专利名称：一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植物病毒检测方法，特别涉及一种同时检测香 蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法。
背景技术：
香蕉是我国南方重要的经济作物，但病毒病一直是制约其可持续
发展的主要因素之一，尤其是香蕉束顶病毒(力朋a朋》〃加Ar力w ia/77/s， BBTV)引起的香蕉束顶病和由黄瓜花叶病毒(cwcw/^ermosaic w>m， CMV)引起的香蕉花叶心腐病是香蕉生产中发生最为普遍和严 重的二个病害。由于目前我国南方香蕉种植种苗以组培苗为主，为了 防止大田香蕉病毒病的发生和蔓延，确保香蕉组培苗不带病毒是整个 香蕉产业无病毒生产中的最为重要的一环，加强对组培苗早期病毒的 检测，就能够从源头上有效地控制病毒的扩散，确保香蕉大田生产的 安全，同时也能保证国外对我国香蕉组培苗出境的检疫要求，因此对 香蕉苗病毒的检测技术和方法就成为了病毒控制的关键点。本文根据 在对广东省中山市香蕉种植基地病毒普査的基础上，研究和探索了比 较适合基层实际检测侵染香蕉的二种最主要的病毒检测的技术和方 法。
目前香蕉病毒病一直是我国香蕉生产和香蕉组培苗出境的主要 限制因素之一，而对香蕉种苗特别是对香蕉组培苗的病毒早期检测已 经成为控制香蕉病毒病发生蔓延和保障其顺利出境的非常有效的措施。香蕉束顶病毒(BBTV)和香蕉花叶心腐病毒(CMV)是侵染我国 香蕉的两个最主要的病毒，而且它们经常复合侵染。检测它们的常用 方法是用酶联免疫吸附试验法(ELISA)，但香蕉种苗特别是组培苗， 由于植株幼小，体内病毒含量很低，用ELISA的方法会常常会出现漏 检和误检的情况；而分子生物学的方法特别是PCR方法，其灵敏度要 比ELISA方法高1000倍以上，非常适合检测低浓度病毒的样品。已 经有许多文献报道用PCR的方法来检测香蕉苗的病毒。但是它们都是 针对单个病毒来检测，虽然彭军等在《园艺学报报》也报道了用多重 PCR来检测BBTV和CMV,但也是分别提取DNA和RNA，然后又对CMV 单独反转录再与BBTV的样品机械混合，最后进行PCR检测，不但操 作程序复杂，而且容易造成样品交叉污染。
因此，现有用于检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法有 待于进一步改善。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种方法 简单，只需通过一次检测就能同时检测出香蕉束顶病毒和花叶心腐病 毒，有效减少样品交叉污染，检测效率高且准确的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案
一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法，其特征 在于包括以下步骤 (1)、香蕉病叶总核酸的提取
a、分别剪取感染BBTV、 CMV和复合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼叶O. lg;
b、 在液氮(一196。C)下研磨成粉末状，迅速加入900uL经过 65。C预热的CTAB抽提缓冲液，转入2mL的离心管中，65*€水浴30min， 期间不时摇匀；
c、 加入900nLl氯仿/异戊醇(V:V/24:1)，温和地摇匀，室温 下用小型台式离心机12000rpm离心8min;
d、 将上清液转到新的2mL离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2.5X体积冰冷的无水乙醇，一2(TC放置2hr，然后在 4。C下12000rpm离心10min;
e、 弃上清液，用400uL无RNase的70%的乙醇将RNA振荡悬 浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解，再次离心10min以沉淀RNA， 小心倒掉上清液，随后快速离心5s，将管壁上的乙醇收集到管底后， 用小枪头吸净，置于超净台上吹5min左右，最后用50 ii L DEPC水溶 解沉淀，一2(TC贮存备用；
(2)、 RT-PCR扩增 反应引物
BBTV引物BBTV-Pl : 5' -ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3'
BBTV-P2 : 5' -GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3'
扩增产物为748bp; CMV引物CMV-Pl: 5， -CACCCMCCTTTGTGGGTAG-3，
CMV-P2: 5' -CMCACTGCCAACTCAGCTC-3'
扩增产物为557bp;在0. 2mL的薄壁PCR管中分别加入去离子水3. 5 u L、 2Xbuffer 12. 5 ii L、扩增酶混合液1 y L、扩增BBTV和CMV基因片段的上、下 游引物(P1， P2)各1 u L (10 u mol/L)、香蕉病叶总核酸1 li L(O. 5 n g)， 混合均匀后，进行一步法RT-PCR扩增，并以从健康无病毒侵染的香 蕉叶片中提取的总核酸为阴性对照；其中RT-PCR扩增过程50°C 30min， 94。C3min;然后94。Clmin， 52。Clniin， 72。Clmin，共35个
循环； (3)、电泳分析
取5uL反应产物在用1XTAE缓冲液配制的1%的琼脂糖凝胶上 进行电泳分析。
如上所述的一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测 方法，其中步骤(l)中所述的CTAB抽提缓冲液为0.1M的 Tris-HCl(p朋.O) ; 0.02M的EDTA(pH8.0); 1.4M的NaCl; 2%的 CTAB (W/V)和0. 2%的P —巯基乙醇的组合物。
本发明使用的部分材料的原产地
1、 香蕉感病材料采自广东省中山市香蕉种植基地；
2、 RT-PCR试剂盒PrimeScript"^One—St印Ver. 2.0 :购自宝生
物工程(大连)有限公司，
3、 反转录酶、Taq酶、CTAB(Cetyltriethyl ammonium bromide)、 Trizol RNA提取试剂及其它生物试剂均购自广州普博生物科技有限 公司。
综上所述，本发明的有益效果(1)、本发明检测方法采用2.5X的无水乙醇代替通常在CTAB 方法中使用的异丙醇来沉淀总核酸，既可以得到总DNA，也得到了完 整的总RNA。以此总核酸为模板，并结合使用RT-PCR—步法试剂盒， 即可以单独检测CMV、也可以单独检测BBTV，更可以同时检测出这两 种病毒。
(2 )、本发明RT-PCR是将反转录RT与PCR反应在同一管中进行， 这样不但可以减少样品之间的交叉污染，还由于整个RT的反应产物 都用作PCR的模板，使得检测灵敏度更为提高，而且可以提高检测效 率。
(3)本发明能一次性提取样品总核酸和进行一次性RT-PCR检 测，可以检出单个的或复合的这两种病毒，从而大大的提高了检测效 率，并避免了人为混合DNA和RNA核酸样品所造成的不必要的污染， 是香蕉病毒检测的一个实用且准确快速的方法。
图l为本发明的检测结果图。
其中，M: 100bp DNA marker; 1:阴性对照；2: CMV PCR检测； 3:BBTVPCR检测；4: CMV、 BBTV同时PCR检领!l; 5:香蕉病叶总DNA; 6:香蕉病叶总核酸。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明做进一步描述 实施例1
本发明一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法包括以下步骤
(1)、香蕉病叶总核酸的提取
分别剪取感染BBTV、 CMV和复合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼 叶0. lg;在液氮(一196。C)下研磨成粉末状，迅速加入900uL经 过65i:预热的CTAB抽提缓冲液，转入2mL的离心管中，65"C水浴 30min，期间不时摇匀；加入900u Ll氯仿/异戊醇(V:V/24:1)，温 和地摇匀，室温下用小型台式离心机12000rpm离心8min;将上清液 转到新的2mL离心管中，加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5. 2)和2. 5 X体积冰冷的无水乙醇，一2(TC放置2hr，然后在4-C下12000rpm离 心10min;弃上清液，用400p L无RNase的70%的乙醇将RNA振荡 悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解，再次离心10min以沉淀 RNA，小心倒掉上清，随后快速离心5s，将管壁上的乙醇收集到管底 后，用小枪头吸净，置于超净台上吹5min左右，最后用50pLDEPC 水溶解沉淀，一2(TC贮存备用； (2)、 RT-PCR扩增
在0. 2mL的薄壁PCR管中分别加入去离子水3. 5u L、 2Xbuffer 12.5iiL、扩增酶混合液luL、扩增BBTV和CMV基因片段的上、下 游引物(Pl， P2)各1 u L (10 p mol/L)、香蕉病叶总核酸1 p L(O, 5 u g)， 混合均匀后，进行一步法RT-PCR扩增，并以从健康无病毒侵染的香 蕉叶片中提取的总核酸为阴性对照；其中RT-PCR扩增过程50°C 30min， 94。C3min;然后94。Clmin， 52。Clmin， 72。Clmin，共35个 循环；其中BBTV和CMV基因片段的上、下游引物分别为BBTV引物BBTV-PI : 5， -ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3， BBTV-P2 : 5' -GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3'
CMV引物CMV-PI: 5， -CACCCAACCTTTGTGGGTAG-3' CMV-P2: 5， -CMCACTGCCMCTCAGCTC-3，； (3)、电泳分析
取5u L反应产物在用1XTAE缓冲液配制的1%的琼脂糖凝胶上 进行电泳分析。
分析结果如图1所示，当用常规CTAB法提取香蕉病叶总DNA时， 结果显示一条完整的23kb植物总DNA，如第5电泳带；而使用本发 明方法提取相同的香蕉样品叶片，结果显示除了完整的23kb植物总 DNA外，还包含有完整的28S和18S rRNA条带，说明该样品中不仅 含有完整的DNA，而且还有完整的总RNA，如第6电泳带。以此总核 酸为模板，当只有CMV引物时，可以扩增出CMV的557bp特异带，如 第2电泳带；而只加入BBTV引物时，也能扩增出其748bP的特异带， 如第3电泳带；当同时加入CMV和BBTV引物时，在相同的反应条件 下，可以同时扩增出它们的特异带，如第4电泳带；而阴性对照没有 任何条带，如第1电泳带。
由此可见，本发明检测方法能快速准确的通过一次检测就能同时 检测出香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒。
权利要求
1、一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)、香蕉病叶总核酸的提取a、分别剪取感染BBTV、CMV和复合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼叶0.1g；b、在液氮(-196℃)下研磨成粉末状，迅速加入900μL经过65℃预热的CTAB抽提缓冲液，转入2mL的离心管中，65℃水浴30min，期间不时摇匀；c、加入900μLl氯仿/异戊醇(V∶V/24∶1)，温和地摇匀，室温下用小型台式离心机12000rpm离心8min；d、将上清液转到新的2mL离心管中，加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)和2.5×体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置2hr，然后在4℃下12000rpm离心10min；e、弃上清液，用400μL无RNase的70％的乙醇将RNA振荡悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解，再次离心10min以沉淀RNA，小心倒掉上清液，随后快速离心5s，将管壁上的乙醇收集到管底后，用小枪头吸净，置于超净台上吹5min左右，最后用50μL DEPC水溶解沉淀，-20℃贮存备用；(2)、RT-PCR扩增反应引物BBTV引物BBTV-P15’-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3’BBTV-P25’-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3’CMV引物CMV-P15’-CACCCAACCTTTGTGGGTAG-3’CMV-P25’-CAACACTGCCAACTCAGCTC-3’在0.2mL的薄壁PCR管中分别加入去离子水3.5μL、2×buffer12.5μL、扩增酶混合液1μL、扩增BBTV和CMV基因片段的上、下游引物(P1，P2)各1μL(10μmol/L)、香蕉病叶总核酸1μL(0.5μg)，混合均匀后，进行一步法RT-PCR扩增，并以从健康无病毒侵染的香蕉叶片中提取的总核酸为阴性对照；其中RT-PCR扩增过程50℃30min，94℃3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，共35个循环；(3)、电泳分析取5μL反应产物在用1×TAE缓冲液配制的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
2、根据权利要求1所述的一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心 腐病毒的检测方法，其中步骤(l)中所述的CTAB抽提缓冲液为0. 1M 的Tris-HCl(pH8.0); 0. 02M的EDTA(pH8. 0); 1.4M的NaCl; 2%的 CTAB (W/V)和0. 2%的P —巯基乙醇的组合物。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)香蕉病叶总核酸的提取；(2)RT-PCR扩增和(3)电泳分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种方法简单，只需通过一次检测就能同时检测出香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒，有效减少样品交叉污染，检测效率高且准确的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101561415SQ20081002759
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者杨雷亮, 宏 王, 王云华, 王章根, 王龙贵, 维 管, 陈定虎 申请人:陈定虎;王龙贵;杨雷亮