专利名称：一种重组质粒、构建方法和用于红霉素产生菌的遗传改造的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，更具体的，本发明涉及一种基因工程构建的重组质粒，以及该重组质粒的构建方法和该质粒在红霉素产生菌遗传改造上的应用。
背景技术：
红霉素是一类在临床上广泛使用的、用于治疗革兰氏阳性菌感染的广谱大环内酯类抗生素。自1952年Lily公司首次成功开发第一代红霉素类抗生素--红霉素A以来，以阿齐霉素、克拉霉素、罗红霉素、氟红霉素、地红霉素和大威霉素为代表的第二代红霉素类抗生素，和以泰利霉素、ABT-773为代表的第三代红霉素类抗生素具有抗菌活性好、毒性低、不易诱导耐药性的特点，同时疗程短、用药简便，在抗感染药物的使用中保持了较高的增长速度。目前，市场上广泛使用的第二代和正在推向临床的第三代红霉素类抗生素，几乎全部是通过微生物发酵合成红霉素A，然后以红霉素A为原料经半化学合成修饰而得到的红霉素衍生物。
目前我国是世界最大的红霉素原料生产国，但是红霉素发酵生产还普遍存在着有效成分含量偏低的问题。发酵粗产物中红霉素A的含量只有60～70％，为了达到优级产品标准(92～95％)需经多步纯化，分离过程中其他红霉素相关组分没有被很好地利用，造成大量的环境污染和浪费，提高了产品成本。因此，这是红霉素发酵工业迫切需要解决的问题。
自从红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来，以提高其产生菌种发酵单位为目的的常规遗传育种和菌种选育工作一直未曾停止。随着分子生物学技术的发展，近年来，国际上在红霉素生产菌种的基因工程改造方面进行了诸多尝试。但这些研究主要集中在与红霉素生产相关的底物供应或限制因素的改进方面，并未就红霉素生物合成的次级代谢途径做特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中经常面临的有效组分偏低等问题时缺乏有效的针对性。
红霉素是迄今研究最多也最为详尽的一个模式菌株。1991年Leadlay和Katz等人首次报道了红霉素的生物合成基因簇。经过多个实验室10余年的努力，其生物合成途径及酶催化反应机制得到了比较完善的阐述，这为代谢工程对其生物合成途径进行合理化改造提供了必须的遗传基础及生化基础。
人们期望运用代谢工程的手段对红霉素产生菌进行遗传改造，可以避免无效组分(如红霉素B和C等)的产生或将其转化为有效组分红霉素A，改善红霉素发酵产品的组分比例并间接提高红霉素A的含量。然而菌种的遗传改造需要合适的操作工具和操作方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因工程构建的重组质粒，由载体和在多克隆位点上加入一个含有红霉素启动子，大环骨架上碳12位羟基化酶，碳霉糖甲基化酶组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等类似的载体；所述的组合，主要特征是含有红霉素启动子(ErmE*)为m个，羟基化酶(EryK)为n个，甲基化酶(EryG)为k个，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它们可以任意搭配组合。
本发明的目的还在于提供该重组质粒的构建方法。
本发明的另一目的还在于提供该重组质粒在红霉素产生菌遗传改造上的应用。
在本发明提供的一种重组质粒，由载体和在多克隆位点上加入一个含有红霉素启动子，大环骨架上碳12位羟基化酶，碳霉糖甲基化酶组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等及其类似的载体；所述的组合，主要特征是含有红霉素启动子(ErmE*)为m个，羟基化酶(EryK)为n个，甲基化酶(EryG)为k个，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，三者可以按所述的数目，任意搭配组合。优选地，m＝1～2，n＝1～3，k＝0～2。最优选地，m＝1，n＝2，k＝1。在本发明的优选例中所述的组合可以为ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*eryK-eryG-eryK。
在本发明中所述的羟基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG 在本发明中所述的甲基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG 在本发明中所述的红霉素启动子，是具有如下所示的核苷酸序列 TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA 如本发明所用，“所述的羟基化酶，甲基化酶和红霉素启动子”包括上述的基因序列对应的蛋白酶，也指经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的同功能酶。比如，所述的羟基化酶类似物的序列是对羟基化酶的一个或多个保守氨基酸进行替代所形成的，所述经氨基酸替换后形成的序列并不影响其活性或保留了其大部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种蛋白或多肽的非必要区域改变一个或多个氨基酸基本上不会改变生物活性(见Watson等Molecular Biology ofThe Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。
本发明提供的上述重组质粒的构建方法，系由载体和在多克隆位点上加入一个含有红霉素启动子，大环骨架上碳12位羟基化酶，碳霉糖甲基化酶组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260，pWHM3或pSET152等及其类似的载体；所述的组合，是含有红霉素启动子(ErmE*)为m个，羟基化酶(EryK)为n个，甲基化酶(EryG)为k个，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它们可以如所述的数目，任意搭配组合。
可以进一步描述如下 针对现有红霉素产生菌的遗传改造主要集中在与红霉素生产相关的底物供应或限制因素的改进方面，并未就红霉素生物合成的次级代谢途径做特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中经常面临的有效组分偏低等问题时缺乏有效的针对性。本发明人经过长期而深入的研究和试验，首次通过基因工程的手段对克隆的红霉素生物合成后修饰酶，更具体的是指大环骨架上碳12位羟基化酶和碳霉糖甲基化酶，以及克隆并改进的红霉素启动子，通过其不同搭配组合来构建重组质粒，并用于红霉素产生菌的遗传改造，发现能明显改善红霉素组分，甚至获得了只产生单一有效组分的生产菌种。基于此完成了本发明。
(1)，以红霉素生产菌株S.erythraea HL3168E3的基因组为模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的编码序列，得到1.7kb的PCR产物，将其置于PermE*启动子下，通过酶切位点克隆到大肠杆菌和链霉菌穿梭载体中，得到含有ermE*-eryK结构的重组质粒； (2)，以红霉素生产菌株S.erythraea HL3168E3的基因组为模板，采用引物5’-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3’克隆eryK基因的编码序列，得到1.3kb的PCR产物，其中不包含eryK基因下游自身含有的终止序列；同样地，采用引物5’-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’and 5’-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3’克隆eryG基因的编码序列，得到1.5kb的PCR产物，将eryK-G的拷贝置于PermE*启动子下，通过酶切位点克隆到大肠杆菌和链霉菌穿梭载体中，得到含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒；或 (3)，将上述(2)得到的eryK基因PCR产物和eryG基因PCR产物，通过酶切位点克隆到载体中，得到两种不同顺序拷贝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分别置于PermE*启动子下，再通过酶切位点连入大肠杆菌和链霉菌穿梭载体中，得到含有ermE*-eryK-eryK-eryG结构或含有ermE*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒。
本发明还提供一种所述的重组质粒的用途，用于红霉素产生菌的遗传改造，该红霉素生产菌已经同时申请发明名称为‘一种优化红霉素发酵组分的菌种、构建方法和用途’的中国专利。红霉素生产菌可以含有所述的重组质粒；或 它的基因组中整合有额外的所述数目的羟基化酶，甲基化酶和红霉素启动子。
所述的红霉素生产菌，是具有红霉素生产能力的糖多孢红霉菌，分类命名为Saccharopolyspora erythraea。
在本发明的优选例中所述的红霉素生产菌可以为Saccharopolysporaerythraea HL3168E3、Saccharopolyspora erythraea E1、Saccharopolysporaerythraea NRRL2338或Saccharopolyspora erythraea A226。
可以进一步描述如下 (1)，以含有ermE*-eryK结构的重组质粒对红霉素生产菌S.erythraeaHL3168E3进行改造，能够完全消除原菌株的杂质红霉素B组分。
将含有含有ermE*-eryK结构的重组质粒通过属间接合转移的方法导入红霉素生产菌S.erythraea HL3168E3，通过抗性筛选初步得到接合子，进一步通过southern确证，得到通过同源重组方式与原生产菌S.erythraea HL3168E3基因组eryK基因发生单交换重组的重组菌S.erythraea ZL1001。其基因型为PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G。基因型的分析和southern确证如图8A，B所示。
如图9所示，重组菌S.erythraea ZL1001的生物效价测定相对野生型S.erythraea HL3168E3没有明显变化。但发酵液的HPLC分析揭示(如图8C)，Er-B几乎完全排除，而同时Er-C却相应地从6％增加到19％，Er-AEr-B+C的比例也从出发菌株的2.9提高到3.9。这一结果说明使用这样的重组质粒对原生产菌株进行遗传改造，能够完全消除杂质红霉素B组分，达到有效改善红霉素组分的目的。
(2)，以含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒对红霉素生产菌S.erythraea HL3168E3进行改造，能够明显降低原菌株的杂质红霉素B和C组分。
将含有含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒通过属间接合转移的方法导入红霉素生产菌S.erythraea HL3168E3，通过抗性筛选初步得到接合子，进一步通过southern确证，得到通过同源重组方式与原生产菌S.erythraea HL3168E3基因组eryK基因发生单交换重组的重组菌S.erythraea ZL1002，其基因型为PermK*-K-G+PermE*-K+PermA*-G。或与原生产菌S.erythraea HL3168E3基因组ery G基因发生单交换重组的重组菌S.erythraea ZL1003，其基因型为PermK*-K+PermA*-G+PermE*-K-G。基因型的分析和southern确证如图8A，B所示。
发酵液的HPLC分析(如图8C)显示，重组菌S.erythraea ZL1002和ZL1003的中间产物Er-B和Er-C明显减少，ZL1002的Er-AEr-B+C的比例也提高到17.20。而生物效价测定结果显示(图9)，ZL1003与出发菌株的差异不是很显著，但ZL1002的Er产量提高了21.5％，而相应的Er-B+C下降了20.3％。这一结果说明使用这样的重组质粒对原生产菌株进行遗传改造，能够明显降低原菌株的杂质红霉素B和C组分，达到有效改善红霉素组分的目的。
(3)，以含有ermE*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒对红霉素生产菌S.erythraea HL3168E3进行改造，能够完全去除原菌株的杂质红霉素B和C组分。
将含有含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒通过属间接合转移的方法导入红霉素生产菌S.erythraea HL3168E3，通过抗性筛选初步得到接合子，进一步通过southern确证，得到通过同源重组方式与原生产菌S.erythraea HL3168E3基因组eryK基因发生单交换重组的重组菌S.erythraea ZL1007，基因型为PermK*-K-G-K+PermE*-K+PermA*-G，和ZL1008基因型为PermK*-K+PermE*-K-G-K+PermA*-G，或与原生产菌S.erythraea HL3168E3基因组ery G基因发生单交换重组的重组菌S.erythraea ZL1009，基因型为PermK*-K+PermA*-G-K+PermE*-K-G。基因型的分析和southern确证如图8A，B所示。
从发酵液的HPLC分析(如图8C)可以看出，采用这一策略能明显改善红霉素组分。有两种重组菌能基本上去除杂质组分，ZL1007的Er-B和Er-C基本上降低至0，只产生单一有效组份Er-A。这种重组菌的发酵粗产物已经基本上达到了去除杂质组分的目的。而且采用这一策略，也能更进一步提高红霉素产量(如图9)。相对出发菌S.erythraea HL3168E3，重组菌S.erythraea ZL1007，ZL1008，ZL1009的Er产量提高了30.2％，27.7％，11.5％。
采用本发明的上述重组质粒可以用于红霉素生产菌的遗传改造，能够明显改善红霉素组分，甚至获得只产生红霉素主要有效组份红霉素A的生产菌种。
图1PCR扩增得到羟基化酶，甲基化酶基因的琼脂糖电泳结果。
图2含有ermE*-eryK结构的重组质粒的构建过程。
图3含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒的构建过程。
图4含有ermE*-eryK-eryK-eryG结构的重组质粒的构建过程。
图5含有ermE*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒的构建过程。
图6组合分别为ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒的酶切鉴定。
图7出发菌株S.erythraea HL3168E3发酵液的高效液相色谱(HPLC)分析以及和红霉素A、B和C标准品的对照。
图8出发菌株S.erythraea HL3168E3和重组菌的基因型和表型。
图9出发菌株S.erythraea HL3168E3和重组菌的生物效价测定。
符号说明 附图1中A是羟基化酶的1.7kb PCR产物，其中泳道1.1kb分子量标准，泳道2.EryK基因1.7kb PCR产物；B是羟基化酶1.3kb PCR产物和甲基化酶1.5kbPCR产物，其中泳道1.1kb分子量标准，泳道2.eryG基因PCR产物，泳道3.eryK基因PCR产物。
附图6中A是含有ermE*-eryK结构的重组质粒pCY1-56-B(A)的酶切鉴定，其中泳道1.1Kb分子量标准，泳道2.pCY1-56-B EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY1-56-B PstI酶切，泳道4.pCY1-56-B BamHI酶切；B是含有ermE*-eryK结构的重组质粒pCY1-96-1(B)的酶切鉴定，其中泳道5.1Kb分子量标准，泳道6.pCY1-96-1EcoRI/HindIII酶切，泳道7.pCY1-96-1BamHI酶切；C是含有ermE*-eryK-eryG结构的重组质粒pCY3-69-1的酶切鉴定，其中泳道1.1Kb分子量标准，泳道2.pCY3-69-1EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-1XhoI酶切；D是含有ermE*-eryK-eryK-eryG结构的重组质粒pCY3-69-3的酶切鉴定，其中泳道1，4.1Kb分子量标准，泳道2.pCY3-69-3EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-3XhoI酶切；E是含有ermE*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒pCY4-17-6的酶切鉴定，其中泳道4.1Kb分子量标准，泳道5.pCY4-17-6EcoRI/HindIII酶切，泳道6.pCY4-17-6XhoI酶切；kb表示碱基对。
附图8中误差线I表示95％标准偏差；A是SmaI或SphI的限制酶切图谱；B是以含有eryK基因的1.7kb的片段为探针，用SmaI或SphI消化的总DNA的southern图谱；C，红霉素发酵液的HPLC分析●，红霉素C；★，红霉素A；▲，红霉素B；I表示出发菌株S.erythraea HL3168E3；II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X分别表示重组菌；kb表示碱基对。
附图9中Erythromycin表示红霉素；HL3168表示出发菌株S.erythraeaHL3168E3；ZL1001～ZL1009分别表示相对应的附图8中的II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X重组菌。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本方面的内容。
实施例1含有ermE＊-eryK结构的重组质粒的构建 以工业生产上糖多孢红霉菌S.erythraea HL3168E3的基因组DNA为模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的编码序列，结果如图1.A所示，得到1.7kb的PCR产物。
将上述PCR产物回收纯化后克隆至
-Teasy载体，酶切验证后，进行测序。我们将测序结果与Genebank中Stassi提交的数据进行比较后发现，有两处不一致。一处位于启动子区，在起始密码子上游38bp处，碱基由TGC变为TTC，这一位置的氨基酸由Genebank的半胱氨酸(Cys)变为我们生产菌中的苯丙氨酸(Phe)；另一处位于编码区内，在起始密码子下游988bp处，碱基由TTC变为CTC，相应氨基酸由数据库中的苯丙氨酸(Phe)变为生产菌中的亮氨酸(Leu)。
从测序正确的克隆载体pCY1-40-B中用PstI和HindIII双酶切下1.7kb目的片段eryK基因，克隆至PstI/HindIII酶切的载体pWHM3得到重组质粒pCY1-50-C，再从质粒BSVII-41-F中用EcoRI/XbaI酶切下0.5kb含有改造的红霉素自身的强启动子PermE＊，克隆到EcoRI/XbaI酶切的质粒pCY1-50-C，于是得到含有PermE＊-eryK基因的重组质粒pCY1-56-B。用EcoRI/HindIII酶切质粒pCY1-56-B，回收2.2kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的pKC1139载体中，得到重组质粒pCY1-96-1。构建过程如图2所示。
分别选用几组酶来酶切验证重组质粒pCY1-56-B和pCY1-96-1，酶切图谱如图6.A和B所示，与理论预期完全一致，证明构建的重组质粒正确。
实施例2含有ermE＊-eryK-eryG结构的重组质粒的构建 以工业生产上糖多孢红霉菌S.erythraea HL3168E3的基因组DNA为模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’及5’-TTA CCA TGGGGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’和5’-TCG ACT AGT CTA CCG CGTGCT GCG CTC CTA-3’克隆eryK基因和eryG基因的编码序列，产物用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1.B所示，可见产物有非常特异的扩增。
将eryK基因PCR产物克隆到载体pANT841中，测序鉴定，得到eryK基因序列正确的载体pCY3-48-K4。从质粒BSVII-41-F中用EcoRI/SacI酶切下改造的红霉素组成型启动子PermE＊片段，插入到EcoRI/SacI酶切的质粒pCY3-48-K4，于是得到含有PermE＊-eryK基因的重组质粒pCY3-58-B1。将eryG基因PCR产物用NcoI/SpeI酶切下克隆到载体pANT841中，测序鉴定，得到含有eryG基因序列正确的重组质粒pCY3-48-G4。用NcoI/HindIII酶切质粒pCY3-48-G4，回收1.5kb的eryG基因目标产物，插入到NcoI/HindIII酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pCY3-60-A8，再用XbaI/HindIII酶切质粒pCY3-60-A8，回收1.5kb的eryG基因目标产物，利用SpeI和XbaI的同尾酶特点，将回收片段插入到SpeI/HindIII酶切的质粒pCY3-58-B1，得到含有PermE＊-eryK-eryG基因拷贝的重组质粒pCY3-64-KG1，并用EcoRI/HindIII酶切，回收3.3kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的载体pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重组质粒pCY3-69-1，构建过程如图3所示。
分别选用几组酶来酶切验证重组质粒pCY3-69-1，酶切图谱如图6.C所示，与理论预期完全一致，证明构建的重组质粒正确。
实施例3含有ermE＊-eryK-eryK-eryG结构和ermE＊-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒的构建 从eryK基因测序正确的质粒pCY3-48-K4中用XhoI和HindIII双酶切下1.3kb目的片段eryK基因，克隆至XhoI/HindIII酶切的载体pGEM-7zf，得到质粒pCY3-58-F6，而后再用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，利用XbaI和SpeI同尾酶的特点，克隆到SpeI/HindIII双切的质粒pCY3-58-B1，于是得到含有PermE＊-eryK-eryK基因串联拷贝形式的重组质粒pCY3-62-KK8。
另外从eryG基因测序正确的质粒pCY3-60-A8中用XbaI/HindIII双酶切下1.5kb目的片段eryG基因，再克隆到SpeI/HindIII双切的质粒pCY3-62-KK8中，得到含有PermE＊-eryK-eryK-eryG基因串联拷贝形式的重组质粒pCY3-66-KKG6，然后用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的载体pKC 1139中，得到pKC 1139衍生的重组质粒pCY3-69-3，构建过程如图4所示。
从质粒pCY3-58-F6用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，克隆到SpeI/HindIII双切的质粒pCY3-64-KG1，得到含有PermE＊-eryK-eryG-eryK基因串联拷贝形式的重组质粒pCY4-16-8，然后用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6 kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的载体pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重组质粒pCY4-17-6，构建过程如图5。
分别选用几组酶来酶切验证重组质粒pCY3-69-3和pCY4-17-6，酶切图谱如图6.D和E所示，与理论预期完全一致，证明构建的重组质粒正确。
实施例4含有ermE＊-eryK结构的重组质粒用于红霉素工业生产菌HL3168E3的遗传改造 将鉴定后的重组质粒pCY1-96-1转化到大肠杆菌E.coli ET12567中，按如下方式将其导入S.erythraea HL3168E3中培养含有适当质粒的E.coli ET12567至OD600＝0.5-0.6，25mL培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的S.erythraeaHL3168E3的20％甘油孢子悬液500μL，用等体积的TES buffer洗两次，重悬于等体积的TES buffer，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB，37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM MgCl2的MS平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的1mL无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。
所得到的重组菌株，取出10μL接种至液体培养基TSB(Am 25μg/ml)，37℃，振荡培养2-3天，小量抽提基因组DNA，用SmaI酶切DNA，使用用于同源交换的含有eryK基因的1.7kb的片段作为探针进行Southern杂交，鉴定其基因型。理论分析整合前基因组的基因型为PermK＊-eryK+PermA＊-eryG，整合后基因型为PermK＊-eryK+PermE＊-eryK+PermA＊-eryG(如图8A所示)。杂交后结果如图8B所示，出发菌株和重组菌株与理论分析整合前后的片段大小比较，完全一致，证明ermE*-eryK结构的基因已经整合到红霉素生产菌S.erythraeaHL3168E3中。Southern鉴定获得其基因型为PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G，命名为重组菌S.erythraea ZL1001。
实施例5红霉素的摇瓶发酵 红霉素工业生产菌株HL3168E3和它的重组菌株在斜面培养基[/L10g玉米淀粉，10ml玉米浆，3g氯化钠，3g硫酸铵，5g碳酸钙，pH 7.0，2g琼脂粉](重组菌培养时在培养基中加入适当的抗生素)34℃培养7天生长孢子，作为液体发酵的种子。
液体发酵时，从斜面培养基上取1cm2大小方块接入50ml发酵种子培养基[/L50g玉米淀粉，18g黄豆饼粉，13ml玉米浆，3g氯化钠，1.2g硫酸铵，1.2g硝酸铵，5ml豆油，6g碳酸钙，pH 6.8～7.0]，在34℃，250rpm培养2天。然后将5ml的种子培养液转接到50ml发酵培养基[/L40g玉米淀粉，30g黄豆饼粉，30g糊精，2g硫酸铵，10ml豆油，6g碳酸钙，pH自然]，在34℃，250rpm培养6天。接种24小时后补加0.5ml的正丙醇。
实施例6红霉素发酵液产物抽提 在100ml烧杯中，准确量取适量发酵液以NaOH调pH至8.9。若样品冰冻，应融化后混合均匀定量转移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均匀，8000～9000离心10min。
取25ml上述溶液于125ml分液漏斗中，加25ml正己烷，震荡5min，收集水相(下层)于离心管中，用水洗涤己烷层2次后，水相与离心管水相混合，加入10ml氯仿，激烈震荡5min，2500离心5min，依样品情况，可能会在界面形成乳状液，可用玻棒分散或再次离心，弃水相，将氯仿(下层)移至10ml的小瓶中，浓缩。
实施例7红霉素发酵液生物效价测定 取直径约90mm，高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层，另取培养基适量加热融化后，放冷至48-50℃，加入短小芽孢杆菌菌悬液适量，摇匀，在每一双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为上层含菌层。放置水平台上冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管(内径6.0mm±0.1mm，高1.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm)四个，用瓦盖覆盖备用。将样品分成高低两个浓度以磷酸缓冲液进行适当稀释后加入牛津杯。高低浓度的稀释倍数为2∶1或4∶1，二剂量法标准溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18-22mm以内，抗生素浓度范围为5-20单位/ml。37℃培养14-16小时后，测量抑菌圈大小。
[稀释缓冲液磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g加水至1000ml，过滤，115℃灭菌30min。pH＝7.8 效价的计算 标准品(S)试验品(T)AT是T的估计效价效价PT 生物检定将T和其S在相同的试验条件下同时对生物或离体器官等的作用进行比较，通过对比计算出它们的等反应效呈比值(R)，以测得T的效价PT R是S和T的等反应剂呈(dS，dT)的比值，即R＝dS/dT M是S和T的对数等反应剂呈(XS，XT)之差，即M＝lgdS-lgdT＝XS-XT R＝antilgM PT是通过检定测得T的效价含量，称T的测得效价，是将效价比值(R)用T的估计效价AT校正之后而得，即 PT＝AT*R 或试验品效价＝Q＊估计效价 Q＝log-1[(T2+T1-S2-S1)＊I/(T2+S2-T1-S1) I为高剂呈与低剂呈之比，I为4∶1时logI＝0.6021 2∶1时logI＝0.3010 S2高剂呈标准品的抑菌圈半径 S1低剂呈标准品的抑菌圈半径 T2高剂呈试验品的抑菌圈半径 T1低剂呈试验品的抑菌圈半径] 实施例8红霉素发酵液的色-质谱分析 样品分析前加入适当的流动相，超声助溶，进样20μl。
组分的分析采用HPLC检测 色谱柱NUCLEOSIL 100-5CN(250×4.6mm，Ser.No.6105322，MACHEREY-NAGEL Inc.，Germany)。
流动相69％A相(32mM potassium phosphate buffer，pH8.0)，31％B相(acetonitrile/methanol75/25)。
检测条件流速1ml/min，UV检测波长215nm，在Agilent 1100HPLCsystem(Agilent Technologies.Palo Alto，CA)上分析时间为50分钟。
组分的鉴定采用LC-MS检测 色谱柱Microsorb-MV C 18(250×4.6mm，Part No.281505，VARIAN Inc.，American)。
流动相62％A相(30mM ammonium acetate，pH4.8)，38％B相(acetonitrile)。
检测条件流速1ml/min，UV检测波长215nm，在LCMS-2010A(LiquidChromatograph Mass Spectrometer，SHIMADZU，JP)上分析时间为30分钟。
Er-A，Er-B和Er-C分子离子峰分别为m/z＝734.2，m/z＝718.3and m/z＝720.3，与对应的分子式C37H67NO13，C37H67NO12and C36H65O13一致。
实施例9核酸分子杂交 1)DIG DNA标记将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL 0.8MEDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL 4M LiCl混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于-80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μL TE((pH 8.0)中。
2)DIG DNA探针标记后的质量检测稀释经1)标记得到的DNA探针，至以下六个梯度，1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。稀释标记的对照DNA至以下浓度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分别取1μL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据6)所述步骤进行显色反应，对比标记的DNA探针和对照DNA的显色强度以决定所标记的DNA探针浓度。
3)Southern杂交的膜转移DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适当距离，做好标记。浸泡于400mL 0.25M HCl中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗三次。取一张每边都比凝胶大1mm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标记。采用向上毛细管转移方法，用10×SSC转移缓冲液转移8-24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分钟。
4)预杂交和杂交预热杂交液(20mL/100cm2)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm2)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。
5)杂交后严紧洗脱室温下用2×SSC/0.1％SDS漂洗两次，每次5分钟。68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。
6)显色反应和检测严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween 20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10％的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于70％DMF，浓度为70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μL NBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。
权利要求
1.一种基因工程构建的重组质粒，由载体和在多克隆位点加入一个含有红霉素启动子ErmE*为m个，大环骨架上碳12位羟基化酶EryK为n个，碳霉糖甲基化酶EryG为k个组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，其特征在于，所述的红霉素启动子，羟基化酶和甲基化酶之间的组合，具有如下所示的结构
(X)m-(Y)n-(Z)kI
其中，X为红霉素启动子ErmE*，所述的红霉素启动子具有如下的核苷酸序列
TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA；
Y为红霉素生物合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶EryK，具有如下的核苷酸序列
CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG；
Z为红霉素碳霉糖甲基化酶EryG，具有如下的核苷酸序列
GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG；
其中m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4。
2.一种如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征是所述的组合为(X)1-(Y)1或(X)1-(Y)1-(Z)1或(X)1-(Y)2-(Z)1或(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1的结构。
3.一种如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征是所述的载体为pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152及其类似的载体。
4.一种如权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，通过下述(1)、(2)或(3)三种步骤分别获得
(1)，以红霉素生产菌株S.erythraea HL3168E3的基因组为模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的编码序列，得到1.7kb的PCR产物，将其置于PermE*启动子下，通过酶切位点克隆到载体中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)0结构的重组质粒；
(2)，以红霉素生产菌株S.erythraea HL3168E3的基因组为模板，采用引物5’-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3’克隆eryK基因的编码序列，得到1.3kb的PCR产物，其中不包含eryK基因下游自身含有的终止序列；同样地，采用引物5’-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’and 5’-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3’克隆eryG基因的编码序列，得到1.5kb的PCR产物，将eryK-G的拷贝置于PermE*启动子下，通过酶切位点克隆到载体中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)1结构的重组质粒；或
(3)，将上述(2)得到的eryK基因PCR产物和eryG基因PCR产物，通过酶切位点克隆到载体中，得到两种不同顺序拷贝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分别置于PermE*启动子下，再导入载体中，得到含有(X)1-(Y)2-(Z)1结构或含有(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1结构的重组质粒。
5.一种如权利要求1或2所述的重组质粒用于红霉素生产菌种的遗传改造。
6.如权利要求5所述的重组质粒的用途，其特征是所述的红霉素产生菌含有如权利要求1所述的载体；或它的基因组中整合有额外的如权利要求1所述数目的羟基化酶，甲基化酶和红霉素启动子。
全文摘要
本发明公开了一种基因工程构建的重组质粒，以及该重组质粒的构建方法和该质粒在红霉素产生菌遗传改造上的应用。重组质粒由载体和在多克隆位点加入一个含有红霉素启动子，大环骨架上碳12位羟基化酶，碳霉糖甲基化酶组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等类似的载体；所述的组合，主要特征是含有红霉素启动子(ErmE*)为m个，羟基化酶(EryK)为n个，甲基化酶(EryG)为k个，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它们可以任意搭配组合。使用这样的重组质粒对红霉素产生菌进行遗传改造，可以明显改善组分，甚至获得只产生有效单一组分的生产菌种。
文档编号C12N15/80GK101285073SQ20071017370
公开日2008年10月15日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者文 刘, 张嗣良, 云 陈, 玮 邓 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 华东理工大学