可灌注的微脉管体系的制造方法

专利名称：可灌注的微脉管体系的制造方法
技术领域：
本发明关于一种用于研究生理的和病理的脉管生长以及响应脉管生成 因子或抗脉管生成因子的脉管生长的方法。
背景技术：
在正常的脉管的生长过程中(例如，月经周期，胎盘形成，发胖，伤口 愈合，炎症)，新血管的生成是规律的并最终停止。值得关注的是，脉管生 长的反常是病理学上的一个关键因素。例如，肿瘤的生长、糖尿病性视网膜 病变、关节炎、和牛皮癣涉及直接促成病理状态的脉管的过度增殖。相反， 作为老年个体的特征，脉管生长的削弱危害了伤口的愈合以及由损伤或疾病 致使的局部缺血组织的脉管再生。因此，对指导组装新血管的机理以及启动 和终止血管生长的过程的理解，是控制血管疾病的策略的发展的核心。在新血管的生长过程中(血管生成)，萌芽(sprout)源自血管内皮细胞， 该血管内皮细胞排列成毛细血管和后毛细血管的内腔(lument)-血管系统的最 小分枝。血管生成是一个复杂的、多步骤的过程。尽管公开了数以千计的关 于血管生成的研究，但是，对介导和控制血管生成以及形态发生的细胞机理 了解甚少。由于大部分组织的不透明性，很难在体内实时地观察血管生成萌芽态的具体情况。很难在三维空间重建组织切片，且无法与血管生长的动态性质相 联系。此外，很难在组织切片中发现接近血管生成萌芽的尖端的区域(控制
血管浸润(vascular hwasion)和形态发生的关键区域)。为了克服传统组织学的 局限性，开发出了各种体内的和体外的血管生成模型。
体内的血管生成模型为了克服活体组织的不透明性，研究者通过活体 动物体内的"窗户"或专门的观察腔来观察血管生成，所述动物体内的"窗 户"包括两栖类幼虫的天然透明的尾巴(Clark and Clark 1939)，所述专门的 观察腔或者植入在兔子耳朵、老鼠的皮肤(Algire,Chalkleyetal， 1945)和仓鼠 颊袋(Greenblatt and Shubi 1968)中，或者所述专门的观察腔发育自兔角膜囊 袋(Gimbrone, Cotran et al. 1974)或鸡胚绒毛尿囊膜(Ausprunk， Knighton et aU974)。从这些早期的、大量描述性的研究中，得出了对肿瘤诱导的血管 化学趋向性的中心范例的验证，以及能促进血管生长的可扩散的源自肿瘤的 分子相关发现。体内血管生成的新实验，检测了血管向聚合海绵体或基本植 入至啮齿动物的凝胶基底膜蛋白栓塞中的向内生长(Passaniti Taylor et al. 1992; Andrade， Machado et al. 1997; Akhtar, Dickerson et al. 2002; Koike, Vernon et al. 2003)。由于下述原因，体内的方法难以实施(l)血管生成反 应中动物至动物的种内变化；(2)缺乏从一个物种到另一个物种的结果转译； (3)购买和饲养动物的花费高；(4)公众不赞成以研究为目的使用动物； 以及(5)在动物手术和可视化方面以及结果的评估上遇到的复杂性。
体外血管生成的二维(2D)模型在努力了解血管生成的分子力学的过 程中，将从较大的血管中分离出的内皮细胞置于平板培养皿中培养，直至它 们形成汇合的(confluent)、类似路面的单细胞层，该单细胞层模拟了血管内 皮细胞的内衬(lining)(Jaffe， Nachman et al. 1973; Gimbrone 1976)。尽管作为响 应大血管中内皮损伤的增生性模型是有用的(Gimbrone， Cotran et al. 1974; Fishman, Ryan et al. 1975; Madri and Stenn 1982; Madri and Pratt 1986; Jozaki，Maruchaetal. 1990;Rosen，Meromsky etal. 19卯)，但是，在模拟血管生成的 过程中，在刚性基质上培养的内皮细胞的单层细胞并不典型地组织成毛细血 管样的管。在1980年，在成功地长期培养毛细管内皮细胞后(Folkman， Haudenschildetal 1979)，据报道，培养牛或人类内皮细胞20-40天后，在汇 合的单层细胞的顶部形成二维的细胞网络，这个过程被称为"体外血管生成" (Folkman， Haudenschild et al 1980)。出现了看起来像填充有纤维状/无定形 物质的"管"和"内腔"的内皮细胞网络，被认为是内源合成的轴芯网络， 细胞在轴芯上形成。后续的研究报道了类似的二维网络的形成，该二维网络 是由源自大血管的内皮细胞(Maciag， Kadish et al. 1982; Madri 1982; Feder， Mamsa et al. 1983)和接种在具有延展性的基质膜蛋白的水凝胶上的内皮细胞 形成的(e.g. Matrigel gel)(Kubota， Kleiman et al. 1988)。尽管脉管发展的二维模型仍沿用至今(基于Matrigd⑧的分析(Kubota, Kkinman et al. 1988)是可商用的)，该模型不具有真正的血管生成的以下5个 特点1、 浸润(invasion) -二维模型中的内皮细胞在细胞外基质的顶部形成网 络并显示出很小的进入细胞外基质的倾向(Vernon， Angeilo et al. 1992， Vernon, Laraetal. 1995)。2、 方向性-在二维模型中，在体外形成的内皮细胞网络或多或少的同时 遍及预定位细胞的区域，然而体内血管生成包括通过多级分枝使纤维状萌芽 分叉而引起的细胞外基质的矢量浸润。3、 正确的极性-尽管二维模型使单细胞管与毛细管非常类似(Maciag, Kadish et al. 1982; Feder， Marasa et al. 1983; Sage and Vernon 1994)，但是，它 们的极性是"由内向外的"，即，他们将基底膜物质沉积在它们的内腔表面， 并且使它们的凝血酶原表面向外面向周围的培养基(Maciag， Kadish et al. 1982; Feder， Marasa et al. 1983)-与体内的情形相反。4、 内腔形成-二维模型生成具有专属内腔的内皮细胞(EC)管的证据不
足。通常，内皮细胞管具有"内腔"空间，该内腔空间填充有细胞体外基质 (或为外生的或为由细胞合成的)(Maciag， Kadish et al. 1982; Madri 1982; Feder, Marasa et al, 1983; Sage and Vernon 1994; Vemon, Lara et al. 1995)。存在 专属内腔时，专属内腔通常以类似缝隙或由内皮细胞细胞质的厚壁所分隔的 狭窄的圆柱状空间的形式出现-与作为体内典型的毛细管的膨胀的薄壁内皮 细胞管具有显著的不同。
5、 细胞特性-二维模型中的细胞网络通过机械过程生成，该机械过程可 以由非内皮细胞型来实现(Verrton, Angello et al. 1992; Vernon， Lara et al. 1995)。当然，数学建模显示出，任何能够适应具有延展性的二维细胞外基 质的张力的粘附细胞型(或为内源合成的或为提供的(例如Matrigel⑧凝胶)) 均能在最佳条件下生成网络(Manoussaki， Lubkin et al. 1996)。
体外血管生成的三维模型公认的是，在三维细胞外基质中发生的体内 的血管生成己经引导出各种模型，其中，体外的三维细胞外基质凝胶中诱导 萌芽。在早期的三维模型中，内皮细胞分布于形成有芯和管网络的胶原质凝 胶中(Elsdale and Bard 1972)。尽管内皮细胞管显示出正确的极性，但是缺乏 浸润和方向性的特性(内皮细胞被预先植入并最终均匀地分布在细胞外基质 中)。虽然如此，已经证明这个方法在研究内腔形成(Davisand Camarillo 1998) 和内皮细胞对生长因子的响应方面是有用的(Madri, Pratt et al 1988; Merwin. Anderson et al. 1990; Kuzuya and Kinsella 1994; Marx, Perlmutter et al. 1994; Davis and Camarillo 1996》
在一个可供选择的方法中，将l毫米老鼠大动脉片段(环状)植入生成 有分枝的吻合管的三维的血浆凝块中(Nicosia,Tchaoetal. 1982)。源自动脉环 的萌芽显示出类似于血管生成的浸润以及除了极性以外的方向性。利用源自 小鼠(mt)的动脉环或源自大鼠(mice)的微脉管片段的移植模型，已经被用于研究肿瘤、生长因子、各种细胞外基质载体、和血管生成的成熟条件方面的影响(Nicosia, Tchao et al. 1983; Mori， Sadahira et al. 1988; Nicosia and Ottinetti 1990; Nicosia, Bonanno et al. 1992; Villaschi and Nicosia 1993; Nicosia, Bonanno et al. 1994; Nicosia, Nicosia et al， 1994; Nicosia and Tuszynski 1994; Hoying. Boswell et al. 19%; Arthur, Vernon et al. 1998)。各种现存的模型诱导纯化的内皮细胞(如单细胞层或集合体)萌芽浸润 至细胞外基质凝胶的基层或周围(Montesano and Orci 1985; P印per, Montesano et al. 1991; Montesano, Pepper et al. 1993; Nehls and Drenckhahn 1995; Nehls and Herrmann 1996; Vernon and Sage 1999; Vernon and Gooden 2002)。每一种模型都具有特殊的局限性，包括很难用肉眼观察萌芽形成、 受限制的萌芽、需要切片、或者缺乏特定类型的内皮细胞的效力。Wolverine禾tl Gulec公开了一中三维血管生成体系(US2002/0150879 Al)，包括将肿瘤组织片段植入基质中。所述微脉管的向外生长可以被特征 化，以分析所述组织的脉管生成潜能。但是，这个方法不能提供微脉管的内 腔灌注。Neumann (本方法的发明人)等，在2003年公开了在体外(包括在人工 组织中)生成可灌注的微脉管是可能的。Neumann等人在2003年教导，使 用127微米的尼龙钓鱼线作为用于制造微脉管的轴芯，该轴芯被收縮管材夹 持。由小鼠的动脉平滑肌细胞制造的脉管被植入到琼脂中。这些微脉管具有 试探性的性质，并不适合于人类血管移植。体外血管生成的新方法体外脉管生成的二维模型不能确定前述列出的 血管生成的定义特征，然而，现有的三维模型重建了其中一些或多数的特征。 重要的是，现今的三维模型中没有一个模型能重建包括受压的、流动的循环 流体的原始脉管。所以，现有的三维模型中没有一个模型能够进行关于内腔 压力和流体对脉管生长和形态生成的贡献方面的研究。本发明克服了现有的血管生成模型的局限性，通过将用于在三维体外细
胞基质(ECM)中生成浸润的、管状的微血管萌芽的经验证的方法与用于构 建作为内腔流动源头的组织工程化原始脉管的新方法相结合。通过灌注液， 调节血管生成的化合物能够被提供给内皮细胞的内腔表面，已知特定的靶受 体被定位在所述内腔表面。营养介质内腔流体的存在将会充分地增加体外毛 细管的存活时间。公开的血管生成体系能够被用于评估各种实验性参数，包 括缺氧/氧过量、特定的可溶性生物活性化合物的测试、经过基因修饰细胞的 使用，以及经病毒转染的基因传递。该体系还可以用于与损伤修复，老化， 癌症，与动脉粥样硬化相关的血管生成的研究。重要的是，本发明教导的下 述模型可以适用于提供能够应用于生物工程化的人工组织的供功能齐全的 脉管体系。
本发明还提供了新的方法，该方法包括用于生成微脉管、从内皮细胞中 生成微脉管、以及生成大血管(例如，具有冠状动脉大小的血管)的多种设 计。这些和其它重要的新方法包括，例如， 一种生成微脉管网络的方法，该 方法是以下述说明书和权利要求书的描述为依据的。

发明内容
一种在体外生成可灌注的微脉管网络的方法，该方法包括下述步骤 通过在一组轴芯上以及轴芯的周围培养细胞，在体外生成至少一个原始 脉管；
将至少一个原始脉管植入到基质中；
诱导至少一个原始脉管，以在基质中生成萌芽； 取出一组轴芯；并且
对所述至少一个原始脉管和萌芽进行内腔灌注，以模拟从毛细管床的动 脉末端到静脉末端的自然血流，以生成微脉管网络。


图1A、图1B和图1C示意性地描述了根据本发明方法的原始脉管生成 的例子；
图2A、图2B、图2C和图2D示意性地描述了根据本发明方法的已知 的热收縮过程(heat-shrink process)的例子；
图3A示意性地描述了用于安装本发明方法所用的培养/灌注的设备的设 计图3B示意性地描述了用于安装本发明方法所用的培养/灌注的设备的制 备方法的设计图4A和图4B示意性地描述了用于本发明方法所用的培养/灌注的设备 的多支管的制造；
图5A、图5B和图5C示意性地描述了根据本发明方法构建的微装配的
培养/灌注的设备的可选择性设计图6示意性地描述了根据本发明方法的细胞接种程序；
图7示意性地描述了根据本发明方法的两个生物型人工原始脉管之间的 毛细管网络；
图8A示意性地描述了根据本发明方法的在体外接种平滑肌细胞后的多 个轴芯的图例；
图8B示意性地描述了根据本发明的方法制备的灌注的肌板(muscle plate)。
具体实施例方式
这里介绍的实例的目的是为了进一步了解本发明。这些实例用于解释本 发明，而本发明并不仅限于这些实例性的实施方式。本发明的方法对生理学 和病理学的血管生长和响应脉管生成因子或抗脉管生成因子的血管生长的研究是有用的。针对于该方法的其它有益的应用为评估潜在的癌组织的血管 生成和响应抗血管生成的药物的方法。此外，本发明的方法可以被应用于构 建各种创伤愈合设备以及用于组织工程化的血管形成。
在一个实例中，公开了 一种用于制造可灌注的三维微脉管网络的方法和
设备。在这里用"EC"代表内皮细胞，用"SME"代表平滑肌细胞，用"CAS" 代表冠状动脉替代物。
一般来说，用于培养和灌注微脉管网络的设备由可在中心处容纳一个或 多个轴芯的腔室构成(如图1所示)。该腔室能够通过使用某些技术由任何 生物相容性的材料制得，例如，形成夹层的激光切割框架。轴芯被装在腔室 中，这样它们是可回收的。这可以通过将轴芯的端部固定在管中来实现，例 如，通过热收縮(如图2所示)。轴芯的直径取决于期望的脉管管径。改变 设置以适应单个脉管、两个脉管、或直至整组的二维或三维脉管。轴芯可以 是各种材料，例如，聚合纤维、玻璃纤维、线材等。
通过将细胞接种在轴芯上，刺激细胞在轴芯周围繁殖，当细胞形成管壁 后取出轴芯，从而获得微脉管。脉管随后被植入基质中。根据培养的条件、 基质的组成、以及血管生成刺激的存在(例如，生长因子)，原始脉管将萌 芽并进入周围的基质中。萌芽将会相互连接而形成毛细管网络。在除去轴芯 后，将设备连接到灌注系统上，向脉管中注入内腔液体流。
现在参考图1A、图1B和图1C，图中示意性的描述了根据本发明的方 法制造原始脉管的例子。图1A显示了在培养生长基100上的内皮细胞1， 被接种在轴芯2上，轴芯2由设备主体3中的收縮管4支撑。图1B显示了 细胞1的增殖并形成细胞套筒102的形式的环状层。图1C显示了取出轴芯 2后，在细胞外基质(ECM)凝胶110中的细胞套筒被灌注培养生长培养基 100。本发明包括对用于组织工程化应用和研究模型可灌注生物人工脉管结 构进行工程化。本发明的一般原理包括在环绕可去除轴芯的周围培养细胞，
15所述轴芯被紧固在薄壁管或其它固定物上。 一旦细胞层达到期望的壁厚度，
将取出轴芯，并在灌注系统的帮助下向由此制造的生物型人工血管(BAVs)
中灌注培养基、血液、血液替代物、或其它流体。本发明的方法可以用于生 产大规模制造的或常规生成的血管、体外可灌注的血管生成模型、创伤愈合 设备、组织成分、整个组织和器官、以及研究模型。 培养/灌注的设备的制造
现在参考图2A，图2B，图2C和图2D，图中示意性地描述了用于本发 明的一个具体实施方式
的已知的热收縮方法的例子。特别如图2A所示，每 个培养/灌注的设备(CPD)可以包括一个或多个被支撑在框架12上的轴芯 2。轴芯2的直径为期望的脉管口径，轴芯2的末端与医药级收縮管片段4 紧密配合。轴芯2可以包括生物相容性纤维(例如，聚合物纤维、玻璃纤维)、 线材、或等同物，取决于待模拟的脉管尺寸，轴芯2的直径为几微米到几毫 米。
更详细的描述如图2B所示，每个收缩管片段4的中间部位14在一个轴 芯2的周围被热收縮。随后，特别如图2C所示，轴芯2收縮，管被切断。 图2D示出了重置轴芯之后的位置，这样轴芯的两端被封闭在现在被切断的 和分离的收縮管片段4中。可以使用各种材料和工艺构建框架12。可以改变 设置以适应单独的生物型人工脉管或多组生物型人工脉管。同样地，通过将 多组轴芯分层放置，通过脉管网络可以生成具有一定厚度的、可灌注的组织。
灌注腔室的制造
现在参考图3A， 一个已知的用于灌注多个轴芯/收縮管集合11的设备。 框架20可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾压制成。分配腔室30可以包括 在设计中，这样可以允许同时灌注多个人工生物型人工脉管。包括轴芯2的 一套线程(thread)的末端被收集在硅管23中。
聚酯膜框架的激光切割现在参考图3B，示意性地描述了用于安装本发明方法所用的培养/灌注 的设备的制造方法的新设计。单脉管设计，CPD70，可以便利地通过将轴芯 2夹在中间而生成，所述轴芯2通过热收縮管4被支撑在两个激光切割的 Myla^ (聚酯膜)框架22之间。 一个环状的环氧多支管21 ，它的构成将在 下面说明，可以方便地用于支撑轴芯/收缩管集合11。
将轴芯/收縮管集合夹在两个聚酯膜(例如Mylar^)等的框架之间，并 将粘合剂一侧加压，这样每个轴芯通过在端部的两个收縮管片段4'悬挂在 框架窗口76中。两个收縮管4'通过内含的至少一根细的稳固线材26被稳 定并加固在框架22中，并被封装在圆柱形的环氧多支管中，该环氧多支管 是通过使用硅树脂管的模具，环绕着收縮管和至少一根细的稳固线材26而 铸成的。收縮管片段4，最后将变成CPD70的流入口和流出口。
现在参考图4A和图4B，示意性地描述了一种用于根据本发明方法的设 备的多支管的制造方法。图4A特别显示了多个收縮管/轴芯集合11通过套 管(例如，硅胶管50)被拉出。环氧胶水40被注入并填充在硅胶管50中并 使它硬化。
图4B特别示出了环氧胶水40变硬后以及硅胶管50被切开并被移开的 情况。剩下的是变硬的环氧棒44。当轴芯收縮到切割点的后时，环氧棒44 被切断，留下由收縮管形成的腔道42。多个收縮管的端部46可以被整合， 以形成多支管21。可以使用单个的CPDs或CPD框架集合的叠加来生成三 维脉管阵列。
可选择的方法
现在参考附图5A、图5B和图5C，示意性地描述了根据本发明的方法 的用于微组装的培养/灌注设备的可选择的设计图。图5A特别示出了通过小 的穿孔54将一套轴芯2引入框架，小的穿孔具有套筒56，它们作为收縮管 的替代物。图5B特别示出了细胞接种前的CPD，包括安装在框架壁52上的一套轴芯2。
图5C特别示出了一个替换实例，该实例为具有脉管62的培养/灌注的 设备，框架52外的微组装多支管64可以被套在套管56上。如这里所示， 脉管62在轴芯上生长，并在轴芯被移除后而被保留下来。微组装的方法(例 如微成型)可以用于这样的CPD框架集合的大规模生产。
脉管制造和灌注
现在参考图6，这里示意性地描述了根据本发明方法的细胞接种程序。 为了制备用于细胞接种的CPDs 70，首先对它们进行清洗并用紫外光灭菌。 在无菌条件下，CPDs被固定在表面，例如彼得里(Petri)盘72的底部。随 后在CPD框架集合70的内部窗口 76 (如图3B所示)中填充溶液，该溶液 含有附着蛋白，例如层粘连蛋白-1。根据需要，可以使用一个或多个衬垫 (spacer)77。在培育期后，将含有附着蛋白的溶液除去，将培养基中含有的期 望类型的细胞悬浮液转移至CPD70的窗口 76中。
通过将一定体积的细胞悬浮液填充在窗口 76中来完成细胞接种，翻转 CPD框架集合70使它的上部向下，因此产生了悬滴(hanging droplet) 80。 在大约为45分钟的培育期内，大量细胞将附着在位于CPD框架集合中的轴 芯/收縮管集合集上。过量的细胞将沉入在悬滴的端部，并可以很容易的被收 集和除去。彼得里(Petri)盘，包括一个或多个CPD框架集合，然后回到 朝上的位置，填充培养基直到CPD框架集合被浸没，并进行培养。在一个 实例中的培养条件包括环境中(302含量为5%，温度为37"C。附着在轴芯 /收縮管集合上的细胞，将向外延伸并增殖，形成同轴的单细胞层(例如内皮 细胞)或150微米或更厚的多细胞层(例如平滑肌细胞)。
达到期望的壁形状或厚度时，取出轴芯从而制得空心细胞管。较薄的壁 需要通过在取出轴芯前在细胞套管的周围涂覆凝胶(例如，琼脂糖、胶原蛋 白、凝胶基底膜蛋白等等)进行保护，以防止破裂。然后将CPD框架集合的多支管连接到灌注系统上，通过可选择的流体进行灌注，例如生长培养基。 在本发明的另一个具体实施方式
中， 一种由人脉管的内皮细胞
(HUVEC)生成内皮原始脉管的方法，该方法包括下述步骤，其中-
首先清洗培养设备，并用紫外光从各个侧面照射灭菌30分钟。在无菌 条件下，将设备固定在具有无菌条(sterilestrip)的彼得里(Petri)盘的底部。
然后，用粘连蛋白-1的附着蛋白溶液填充设备的内部窗口 (可用其它的 附着蛋白，例如纤维连接蛋白、纤维蛋白或凝胶代替)。
培养过夜后，除去含有附着蛋白的溶液，并将培养基中的人脉管内皮细 胞的悬浮液转移至设备的窗口中。
翻转彼得里(Petri)盘使上部向下，在设备的窗口中产生了细胞-培养基 悬浮液的悬滴。45分钟后，在培育期内的细胞培养箱中(C02含量为5X， 温度为37°C)，大量细胞将附着到设备中的轴芯/收缩管集合上。
然后将彼得里(Petri)盘回转到朝上的位置，在其中填充用于人脉管内 皮细胞的生长培养基，直到设备被浸没。
未附着在轴芯上的细胞将落下并被送出和除去。
然后将彼得里(Petri)盘放置在培育箱(C02含量为5%，温度为37°C) 中。附着在轴芯上的细胞将向外扩散并增殖，形成同轴的人脉管内皮细胞的 单细胞层。
除去彼得里(Petri)盘中的培养基。在培养设备的窗口中装入胶原蛋白 溶液并使其硬化，从而使轴芯嵌入在细胞层中。
人脉管内皮细胞将向胶原蛋白凝胶中形成萌芽。轴芯被慢慢地取出，留 下可灌注的人脉管内皮细胞的原始微脉管。
然后，将设备的多支管连接到灌注系统，并用人脉管内皮细胞生长培养 基进行灌注。
灌注系统CPDS可以安装在线性模式或循环模式的灌注系统上。线性设置可以由 重力流系统形成，或者由可商购的或常规构建的注射泵形成。在注射器中装
满灌注培养基并安装在注射器泵上，通过不漏气的管材与上游的CPDs连接。 CPDs可以储存在设置在CPD中的培养箱中，所述培养箱处于无菌态或具有 无菌的细胞培养环境。将CPDs的下游多支管连接到收集灌注液的蓄水池的 末端。可以通过使用蠕动泵构建循环系统。线性系统和循环系统均可以被固 定在气体交换设备上。气体的浓度、灌注的压力、流程、温度、和营养物及 代谢副产物的浓度可通过传感器进行测量。所收集的数据进入反馈回路，以 严格控制所需的参数。
用于与血管生成相关研究的模型
现在参考图7，图7示意性地描述了根据本发明方法的在两个生物型人 工原始脉管200， 202之间的毛细管网络。通过减少流体f流入"静脉"原 始脉管202，并增加施加在"动脉"原始脉管200上的阻力R，使在流动的 灌注液204通过毛细管206的改变路径，从而，驱动灌注液204从具有较高 压力的脉管进入具有较低压力的脉管，以模拟从毛细管床的动脉端到静脉端 的自然血流。
轴芯法也可以用于血管生成研究模型的开发，作为用于药学实验以及在 伤口愈合、衰老、和疾病(如癌症、糖尿病、关节炎、和牛皮癣)的研究上 的需要。只采用内皮细胞，或者内皮细胞、平滑肌细胞、和周细胞(pericytes) 的结合，能够环绕微米直径的轴芯来培养原始生物型人工微血管(BMVs)， 并植入到细胞外基质的凝胶载体中。然后将轴芯取出，留下位于细胞外基质 凝胶210 (胶原质凝胶，基底膜基质(BMMs)或其它)中的原始内皮细胞 管。轴芯的取出可以手动完成，或者借助于具有从极慢到极快的速度变化的 自动化设备。其它变化可以包括在冷冻状态下从生物型人工微血管中取出轴 芯；用热反应聚合物涂覆轴芯；或牵拉轴芯的任一端，使它变细直至断裂。原始脉管向凝胶210中的萌芽可以被化合物所诱导，例如，碱性纤维原 细胞生长因子(bFGF)、动脉内压生长因子(VEGF)、和佛波12-肉豆蔻酸 -13-酯(PMA)，它们被加入到凝胶和/或灌注液(例如生长培养基)中。
可以通过在两个相邻的原始人工微脉管间形成压力差来制造复杂的毛 细管网络222，从而模拟动脉和静脉血流。液体流将从"动脉"生物型人工 脉管中改变路径，通过相互连接的萌芽进入"静脉"生物型人工微脉管。
所述灌注液可以含有含氧的细胞生长培养基、无血清培养基、和生成脉 管的物质或抑制脉管生成的物质。在另一个实例中，所述灌注液可以是补充 有血清和/或影响脉管生成的化合物的含氧的细胞生长培养基。而在另一个具 体实施方式中，所述灌注液可以是含氧的生理盐溶液。在另一个实例中，所 述灌注液可以包括含氧血液、血液组分、或血液替代品。在另一个具体实施 方式中，所述灌注液可以不是含氧通过基质的扩散而获得氧化体系。而在另 一个具体实施方式
中，可以在灌注液中加入生成脉管的化合物或抑制脉管生 成的化合物。
在一个具体实施方式
中，在所述基质中加入生成脉管的化合物或抑制脉 管生成的化合物等。而在另一个具体实施方式
中，所述细胞包括基因修饰的 细胞，该基因修饰的细胞能够向灌注液中或基质中释放产物。而在另一个具 体实施方式中，所述基质可以优选含有纤维蛋白、胶原质、和凝胶。 一种可 用的基质为Matrige俾凝胶。在另一个具体实施方式
中，所述基质可以包括琼 脂、琼脂糖、藻酸盐或硅胶。
在另一个具体实施方式
中，所述细胞可以选自由内皮细胞、平滑肌细胞、 周细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、干细胞和基因修饰的细胞所组成的 组中。所述基质可以使选自由人细胞、动物细胞、和植物细胞所组成的组中 的细胞繁殖，或者使它们扩散至整个基质中，或者使它们在局部集中。在一 些情况下，健康的或病态的组织的片段(例如癌组织)被植入到基质中。源自原始脉管的萌芽可以在体外以切片材料或整装制片的形式进行显 微研究。使用荧光溶液(例如，荧光右旋糖酐)的生物型人工微脉管的灌注，有助于对萌芽直径、萌芽内腔的开放、和吻合(anastomization)的程度进行分 析。萌芽形态的三维重建可以通过将由共焦显微镜得到的荧光图像的z轴重 叠来实现。通过萌芽220的细胞外周基底膜基质的合成，可以通过使用抗层 粘连蛋白的免疫标签以及IV型胶原的第一抗体和荧光或过氧化物酶标记的 第二抗体以整装的形式和组织(石蜡)切片的形式进行监控。在复合的EC/SMC萌芽中，可以通过使用人CD31(克隆P2Bl-Chemicon 公司)的FITC单克隆抗体或FITC-UEA 1凝集素(一种用于人类内皮细胞 的特殊标记物)标记内皮细胞，对两种细胞型之间的空间关系进行检测。可 以用人的(x-SM肌动蛋白的单克隆抗体并随后用RITC抗鼠第二抗体对平滑 肌细胞进行标记。内腔结构的细节以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的相互作 用，可以从用前述的试剂标记的石蜡切片中获得。所描述的构建方法是用于商业大规模生产的具有高重复性的血管生成 设备的基础。经过适当的保存(例如，冷冻保存)，研究人员能够以现货的 方式买到预先生长的原始脉管或整个毛细管网络。冠状动脉的替代品为了制造冠状动脉的替代品，挑选具有一定外径的轴芯来制备冠状动脉 替代品，该冠状动脉替代品具有内径约为4-5.5毫米的血管内腔。做为选择， 所述轴芯可以是空心管，可以被灌注且它的渗透性足以满足在冠状动脉的替 代品的生长期间的营养物质和气体的交换。冠状动脉的替代品可以只由平滑 肌细胞生长得到，因此，生成的结构类似于血管中的中膜层，或作为两种或 三种细胞型的复合结构。将平滑肌细胞接种在轴芯上，并生长至300-400微米的环形层。为了加 速冠状动脉的生成，可以下述方式操纵SMC表型在初始的生长阶段，使细胞进入高度增殖的表型；然后在脉管壁达到期望的厚度后转化成不同的状
态。表型的转化将导致平滑肌细胞的生长速率被显著地减缓，并诱导细胞外 基质蛋白质的产生，例如胶原质和弹性蛋白，这些蛋白对正确的脉管机械性 能是必需的。可以通过控制确定的基因的表达来获得表型的转换。例如，四 环素反应启动子的帮助下，基因表达(例如弹性蛋白)受到抑制直到管壁达 到期望的厚度。从生长培养基中除去四环素，可以激活插入的基因。弹性蛋 白的过度表达，将进一步抑制细胞的增殖以及管壁内的实施结构和信号功 能。机械调节，例如，动脉流可以用于加固冠状动脉替代品，并诱导细胞的
生理定位(physiological alignment)。也可以使用其它外部或内部的"表型转 化"。
在取出轴芯后或在平滑肌细胞的调整和重建后，可以直接将内皮细胞接 种在SMC套管上。内皮细胞的接种可以通过将内皮细胞悬浮液灌注到SMC 套管中来完成。然后使流动停止一段时间，以使内皮细胞附着。
如果需要，为了使内皮细胞更容易分散，可以旋转血管或重复的上下轻 弹血管。
选择性地，可以先将内皮细胞接种在轴芯上。在这种情况下，平滑肌细 胞被接种在汇合的内皮细胞层上。使用这个方法，有必要的是防止内皮细胞 向富含氧气和养分的冠状动脉代替品的外围迁移。
如果期望，纤维原细胞在SMC套管外侧的接种能够形成外膜层。
用于形成冠状动脉替代品的细胞可以源自自体同源的、异源的、或异种 的材料。所述细胞可以是干细胞、前体细胞、或分化细胞。所述细胞可以进 行基因修饰，以获得特定的表型或对宿主生物体的低免疫响应。
本发明的方法提供了用于大规模生产可现货供应的血管替代品或血管 替代品的选择，所述替代品通常是为受体所设计的。本发明的方法还适用于 组织工程化的冠状动脉替代品模型的开发、动脉粥样硬化的研究、血管的生成，不同的血管细胞型之间的相互作用以及与细胞外基质组分的相互作用的 研究、 一氧化氮效应的研究、和各种药品的研究。 不同大小或类型的血管和淋巴管本发明的方法还可以用于制造除冠状动脉以外的其它直径和类型的血 管。轴芯直径的改变将改变脉管的直径。根据细胞表型，和/或细胞增殖被抑 制的时间点，可以改变脉管的种类(动脉、静脉、淋巴)。例如，静脉只含 有小的平滑肌细胞层。其它类管状组织本发明的方法可以被用于工程化的其它管状组织，例如胆管、泪管、鼓胀咽管(pharyngotympanytube)、输卵管、输精管、输尿管、尿道等。本发明 的方法用于从包括胶质细胞在内的不同类型的细胞中生成神经导管，并指导 神经网络的生成和修复。用于工程化组织的BAV系统本发明的方法可以用于使用作为骨架的可去除的轴芯阵列的组织和器 官的工程化。将期望的组织/器官(肌肉、肝脏、肾脏、肺、皮肤等)的细胞 接种到涂覆有附着蛋白的轴芯上。这些轴芯可由固体纤维或线材制成，或选 择性的由可灌注的、具有渗透性的管制成，例如纤维素。所述轴芯以一定的 间距相互分离，所述间隔允许单细胞套管的并入。使用这个方法可以生成片 状或块状的组织。然后取出轴芯(或不同的去除方法)，生物型人工组织通 过辅助的灌注系统进行内部灌注。伤口愈合设备预制的生物型人工脉管体系可以用于帮助伤口愈合，例如糖尿病人的慢 性溃烂。生物型人工毛细管网络可以被植入片状的载体材料中(例如从富含 脉管生成因子的细胞外基质凝胶中)，并放置在伤口处。用含氧的营养液进 行自主灌注，生物型人工脉管将会促进供体脉管系统和皮肤的萌芽。选择性地，这样的生物型人工脉管修复片段可以夹在伤口和皮肤移植物之间，并促 进移植物的向内生长。 基因治疗设备
生物型人工脉管可以用于植入式给药设备。从病人体内取得的细胞，能 够在体外进行基因修饰以生成特定的蛋白(激素，酶等)。使用上述方法， 这些细胞可以生长成生物型人工脉管或脉管网络。重新灌注到宿主中，细胞 继续产生目标物质并将它释放到局部或全身。
人工组织和器官
如上所述，组织工程化的脉管网络可以用于组织或乃至整个器官的制 造。 一个方法是一个或多个体外可灌注的原始脉管的制造。从期望的组织或 器官中得到的基质细胞被接种在原始脉管的周围，例如，在凝胶中。通过原 始脉管给基质细胞供应养分和氧气。随着基质细胞的增殖，养分和氧气的需 求量将增加。细胞释放脉管生成因子，并刺激脉管萌芽。作为组织生长-非 常类似于自然生长，脉管体系以相同的速率萌芽。因此，这个体系也将是一 个用于发育生物学研究的良好模型。
另一个方法利用平行排列的轴芯作为基质细胞的骨架。随着基质细胞的 增殖，细胞层环绕轴芯而形成。最终，所有轴芯之间的空间被基质细胞所充 满，生成了片状组织。在取出轴芯后，组织可以通过在轴芯处留下的通道进 行灌注。通过内腔接种，通道能够变成内皮状。该方法不限于在二维空间中 使用。或者堆积多个片状组织，或者使用三维骨架。本发明的发明人使用了 用于肌肉组织的工程化的二维阵列和三维阵列。
而在另一个方法中，能够独立地生成组织层和脉管网络层，然后间歇地 进行堆砌。所有的这些方法或者能够生成具有一种或两种细胞型的简单模 型，或者能够生成含有多个细胞型的复合构型。
在灌注时，用这些方法构建的工程化的组织或器官或者能直接与血流连接，或者通过灌注系统保持灌注直到宿主脉管系统生长进入移植物中。 可灌注的组织工程化肌肉的构建实例现在参考图8A，描述了根据本发明方法的在体外接种平滑肌细胞后的多个轴芯的图片。多个轴芯与收缩管单元M被夹持在Mylar⑧框架中。轴芯 M之间的距离可以调整到约100微米。所有收縮管片段的末端结合在一个上 游多支管和一个下游多支管中(图中未示出)。Mylar⑧框架是经过消毒的， 内腔被覆盖并使用每毫升5乂106个的鼠动脉平滑肌细胞SM(RASMCs)的悬 浮液进行接种。所述SM细胞吸附在每个单独的轴芯M上并被增殖，因而 形成了环状层。IO天后，独立的层结合到一起并最终形成了平滑肌细胞的薄 片或薄盘。在生长培养基中再放置7天，并向培养基中补充50U/毫升的肝磷 脂，并再培养7天。然后，取出所有的轴芯，并用肝磷脂培养基以10毫升/ 天的速度对组织进行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝磷脂培养基的100 毫米Petri盘的底部。持续对SMC盘进行灌注11天。灌注时间结束后，通 道CH的功能仍被保留，并在体外清晰可见(如图8B所示)。现在参考图8B，描述了采用本发明的方法制得的可灌注肌板MP的实 例。所示的可灌注的流体通过管道末端(T)进入由除去的轴芯留下的通道 (CH)中。本发明在这里所描述的相当多的细节是为了遵守专利法，并为本领域技 术人员实施本发明的新原理而提供信息，并构建和使用所需要的这些示例性 的和专门的组分。但是，应该理解的是，本发明可以通过不同的专用设备和 置以及构建法则进行实施，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以实 施如具体设备和操作程序在内的各种改变。说明书中所引用的所有参考文献的全文在此一并引入作为参考。如果发 生其他方面的不可调和的冲突，本说明书将会控制。参考文献
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权利要求
1、一种在体外生成可灌注的微脉管网络的方法，该方法包括下述步骤通过在一组轴芯(2)上以及轴芯的周围培养细胞(1)，在体外生成至少一个原始脉管(200)；将所述至少一个原始脉管(200)植入到基质中；诱导所述至少一个原始脉管(200)，以在所述基质中生成萌芽(220)；取出所述一组轴芯(2)；并且对所述至少一个原始脉管(200)和萌芽进行内腔灌注，以模拟从毛细管床的动脉末端到静脉末端的自然血流，以生成微脉管网络。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述生成至少一个原始脉管(200) 的步骤生成了两个或多个原始脉管，所述萌芽吻合并形成毛细管网络。
3、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述生成至少一个原始脉管(200) 的步骤还包括生成多维排列的可灌注的脉管。
4、 根据权利要求1所述的方法，其中，灌注液(204)含有含氧的细胞 生长培养基，不含有血清以及生成脉管的物质或抑制脉管生成的物质。
5、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括使用灌注液(204)，该灌注液含有含氧的细 胞生长培养基，该灌注液补充有血清、和/或对脉管生成起作用的化合物。
6、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括使用含氧的生理盐溶液进行灌注。
7、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200)和萌芽进行内腔灌注的步骤包括使用含氧的血液、血液成分或血液替代品进 行灌注。
8、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括使用无氧的灌注液(204)进行灌注，并通 过所述基质的扩散实现系统的氧合作用。
9、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括将生成脉管的化合物和抑制脉管生成的化 合物中的至少一种添加到灌注液(204)中。
10、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括将生成脉管的化合物和抑制脉管生成的化 合物中的至少一种添加到所述基质中。
11、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞包括基因修饰的细胞， 该基因修饰的细胞能将产物释放到灌注液(204)或所述基质中。
12、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质含有选自由纤维蛋白、 胶原质、凝胶、凝胶化的基底膜、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、基底膜蛋白质、 硅胶、和它们的组合所组成的组中的材料。
13、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞选自由内皮细胞、平 滑肌细胞、周细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、干细胞、和基因修饰的 细胞所组成的组中。
14、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质填充有细胞，该细胞 选自由通过基质分散的或局部浓縮的人细胞、动物细胞、和植物细胞所组成 的组中。
15、 根据权利要求1所述的方法，其中，健康组织或病态组织的片段被 植入到所述基质中。
16、 根据权利要求1所述的方法，其中，癌组织的片段被植入到所述基 质中。
17、 根据权利要求1所述的方法，其中，通过减少流入静脉原始脉管(202) 中的流量并增加人工原始脉管(200)中的阻力，流动的灌注液(204)通过 毛细管(206)而改变通路，以驱动灌注液(204)从具有较高压力的脉管流 入具有较低压力的脉管。
18、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述微脉管网络包括选自生物 人工微脉管、原始内皮细胞管、和平滑肌细胞管中的一种。
19、 根据权利要求l的方法，其中，所述微脉管网络包括能够向灌注液 (204)中释放因子的正常细胞或基因修饰的细胞。
20、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对至少一个原始脉管(200) 和萌芽进行内腔灌注的步骤包括使用正常细胞或基因修饰的细胞，以向灌注 液(204)中释放因子。
21、 一种在体外由人脉管内皮细胞生成内皮原始脉管的方法，该方法包括下述步骤对具有内部窗口的培养设备进行清洗和消毒；在无菌条件下将所述培养设备固定在具有无菌条的容器的底部；用附着蛋白的溶液填充所述内部窗口 ；培养完成后，除去含有附着蛋白的溶液；将培养基中的人脉管内皮细胞悬浮液转移至所述窗口中；在所述培养设备的窗口中生成细胞培养基悬浮液的悬滴；将容器回转到朝上的位置，并在该容器中填充用于人脉管内皮细胞的生 长培养基，直到所述培养设备被浸没；将所述容器放置在培养箱中直到吸附到轴芯(2)上的细胞扩散并增殖，形成同轴的单层人脉管内皮细胞； 除去培养基；用胶原质溶液填充所述窗口，使该胶原质溶液固化，从而植入具有细胞 层的轴芯；缓慢的取出所述轴芯，留下人脉管内皮细胞的可灌注的原始微脉管，该 可灌注的原始微脉管萌芽至胶原质凝胶中；和 用人脉管内皮细胞生长培养基进行灌注。
22、 根据权利要求21所述的方法，其中，所述附着蛋白的溶液选自由 层粘连蛋白-1、纤维连接蛋白、纤维蛋白和凝胶所组成的组中。
23、 一种生成组织的方法，该方法包括下述步骤 在框架上并置多个轴芯(2)，其中，该多个轴芯(2)之间基本平行且间隔有预先确定的距离，并且该多个轴芯(2)中的每一个轴芯的两端均由 管支撑；将所有管的末端结合在一个上游多支管和一个下游多支管中；对所述框架进行消毒；对所述框架进行涂敷；使用细胞悬浮液对所述框架进行接种；使附着在每个轴芯上的细胞增殖并形成环形层直到个体层结合成组织； 将所述组织置于生长培养基中； 取出所述轴芯(2);和 用灌注液(204)灌注所述组织。
24、 根据权利要求23所述的方法，其中，所述灌注液含有肝磷脂。
25、 根据权利要求23所述的方法，其中，所述细胞选自由人平滑肌细 胞、内皮细胞、基质细胞、和人脉管内皮细胞所组成的组中。
26、 一种在体外生成人冠状动脉替代品的方法，该方法包括下述步骤 通过在体外培养人平滑肌细胞，在尺寸适于形成人冠状动脉的轴芯之上和周围生成细胞管；将所述细胞管植入至基质中； 取出所述轴芯；和 对所述细胞管进行内腔灌注。
27、 根据权利要求26所述的方法，其中，所述细胞管包括内腔表面， 该方法还包括通过在培养基中进行接种，用内皮细胞对内腔表面进行涂敷的 步骤。
28、 根据权利要求26所述的方法，其中，所述细胞管包括外表面，该方法还包括通过在培养基中进行接种，用成纤维细胞对外表面进行涂敷的步 骤。
29、根据权利要求26所述的方法，其中，所述轴芯的尺寸适于形成内 腔直径为4-5.5毫米的细胞管。
全文摘要
在体外由组织工程化的原始脉管(200，202)制造微血管网络，所述组织工程化的原始脉管萌芽至细胞外基质蛋白的支撑基质中，例如凝胶。微血管系统集成在能够进行可控的流体灌注的设备中。所述血管可以包括源自一种细胞型的细胞如内皮细胞，或源自两种或三种细胞型的组合。
文档编号C12M3/02GK101410507SQ200780010627
公开日2009年4月15日 申请日期2007年3月9日 优先权日2006年3月24日
发明者T·纽曼 申请人:诺荑思公司