP和non-SP组分中均存在CD24+IGF-lR+细胞，但SP组分的CD24+IGF-lR+细胞比例(5.7%)高于non-SP组分(3.4%)。实施例5CD24+IGF-1R+细胞具有显著致瘤特性本发明人还测试了各种细胞在免疫缺陷小鼠体内的致瘤性情况。致瘤性分析结果显示，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下接种100个CD24+IGF-lR+细胞，9/9小鼠均形成肿瘤(图5A2-3)，而在相同实验条件下接种1X105个CD24-IGF-1R—细胞，仅2/5只小鼠形成肿瘤(图5A1)，并且肿瘤体积显著小于上述标志阳性细胞。可见CD24+IGF-1R+细胞的致瘤性是CD24—IGF-1R—细胞的1000倍以上。此外，本发明人也分析了ABCG2和EGFR表达与致瘤性的关系，发现ABCG2+和ABCG2—细胞的致瘤能力无明显差异(图5B2)，EGFR+和EGFR—细胞的致瘤性也基本相同(图5B3)，上述细胞亚群的致瘤性与未分选的亲代细胞差异不显著(图5B1)。实施例6CD24+IGF-1R+细胞的自主生长特性分析癌干细胞的一个显著特征是能够自主生长(Self-sufficiencyforgrowthsignaling),其机理可能是通过生长因子受体自分泌环获得增殖信号，因而可以在无血清、无生长因子条件下生长。据此本发明人将CD24+IGF-lR+细胞和CD24—IGF-IR—细胞分别培养在无血清和10%血清DF-12培养基中，发现二种细胞在10%血清中均活跃生长，但在无血清条件下，CD24—IGF-1R—细胞不能存活，而CD24+IGF-1R+细胞不仅能够存活，而且还能增殖，见图6A,经培养2周后，细胞数量从O.1X1()6增加至1..4X106。为了剖析CD24+IGF-lR+细胞的自主生长机理，本发明人采用RT-PCR分析了2组受体-配基的mRNA表达，图6B显示，SPC-Al和A549的CD24+IGF-1R+细胞均表达IGF-1R及其配基IGF-1、IGF-2(仅A549来源细胞)，以及EGFR配基二性调节素(Amphiregulin，AR)。20功能分析揭示，应用特异性抗体阻断上述受体与配基的相互作用显著抑制细胞增殖(图6C)，而加入IGF-1或EGF，均可以刺激细胞生长(图6D)，由此证实CD24+IGF-1R+细胞通过IGF-1R及EGFR自分泌调节环，实现自主生长。实施例7CD24+IGF-1R+细胞的体外传代培养干细胞的增殖与分化是一对矛盾，如何在维持癌干细胞生长的同时，避免或延缓其分化，仍是一个有待探索的问题。本发明人经过比较分析，发现采用1%血清DF12培养基，可以使CD24+IGF-lR+细胞在增殖的同时保持表型相对稳定，目前已对此类细胞连续传代培养了6个月。在体外培养3个月时进行流式细胞检测，显示CD24+IGF-1R+细胞表面IGF-1R、EGFR、CD24和ABCG2阳性率分别为89.82%,22.61%，67.0%和7.75%(图7A)。Transwell侵袭试验显示(图7B)，未经分选的亲代细胞在10%血清和100ng/mlIGF-1刺激下穿越Matrigel生物胶的细胞甚少，而CD24+IGF-1R+细胞经过长期培养后仍具有高侵袭性，尤其是A549来源的细胞在相同条件下落入下层小孔内的细胞数量为亲代细胞的io倍以上。致瘤性分析显示，亲代细胞需接种1X104才能形成肿瘤(4/5小鼠)，而培养的CD24+IGF-1R+细胞仅需接种500细胞/鼠就能形成肿瘤(图7C)，说明这类细胞仍保留高致瘤性。综上所述，本发明人发现人体肺腺癌中存在CCSP+SP-C+的BASC样干细胞，这些细胞以CD24+IGF-lR+为标志，表达多种胚胎干细胞相关基因，能够自主生长，具有高侵袭性和高致瘤性，按照目前公认的癌干细胞鉴定标准(MimeaultM等，Recentadvancesincancerstem/progenitorcellresearch:therapeuticimplicationsforovercomingresistancetothemostaggressivecancers[J]./#W#eA2007，11(5):981-1011)，此类肺腺癌细胞属于迄今尚未报道的肺腺癌干细胞。实施例8试剂盒制备一种试剂盒，该试剂盒含有鼠抗人CD24抗体，鼠抗人IGF-1R抗体，吸附有抗鼠IgG的免疫磁珠和靡蛋白酶。21讨论肺脏中存在多种成体干细胞(Somaticstemcells)，如(1)基底细胞(Basalcells),位于气管支气管的粘膜下腺体导管开口及软骨间上皮基底层，可分化形成纤毛柱状细胞和Clara细胞等呼吸道上皮细胞；(2)Clara变异细胞(vCE)，位于细支气管上皮的神经表皮小体(Neuro印ithelialbodies,NEB),主要分化形成Clara细胞和肺神经内分泌细胞；(3)细支气管肺泡干细胞(BASC)，位于终末细支气管-肺泡导管连接处(BADJ),可分化形成Clara细胞和肺泡上皮细胞。其中BASC被认为是肺腺癌的癌变前体细胞。BASC的典型特征是同时表达CCSP和SP-C，此类细胞还具有造血干细胞表面标志如CD34等。转基因实验证明，在CCSP或SP-C基因的启动子控制下，定向表达突变型K-ras癌基因、突变型EGFR基因或人IGF-1基因均能诱发肺腺癌及其癌前期病变，说明生长因子受体酪氨酸激酶信号途径在BASC恶性转化过程中起关键作用。然而，在人体肺腺癌组织或建株的肺腺癌细胞中至今尚未发现CCSP+SP-C+的BASC样干细胞，也没有关于肺腺癌干细胞表达造血干细胞表面标志CD34+或CD133+的报道。因而加拿大研究者Ho等采用SP作为人肺癌干细胞的标志，发现非小细胞肺癌的癌干细胞主要富集在SP细胞组分中。这类肺癌SP细胞具有较高的侵袭性和致瘤性，在NOD-SCID小鼠中约5X1()3SP细胞能够形成肿瘤，其致瘤能力约为non-SP细胞的10倍。但作者报道，肺癌SP细胞并不特异性表达干细胞表面标志如CD24、CD34和CD44等。小鼠肺脏也存在SP细胞，此类细胞表达CCSP，但不表达CD34、SP-C及其转录因子TTF-1，其主要特征是高表达ABCG2，后者是DNA染料Hoechst33342的主要跨膜转运蛋白。然而，小鼠肺SP细胞被认为来自骨髓，其主要作用是作为肺血管的前体细胞。但在急性肺损伤时，肺SP细胞也可以分化成为呼吸道上皮细胞，参与肺损伤的修复。因此，关于肺腺癌的起源细胞，各家说法不一。本发明人从2株人肺腺癌细胞中分离鉴定了一个高致瘤性的细胞亚群，此类癌细胞的表型特征为CD24+IGF-lR+，具有高侵袭性和高致瘤性，在NOD-SCID小鼠中仅需移植100细胞即可形成肿瘤，其致瘤能力是上述标志阴性细胞的1000倍。CD24+IGF-1R+细胞分别占A549和SPC-Al细胞总数的2.76%和10.14%，这类细胞不属于SP组;，但其在SP组分中的含量高于non-SP组分，这种分布差异可以解释HO等报道的结果。除了高致瘤特性外，从基因表达水平分析CD24+IGF-1R+细胞具有干细胞特征。通过阳性细胞分选，本发明人发现CD24+IGF-lR+细胞是唯一表达CCSP、SP-C及TTF-1的细胞亚群，揭示该群细胞属于人体BASC样细胞。此外，CD24+10「-11^+细胞还表达0(^4、Bmi-1和GRM等干细胞标志，提示其具有自我更新能力。0CT4是公认的原始干细胞标志，在胚胎干细胞中，0CT4与Sox2等形成转录因子复合物调控1000余种基因表达，功能涉及染色质构象、DNA修复、细胞增殖和凋亡等，是胚胎干细胞维持自我更新的主要凋控因子之一(BoyerLA，等,Coretranscriptionalregulatorycircuitryinhumanembryonicstemcells[J].Ce仏2005，122(6):947-956)。Bmi-1也是原始干细胞的标志之一，该基因可能通过调控端粒酶逆转录酶(TERT)和P16皿4等抑癌基因表达赋予干细胞无限增殖能力(ParkIK等，Bmil，stemcells,andsenescenceregulation[J]./C7i/2004，113(2):175-179)。GRM(Gremlin)属于骨形态建成蛋白-4(BMP4)的特异性抑制物，是干细胞"巢"(Niches)基质细胞分泌的一类分化抑制蛋白，其机理是GRM与14-3-3eta结合，阻断多种蛋白激酶的信号转导、抑制细胞分化(NamkoongH等，ThebonemorphogeneticproteinantagonistgremlinIisoverexpressedinhumancancersandinteractswithYWHANprotein[J].AJCCs/7cer,20066:74-86)。癌干细胞同时表达上述自我更新所必需的基因，这就不难理解为何癌细胞建株后经过长期传代培养仍能保留其干细胞组分。现有证据显示，成体干细胞获得自主生长特性是其恶性转化的前提条件之一，其中生长因子受体酪氨酸激酶信号转导途径异常在肺腺癌发生发展中具有重要作用。IGF-1R是肺腺癌的一种多功能生长因子受体，IGF-1R与特异性配体如IGF-1等结合并活化后，主要通过PI3K-Akt等信号途经引起BAD磷酸化并失活，赋予细胞抗凋亡能力。曾有报道，一些肺腺癌细胞能够自发地分泌IGF-1和AR，这些生长因子通过自分泌机制刺激IGF-lR+细胞增殖，因而可以在无血清培养条件下生长。此外，IGF-1R活化还上调多种基质金属蛋白酶(如腿P2和MMP9)表达，促使癌细胞侵袭转移。在肺癌细胞中，IGF-1R表达上调可以显著增强其侵袭转移能力。本发明结果也证实，CD24+IGF-lR+细胞具有自主生长特性，这类细胞表达IGF-1和AR，可以在无血清培养基中生长，加入IGF-1或EGF明显促进细胞增殖，而应用特异性抗体阻断IGF-1R或EGFR信号转导，23均显著抑制细胞生长。这类细胞在无血清条件下培养3个月后仍具有高致瘤能力，体外侵袭试验证明其在IGF-1刺激下具有高侵袭性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种从肺腺癌细胞群中分离肺腺癌干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞，该细胞是肺腺癌干细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CD24和IGF-1R表达在细胞的表面。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肺腺癌干细胞是人肺腺癌干细胞。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肺腺癌干细胞表达胚胎干细胞标志0CT4和Brai-1;且表达肺干细胞标志CCSP，SP-C，TTF-1和Gremlin。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞的方法是(1)先利用CD24的特异性抗体从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24的细胞，然后利用IGF-1R的特异性抗体从所获得的表达CD24的细胞中分离出同时还表达IGF-1R的细胞；或者(2)先利用IGF-1R的特异性抗体分离出表达IGF-1R的细胞；然后利用CD24的特异性抗体从所获得的表达IGF-1R的细胞中分离出同时还表达CD24的细胞。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞的方法是(a)将肺腺癌细胞群与表面携带第一抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(b)从步骤(a)获得的复合物上去除"第一抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞群；(C)将步骤(b)获得的肺腺癌细胞群与表面携带第二抗体的固相载体孵育，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(d)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞。或者，所述的从肺腺癌细胞群中分离出表达CD24和IGF-1R的细胞的方法是(i)将第一抗体加入肺腺癌细胞群，孵育后加入表面携带抗第一抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第一抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体；(ii)从步骤(i)获得的复合物上去除"第一抗体-抗第一抗体的抗体-固相载体"，从而获得经处理的肺腺癌细胞群；(iii)将第二抗体加入步骤(ii)获得的肺腺癌细胞群，孵育后加入表面携带抗第二抗体的抗体的固相载体，从而形成"肺腺癌细胞-第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"复合物，分离出该复合物；其中所述的第二抗体选自抗CD24的抗体，或抗IGF-1R的抗体，且所述的第二抗体与第一抗体不同；(iv)从步骤(iii)获得的复合物上去除"第二抗体-抗第二抗体的抗体-固相载体"，从而获得表达CD24和IGF-1R的细胞。7.—种CD24和IGF-1R或它们的特异性抗体的用途，其特征在于，用于从肺腺癌细胞群中分离肺腺癌干细胞；或者用于体外检测待测肺腺癌细胞是否是肺腺癌干细胞；或者用于制备分离肺腺癌干细胞的试剂或试剂盒；或者用于制备体外检测待测肺腺癌细胞是否是肺腺癌干细胞的检测试剂或试剂盒；或者用于制备选择性杀灭肺腺癌干细胞或诱导肺腺癌干细胞分化的药物。8.—种体外检测待测肺腺癌细胞是否是肺腺癌干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括体外检测待测肺腺癌细胞是否表达CD24和IGF-1R，如果待测肺腺癌细胞同时表达CD24和IGF-1R，则该细胞是肺腺癌干细胞。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测待测肺腺癌细胞是否表达CD24和IGF-1R的方法选自聚合酶链反应法，抗体特异性结合法，或流式细胞术。10.—种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有特异性抗CD24的抗体，和特异性抗IGF-1R的抗体。全文摘要本发明属于细胞生物学领域，公开了从肺腺癌细胞(群)中分离或鉴定肺腺癌干细胞(群)的方法，本发明还公开了分离或鉴定肺腺癌干细胞(群)的试剂和试剂盒。本发明首次揭示肺腺癌干细胞具有特别的标志物CD24和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)，为肺腺癌干细胞(群)的分离或鉴定提供了有效途径。文档编号C12N5/08GK101463342SQ20071017278公开日2009年6月24日申请日期2007年12月21日优先权日2007年12月21日发明者董强刚申请人:上海市肿瘤研究所