一种优化红霉素发酵组分的菌种、构建方法和用途的制作方法

专利名称：一种优化红霉素发酵组分的菌种、构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术工程领域，更具体的，本发明涉及一种代谢工程改造 的红霉素组分优化的菌种，该菌种的构建方法，以及该菌种在工业生产上的应 用。
背景技术：
红霉素是一类在临床上广泛使用的、用于治疗革兰氏阳性菌感染的广谱大
环内酯类抗生素。自1952年Lily公司首次成功开发第一代红霉素类抗生素一一 红霉素A以来，以阿齐霉素、克拉霉素、罗红霉素、氟红霉素、地红霉素和大 威霉素为代表的第二代红霉素类抗生素，和以泰利霉素、ABT-773为代表的第 三代红霉素类抗生素具有抗菌活性好、毒性低、不易诱导耐药性的特点，同时 疗程短、用药简便，在抗感染药物的使用中保持了较高的增长速度。目前，市 场上广泛使用的第二代和正在推向临床的第三代红霉素类抗生素，几乎全部是 通过微生物发酵合成红霉素A，然后以红霉素A为原料经半化学合成修饰而得 到的红霉素衍生物。
目前我国是世界最大的红霉素原料生产国，但是红霉素发酵生产还普遍存 在着有效成分含量偏低的问题。发酵粗产物中红霉素A的含量只有60 70%， 为了达到优级产品标准(92 95%)需经多步纯化，分离过程中其他红霉素相 关组分没有被很好地利用，造成大量的环境污染和浪费，提高了产品成本。因
此，这是红霉素发酵工业迫切需要解决的问题。
自从红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来，以提高其产生菌种发
酵单位为目的的常规遗传育种和菌种选育工作一直未曾停止。随着分子生物学 技术的发展，近年来，国际上在红霉素生产菌种的基因工程改造方面进行了诸 多尝试。但这些研究主要集中在与红霉素生产相关的底物供应或限制因素的改 进方面，并未就红霉素生物合成的次级代谢途径做特异性的遗传修饰，因此， 在解决红霉素生产中经常面临的有效组分偏低等问题时缺乏有效的针对性。 红霉素是迄今研究最多也最为详尽的一个模式菌株。1991年Leadlay和Katz等人首次报道了红霉素的生物合成基因簇。经过多个实验室IO余年的努 力，其生物合成途径及酶催化反应机制得到了比较完善的阐述，这为代谢工程 对其生物合成途径进行合理化改造提供了必须的遗传基础及生化基础。
人们期望运用代谢工程的手段对红霉素糖苷合成后修饰酶的活性进行调 节，可以避免无效组分(如红霉素B和C等)的产生或将其转化为有效组分红 霉素A，改善红霉素发酵产品的组分比例并间接提高红霉素A的含量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种红霉素生产菌种，这种优化红霉素发酵组分的 菌种能使其发酵产物组分明显优化。
本发明的目的还在于提供该菌种的构建方法。
本发明的目的还在于提供该菌种在红霉素工业生产上的应用。
本发明的优化红霉素发酵组分的菌种，已于2007年12月6日在中国科学 院微生物研究所保藏，分类命名5"acc力aro;w"5^ara e2Tf力r3e3的糖多孢红霉 菌，其菌种保藏编号为CGMCC2286 。系通过代谢工程的手段来强化红霉素生物 合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶(EryK)和碳霉糖甲基化酶(EryG) 的强度。所述的强化羟基化酶和甲基化酶的强度，是改变羟基化酶和甲基化酶 的基因拷贝，还包括引入改造的红霉素启动子(wm￡*)，从而得到的菌种中含 有基因eo;尺为m个，基因eo;G为n个，基因em五"^为k个，其中m = 2 6， n=l 5， k=l 3。优选地，m=3 5， n=2 4， k=l 3。最优选地，m=3， n = 2， k=l。本发明的优化红霉素发酵组分的菌种的基因型可以分别为 尸erm尺承-〖+尸erm五承-〖+G、 Perw^*-《-G +尸erw五承-K +尸er附J承-G、 尸erm夂承-iC +*-G +尸erm五承-尺-G Pew^ G +尸erw五氺扁〖+」*-G、
尸6/7 /:*-〖-(7 + 尸erw五承-《-^ + 尸erm爿、G 、 + PenwJ*-^ +
尸eA7w五承扁尺-尺-G 、尸enw/^-尺-C -^ +尸^附五*-〖+、尸^附^*扁兀+ 尸er附五承-《-G-尺+*-G、+尸erm」+尸erm五承-A:-G。
在本发明的另一优选例中所述的羟基化酶，是具有如下所示的核苷酸序
列
CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAA<formula>formula see original document page 8</formula>TTGCACTGCCCCGGCG
在本发明的另一优选例中所述的甲基化酶，是具有如下所示的核苷酸序ACGCGGTAG
在本发明的另一优选例中所述的红霉素启动子，是具有如下所示的核苷酸 序列
GTA
如本发明所用，"所书的羟基化酶，甲基化酶和红霉素启动子"包括上述 的基因序列对应的蛋白酶，也指经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而形成的同功能酶。比如，所述的羟基化酶类似物的序列是对羟基化酶的一
个或多个保守氨基酸进行替代所形成的，所述经氨基酸替换后形成的序列并不 影响其活性或保留了其大部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技
术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些 技术使本领域人员认识到， 一般来说，在一种蛋白或多肽的非必要区域改变一 个或多个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。
本发明的上述菌种的构建方法，提供一种载体，它含有所述的羟基化酶， 甲基化酶和红霉素启动子的组合。三者可以如前述的数目，任意搭配组合。在 本发明的优选例中所述的组合可以为ermE*-eo^ 、 、在本发明中所述的载体来源于大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒。
在本发明所述的红霉素菌种的构建方法，是红霉素生产菌含有上述的载 体；或它的基因组中整合有前述数目的羟基化酶，甲基化酶和红霉素启动子。
所述的红霉素生产菌，是一种具有红霉素生产能力的糖多孢红霉菌，分类 命名为5"acc力aropo7/5"pora er^f力raea。
在本发明的优选例中所述的红霉素生产菌可以为5"3cc力aro/ o7j^pora erj^^nsea HL3168 E3 、 5"3cc力aropoJys/ on3 e/y^Araea E1 、 5"scc力aropo7/^pora e/y^^rses NRRL2338或5"acc力aropo7j^s/7ar3 er7tAr3ea A226。
本方面可以进一步描述如下
针对现有红霉素生产菌发酵产物中杂质组分(如红霉素B和C等)较高， 红霉素发酵生产还普遍存在着有效成分含量偏低的问题，本发明人经过长期而
深入的研究和试验，首次通过代谢工程的手段来强化红霉素生物合成后修饰 酶，更具体的是指大环骨架上碳12位羟基化酶和碳霉糖甲基化酶的强度，引 入改造的红霉素启动子，并通过基因剂量的不同配比，来调节羟基化酶和甲基 化酶的强度和比例，从而避免无效组分(如红霉素B和C等)的产生或将其转 化为有效组分红霉素A，改善红霉素发酵产品的组分比例并间接提高红霉素A 的含量。基于此完成了本发明。
红霉素A (Er-A)生物合成的最后步骤是红霉素D (Er-D)的羟基化与甲 基化后修饰(图1)，存在两种途径一种途径是Er-D在C-12羟化酶的催化 下形成红霉素C(Er-C),接着在甲基化酶催化下在碳霉糖(mycarose)的C-3" 位甲基化而最终形成Er-A;另一种途径是Er-D可以先在mycarose的C-3"位 甲基化形成红霉素B (Er-B)，再通过C-12羟化酶催化形成Er-A。研究表明 C-12羟化酶对Er-D的催化能力是对Er-B催化能力的1200-1900倍，所以Er-B 的羟基化几乎可以忽略，Er-D经Er-B形成Er-A的这一途径可以看作是旁路代 谢，Er-B是红霉素生物合成的一个旁路产物。
发酵粗产物中积累Er-B、 Er-C和Er-D，说明Er-D的甲基化和羟基化修饰 不充分，所以要消除发酵粗产物中的杂质组分，可以从强化这两个酶的表达， 增加酶量入手。
强化表达羟化酶去除Er-B杂质组分既然Er-B是先甲基化后羟基化的旁路代谢产物，那么就要强化先羟化后甲 基化的主要代谢过程，消弱Er-D的甲基化，达到去除Er-B旁路代谢产物的目 的。采用的策略就是增加C-12羟化酶基因的拷贝数，并将其置于红霉素自身的 强启动子尸^附￡*下，从而增大羟化酶表达量。
在红霉素生物合成基因簇中，er;^基因与PKS共转录，都位于强启动子 ArmJ*T，而e/r^位于单基因操纵子的启动子尸^7 尺*下。本发明以出发菌株 S. eo^ raefl HL3168 E3的基因组为模板，采用引物(5'-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3'禾B 5，-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3，)克隆eo^基因的编码序列，得到1.7kb的PCR产物。其 中包含1194bp的编码序列，和eo《基因下游358bp自身含有的终止序列。将 其置于尸^附￡*启动子下，通过同源重组方式与原工业生产菌S. HL3168 E3基因组eo;《基因发生单交换重组。重组菌S. ZL1001含有
2个拷贝的eo^基因， 一个位于自身的启动子/^mf下， 一个位于尸armf强启 动子下，基因型为Perm尺、A: +尸erm五气尺+尸^7^^-G。基因型的分析和southern 确证如图3A， B所示。
如图4所示，重组菌S. w"Araea ZL1001的生物效价测定相对野生型S. eo^meaHL3168E3没有明显变化。但发酵液的HPLC分析揭示(如图3C)， Er-B几乎完全排除，而同时Er-C却相应地从6%增加到19%， Er-A: Er-B + C 的比例也从出发菌株的2.9提高到3.9。这一结果说明通过增加eo《的拷贝数确 实能够提高e^尺的酶活力，同时也说明原工业生产菌株能够进行遗传改造，而 不会影响它的生产能力。从eo^和eo;G基因的相对转录水平来看(图5)，在 重组菌S. ZL1001中eo^/ e^;G的相对转录水平增加了 5.13倍，也证
实了重组菌中eo^的表达得到了加强。
通过转化中间产物Er-B和Er-C到Er-A增加Er-A的产量
出发菌株& e^^mea HL3168 E3和重组菌S. eo^raea ZL1001中Er-C的
积累，说明甲基化酶的效率不够。本发明在强化eo《基因表达的基础上，进一 步强化甲基化酶，疏导Er-C转向Er-A，从而提高了 Er-A的产量，也明显减少 了中间产物的积累。
本发明以出发菌株S. eo^^eaHL3168E3的基因组为模板，采用引物(5'-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC -3'和5，-TTT ACT AGTGCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3，)克隆eo;尺基因的编码序列，得到1.32kb 的PCR产物，其中不包含eo^基因下游自身含有的终止序列。同样地，采用 引物(5，-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3' and 5'陽TCG ACT AGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3 ，)克隆eryG基因的编码序列， 得到L46kb的PCR产物，其中包含e^G基因全部编码序列。将eo^-G的拷 贝置于尸^7^￡*启动子下，通过同源重组方式与原工业生产菌S. HL3168 E3基因组中的eo;《基因或eo;G基因发生单交换重组，得到两种不同的 重组菌。重组菌S. eo^raea ZL1002含有2个拷贝的e^;/:基因和2个拷贝的e^G 基因，基因型为尸^7 〖*-(7 + Perm￡*-《+尸em^氺-G。重组菌S. e^^raea ZL1003含有2个拷贝的eo，《基因和2个拷贝的e^;G基因，基因型为尸ermi^-AT +^*-G +。基因型的分析和southern确证如图3A， B所示。
发酵液的HPLC分析(如图3C)显示，重组菌S. ZL1002和ZL1003
的中间产物Er-B和Er-C明显减少，ZL1002的Er-A: Er-B + C的比例也提高到 17.20。而生物效价测定结果显示(图4) ， ZL1003与出发菌株的差异不是很显 著，但ZL1002的Er产量提高了 21.5%，而相应的Er-B + C下降了 20.3%。
进一步调节羟化酶和甲基化酶的活性使得Er-A的产量和比例进一步提高
同时强化羟化酶和甲基化酶的表达后，红霉素组分得到了较大程度的改 善，但是也发现ZL1002和ZL1003相比较于ZL1001 Er-C明显降低，可Er-B 又有一定的增加。所以需要进一步强化羟化酶，并注意羟化酶与甲基化酶活性 的比例。实现完全排除先甲基化后羟化的途径，以达到最大程度积累有效组分 Er-A，减少杂质组分的目的。
本发明构建了两种不同顺序的含有2拷贝eo;AT基因和1拷贝e^G基因的 质粒eo^-《-G和eo^-G-尺，同样置于尸em^启动子下，通过同源重组方式与 原工业生产菌S. eo^raea HL3168 E3基因组eo^基因或e^G基因发生单交换 重组，得到六种不同的重组菌。重组菌都含有3个拷贝的eo^基因和2个拷贝 的e^G基因，S. e^^raea ZL1004基因型为+尸erm五承-尺+ 尸er附J轧G, ZL1005基因型为尸erm/P-G +尸enw五气^: +ZL1006 基因型为尸erwi^-《+尸ew^气G +尸erm^^-尺-G ， ZL1007基因型为 尸^附〖*-《-<7-〖+尸erm五气《+尸erwJ气G， ZL1008基因型为尸ermi^-〖+ 尸eAmE^-G-^ +尸erw^承-G， ZL1009基因型为Perm《*-《+尸emL4承-G-《+尸erw五^ii:-G。基因型的分析和southern确证如图3A， B所示。
从发酵液的HPLC分析(如图3C)可以看出，采用这一策略能明显改善红霉 素组分。有两种重组菌能基本上去除杂质组分，使有效组分比例达到99%以上， ZL1004和ZL1007的Er-B基本上降低至0; ZL1004的Er-C也小于1。％，而 ZL1007的Er-C基本上降低至0。这两种重组菌的发酵粗产物已经基本上达到了 去除杂质组分的目的。而且采用这一策略，也能更进一步提高红霉素产量(如 图4)。相对出发菌X e7/An3e" HL3168 E3，重组菌S. eo^/zraea ZL1004， ZL1005， ZL1006的Er产量提高了 24.6%， 14.7%， 7.4%， S. eo^/zraea ZL1007, ZL1008, ZL1009的Er产量提高了 30.2%， 27.7%， 11.5%。
实时定量PCR方法分析eo^T和erjG基因的相对转录水平
本发明以聚酮合成酶(PKS)的编码硫酯酶域(TE)的基因作为对照，提取 发酵3天的菌体的总RNA，通过实时定量PCR的方法研究了 eo^T和e^G基因的 相对转录水平(图5)。结果发现，Perwi:*启动子下的eo^，eo^-G,e/ii:-G or eo^-G-尺同源交换整合到HL3168 E3能够明显增强e^/C禾卩e^G的表 达。当eo^和wj;G基因的拷贝数比例为3: 2，相对转录强度为2.5-3.0: 1时， 基本能够去除中间代谢组分Er-B和Er-C。
釆用本发明的上述菌种发酵可以用于红霉素工业生产上,不仅可以简化生 产工艺，降低生产成本。而且能够将杂质组分红霉素B完全去除或能够将杂质 组分红霉素B和C完全去除，只获得产生红霉素主要有效组份红霉素A的目 的。


图l红霉素A的生物合成途径。
图2出发菌株S. eo;AraeflHL3168E3发酵液的高效液相色谱(HPLC)分
析以及和红霉素A、 B和C标准品的对照。
图3出发菌株S. eo;AraeaHL3168 E3和重组菌的基因型和表型。 图4出发菌株S. HL3168 E3和重组菌的生物效价测定。
图5出发菌株S. eo^raea HL3168 E3和重组菌的的e^^和e^G基因的相
对表达强度比较。 符号说明附图3中:误差线I表示95n/。标准偏差；A是Sma/或S/^/的限制酶切图谱； B是以含有eo^基因的1.7kb的片段为探针，用Sma/或印A/消化的总DNA 的southern图谱；C，红霉素发酵液的HPLC分析參，红霉素C; ★，红霉 素A; ▲，红霉素B; I表示出发菌株S. eo^raeaHL3168 E3; II、 III、 IV、
V、 VI、 W、 VID、 IX和X分别表示重组菌；kb表示碱基对。
附图4和5中Erythromycin表示红霉素；HL3168表示出发菌株S. eo^raea HL3168E3; ZL1001 ZL1009分别表示相对应的附图3中的II 、 III、 IV、 V、
VI、 W、 VDI、 IX和X重组菌；Relative mRNA表示相对相对转录水平。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内 容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本方面的 内容。
实施例1 红霉素工业生产菌HL3168 E3遗传转移系统的建立 培养含有适当质粒的五.co// ET12567至OD6oo=0.5-0.6， 25mL培养液中的 细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆 菌供体细胞。取适量冻存于一80。C的S.e，/wY ea HL3168E3的20%甘油孢子悬 液500pL，用等体积的TES buffer洗两次，重悬于等体积的TES buffer, 50'C 热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB， 37。C温育2 —5hr。离心重悬于0.5 一lmL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100pL与等体积的 供体细胞混合直接涂布在含有10mMMgCl2的MS平板上，3(TC培养20hr后， 采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖 含萘啶酮酸(终浓度为50ng/pL)和相应抗生素的lmL无菌水。3(TC培养5天以上挑取接合子。
实施例2红霉素的摇瓶发酵 红霉素工业生产菌株HL3168 E3和它的重组菌株在斜面培养基[/ L: 10 g 玉米淀粉，10 ml玉米浆，3 g氯化钠，3 g硫酸铵，5 g碳酸钙，pH 7.0, 2 g琼脂粉] (重组菌培养时在培养基中加入适当的抗生素)34 。C培养7天生长孢子，作为 液体发酵的种子。
液体发酵时，从斜面培养基上取1 cm2大小方块接入50 ml发酵种子培养 基[/ L: 50 g玉米淀粉，18 g黄豆饼粉，13 ml玉米浆，3 g氯化钠，1.2 g硫酸 铵，1.2g硝酸铵，5ml豆油，6 g碳酸钙，pH 6.8-7.0]，在34°C， 250 rpm培养 2天。然后将5ml的种子培养液转接到50ml发酵培养基[/L:40g玉米淀粉， 30 g黄豆饼粉，30 g糊精，2 g硫酸铵，10 ml豆油，6 g碳酸钙，pH自然]，在34°C， 250rpm培养6天。接种24小时后补加0.5 ml的正丙醇。
实施例3红霉素发酵液产物抽提 在100ml烧杯中，准确量取适量发酵液以NaOH调pH至8.9。若样品冰冻， 应融化后混合均匀定量转移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均匀，8000 9000离心10min。
取25ml上述溶液于125ml分液漏斗中，加25ml正己烷，震荡5min，收 集水相(下层)于离心管中，用水洗涤己垸层2次后，水相与离心管水相混合， 加入10ml氯仿，激烈震荡5min， 2500离心5min，依样品情况，可能会在界面 形成乳状液，可用玻棒分散或再次离心，弃水相，将氯仿(下层)移至10ml 的小瓶中，浓縮。
实施例4红霉素发酵液生物效价测定 取直径约90mm，高16—17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基 20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层，另取培养基适 量加热融化后，放冷至48 — 50。C，加入短小芽孢杆菌菌悬液适量，摇匀，在每 一双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为上层含菌层。放置水平台 上冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管(内径6.0mm士0.1mm,高1.0 士0.1mm,外径7.8士0.1mm)四个，用瓦盖覆盖备用。将样品分成高低两个浓度
16以磷酸缓冲液进行适当稀释后加入牛津杯。高低浓度的稀释倍数为2:1或4:1， 二剂量法标准溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18 — 22mm以内,抗生素浓度 范围为5 —20单位/ml。 37'C培养14—16小时后，测量抑菌圈大小。
实施例5红霉素发酵液的色-质谱分析
样品分析前加入适当的流动相，超声助溶，进样20P1。 组分的分析采用HPLC检测
色谱柱NUCLEOSIL 100-5 CN column (250 x 4.6mm, Ser. No. 6105322, MACHEREY-NAGEL Inc., Germany)。
流动相69% A相(32 mM potassium phosphate buffer, pH8.0) ， 31% B 相(acetonitrile/methanol: 75/25)。检测条件流速1 ml/min， UV检测波长215 nm，在Agilent 1100 HPLC system (Agilent Technologies. Palo Alto， CA)上分析时间为50分钟。 组分的鉴定采用LC-MS检测
色谱柱Microsorb-MV C18 (250x4.6 mm, Part No. 281505, VARIAN Inc., American) 0
流动相62% A相(30 mM ammonium acetate, pH4.8) ， 38% B相 (acetonitrile)。
检测条件:流速1 ml/min， UV检测波长215 nm，在LCMS-2010 A (Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, SHIMADZU， JP)上分析时间为30分钟。
Er-A, Er-B和Er-C分子离子峰分别为m/z = 734.2, m/z = 718.3 and m/z = 720.3,与对应的分子式(:371167>^013，(:371167>^012311(1(:361165013 —致。
实施例6基因工程重组菌株的获得
将获得的接合子接种到液体培养基TSB(Am 25 g/ml)中，30"C振荡培养约 72hr。取出200lU涂布在斜面培养基上(见实施例2)(Am 50ug/ml)， 30。C培养 6-8天，收孢子，保存于-80。C;取出10lU在斜面培养基上(Am 50ug/ml)画 线，37'C培养，放置2 — 3天。挑37'C整合生长的单菌落，接种至液体培养基 TSB(Am 25 u g/ml), 37°C ，振荡培养2 — 3天。取出涂布在斜面培养基上(Am 50 ug/ml)， 37°。培养6天，收孢子，保存于-8(TC。取出10 liL接种至液体培养 基TSB(Am 25ug/ml), 37°C，振荡培养2 —3天，小量抽提基因组DNA，进行 southern杂交鉴定其基因型，与理论整合后的片段大小比较，挑取基因型正确 的重组菌株。
实施例7核酸分子杂交 l)DIGDNA标记将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15pL，沸水浴 中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2pL引物混合物，2pL dNTP混合物，lpL酶，混合均匀后，37'C水浴约16小时。加入0.8pL 0.8M EDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5pL4MLiCl混合均匀，再加入75pL预冷的 无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于一8(TC沉降40分钟。4°C， 12000rpm离心 20分钟收集DNA，用预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于 50pLTE( (pH8.0)中。2) DIGDNA探针标记后的质量检测稀释经l)标记得到的DNA探针，至 以下六个梯度，1、 10"、 l(T2、 10-3、 10-4、 10-5。稀释标记的对照DNA至以下 浓度lpg/mL， 100ng/mL， 10ng/mL， lng/mL， 0.1ng/mL， 0.01ng/mL。分别取 lpL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据6)所述步骤进行显色 反应，对比标记的DNA探针和对照DNA的显色强度以决定所标记的DNA探 针浓度。
3) Southern杂交的膜转移DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适 当距离，做好标记。浸泡于400mL 0.25M HC1中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变 黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5MNaOH， 1M NaCl) 15 分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗 三次。取一张每边都比凝胶大lmm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标 记。采用向上毛细管转移方法，用10xSSC转移缓冲液转移8 —24hr。用2xSSC 略微洗膜，12(TC烘烤30分钟。
4) 预杂交和杂交预热杂交液(20mL/100cm2)至杂交温度68。C，放入杂 交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性 5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂 交液(2.5mL/100cm2)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交 液加入，轻轻振荡保持杂交温度64'C或68'C约16小时。
5) 杂交后严紧洗脱室温下用2xSSC/0.P/。SDS漂洗两次，每次5分钟。68 °C，用0.1xSSC/0."/。SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。
6) 显色反应和检测严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸， 0.15M NaCl， pH=7.5,0.3%(v/v)Tween 20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲 液(封闭试剂以10。/。的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl， pH=7.5)中封闭 30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检 测缓冲液(0.1M Tris-HCl， 0.1M NaCl， pH=9.5)平衡2-5分钟，最后将尼龙 膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于 70%DMF，浓度为70mg/mL， BCIP(5-bromo-4-chloro画3-indolyl-phosphate)溶于 水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45|iL NBT ， 35pLBCIP]中， 置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。
实施例8 mRNA水平的实验采用Kirby mix protocol从发酵培养3天的菌体提取总RNA，然后采用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)进行RNA的纯化。
采用实时定量PCR和2"et的方法研究eo^和eo;G的相对表达水平，以 PKS中的硫酯酶域(TE)基因作为参照。以适量纯化的总RNA为模板，用随 机六聚引物和SuperscriptIII反转录酶转录合成第一链cDNA。RT-PCR的反应体 系(25ul): 25 ng cDNA， 2x SYBR Premix EX Taq mix buffer, 300 nM正向和反 向引物。PCR循环条件为95 °C预变性5min，然后是95 °C下15 s和60 °C 下60 s进行40个循环。RT-PCR在FTC-2000 (FengLing BioTech. Co., Shanghai) 上进行。每一个样品实验重复进行三次。e^;《基因引物如下正向 5'-ACCTGATCTCCCGCCTTGTC，反向5，-AGGACGGTCGTGGTGATGTG。 eryG基因引物如下正向 5，-CAAGAAGAGCGTGAGCAGGC ， 反向 5，-CTGAGGCGATCACGAAGTCG 。 基因引物如下正向 5，-
CCTGATCGACGTCTACCCGC ，反向5，-TCGTCCATCCGCACCGTCTC。
权利要求
1. 一种优化红霉素发酵组分的菌种，系一种分类命名为Saccharopolyspora erythraea的糖多孢红霉菌，该菌种保藏编号为CGMCC2286。
2. 如权利要求1所述的菌种，其特征在于，通过代谢工程的手段来强化 红霉素生物合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶EryK和碳霉糖甲基化酶 EryG的强度，改变羟基化酶和甲基化酶的基因拷贝，引入改造的红霉素启动子 erm￡*，得到的菌种中含有基因e7《为m个，基因为n个，基因^tw￡* 为k个，其中m^2 6， n=l 5， k=l 3。
3. 如权利要求2所述的菌种，其特征在于，所述的羟基化酶具有如下的核 苷酸序列TTGCACTGCCCCGGCG。
4.如权利要求2所述的菌种，其特征在于，所述的甲基化酶具有如下的核 苷酸序列<formula>formula see original document page 4</formula>
5.如权利要求2所述的菌种，其特征在于，所述的红霉素启动子具有如下的核苷酸序列<formula>formula see original document page 4</formula>
6. —种如权利要求l所述的红霉素菌种的构建方法，其特征在于，通过下 述(l) 、 (2)或(3)三种步骤分别获得(1)，以出发菌株S. e7Araea HL3168 E3的基因组为模板，采用引物 5'-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3'和5，-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3，克隆eo^基因的编码序列，得到 1.7kb的PCR产物,将其置于尸ermP启动子下，通过同源重组方式与原工业生产菌 S. eo^mea HL3168 E3基因组eo;《基因发生单交换重组，该重组菌含有2个拷贝的eo;AT基因， 一个位于自身的启动子尸en^:'下， 一个位于尸ermf强启动子下， 基因型为尸^附^*-〖+ PermE*-^ +*-G;或(2) ,以出发菌株S. e，/^ea HL3168 E3的基因组为模板，采用引物5'-AAACTCGAGCACCGCGGAAGTCTCGAC ACC-3'和5'-TTTACTAGT GCTGCC CGACTACGC CGA CTG-3，克隆eo;尺基因的编码序列，得至Ul.3kb的 PCR产物，其中不包含eo^基因下游自身含有的终止序列;同样地，采用引物 5'-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3' and 5，-TCG ACT AGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3，克隆eo;G基因的编码序列，得到 1.5kb的PCR产物，其中包含e7G基因全部编码序歹1J;将eo^-G的拷贝置于 尸^附￡*启动子下，通过同源重组方式与原工业生产菌S. HL3168 E3基 因组中的eo^基因或e^G基因发生单交换重组，分别得到二种重组菌含有2个 拷贝的eo^基因和2个拷贝的e^;G基因，基因型为Perw7P-G +尸erm五气〖+ 尸em^、G的重组菌;含有2个拷贝的e;3^基因和2个拷贝的eo^基因，基因型为+ Perm^ *-G +尸erm五、尺-G的重组菌；或(3) ,构建了两种不同顺序的含有2拷贝e7《基因和l拷贝eo;G基因的质粒 erj^-G和eo;CM分别置于尸erm^^启动子下，通过同源重组方式与原工 业生产菌S. eo;&rae" HL3168 E3基因组eo^基因或eo;G基因发生单交换重组，分 别得到含有3个拷贝的eo;《基因和2个拷贝的eo;G基因的六种基因型分别为如下 的重组菌++尸erm爿承画G、 ？"m^*-《-G + 尸^tw五承-A:-A: +尸em^承匿G、 尸^附〖*-尺+尸enw爿承-G +尸^附五*-尺-《-<7 、 ^ermi^-iC-G-A: +尸erm五承-ii: +尸erw^承-G、 PerwK*-/: +尸^附五*扁《-(7-〖+
7. —种如权利要求l所述的红霉素菌种用于生产红霉素。
8. 如权利要求7所述的红霉素菌种的用途，其特征在于所述的红霉素是 红霉素A。
全文摘要
本发明公开了一种优化红霉素发酵组分的菌种，构建方法和应用。该菌种是一种分类命名为Saccharopolyspora erythraea的糖多孢红霉菌，保藏编号为CGMCC2286。系通过代谢工程的手段来强化红霉素生物合成后修饰酶，更具体的是指大环骨架上碳12位羟基化酶和碳霉糖甲基化酶的强度，引入改造的红霉素启动子，并通过基因剂量的不同配比，来调节羟基化酶和甲基化酶的强度和比例，从而获得只产生红霉素主要有效组份，即红霉素A的菌种。采用这样的菌种发酵不仅可以减少杂质组分，甚至完全去除杂质组分红霉素B和C等的目的，而且可以简化生产工艺，降低生产成本。
文档编号C12N15/11GK101423803SQ20071017370
公开日2009年5月6日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者文 刘, 张嗣良, 玮 邓, 云 陈 申请人:中国科学院上海有机化学研究所;华东理工大学