专利名称：检测香蕉束顶病毒的pcr试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的测定或检验所用的组合物及其检测方法，特别涉及一种可用于检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒及如何利用该试剂盒检测香蕉束顶病毒。
背景技术：
香蕉束顶病是香蕉种植过程的常发病，其田间发病率一般为3-5％，严重的可达30-50％，甚至达到80％以上，严重影响香蕉的产量。
为了减少这种病害，一般要在培养香蕉试管苗时先对病毒进行检测，然后对有毒种苗进行脱毒，最后才将脱除病毒的试管苗进行大量繁殖。
目前对香蕉束顶病毒(简称BBTV)的检测以酶联免疫吸附检测(简称ELISA)法为主，该检测方法存在如下缺点检测过程易出现假阳性反应；对病毒含量低的病株检测效果不理想，即检测灵敏度低；更为重要的是，作为ELISA方法不可缺少的试剂，香蕉束顶病毒的单克隆抗体制备过程复杂，需要较高的技术和设备条件，较难大范围推广使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种用于检测香蕉束顶病毒的灵敏度高、速度快、简便、重复性好的PCR试剂盒及如何利用该试剂盒检测香蕉束顶病毒。
本发明的目的可经如下方案来实现。
检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒，包括引物、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶，其要点在于，其中的上游引物是5’-CTC GTC ATG TGC AAGGTT ATG TCG-3’，下游引物是5’-GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC-3’。
DNA聚合酶链反应(PCR)可以模拟DNA复制反应，通过与特定DNA区域两端互补的寡核苷酸引物，在试管中由DNA聚合酶选择性地复制合成介于两引物之间的DNA片段，因而可以将其量极微的(fgDNA)目的基因在较短的时间内(1-2小时)扩增到极易检测的微克水平。
而通常香蕉束顶病毒在种苗中的含量极其细微，一般的检测方法很难检测到其存在，因而检测灵敏度低，而通过使用配制好的PCR试剂盒，特别是选择适用的引物，可以对香蕉束顶病毒DNA的进行大量复制而便于检测到病毒的存在。
本发明经过多次重复性试验，得出最佳的引物(引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段，通常由人们根据目标DNA的序列人工合成)为5’-CTC GTC ATG TGC AAG GTT ATG TCG-3’及5’-GAA GTT CTC CAG CTATTC ATC GCC-3’，因为它可以扩增出明显的病毒带，且重复性最好、最灵敏，同时它扩增出的是香蕉束顶病毒的一段保守性较高的片段。使用该引物扩增产物的结果见
图1。
通过使用含有该引物的PCR试剂盒进行香蕉束顶病毒的检测具有特异、敏感、简便、重复性好等突出优点，检测香蕉束顶病毒灵敏度很高，经实验可以检测到ELISA检测呈阴性的样品，如下表所示ELISA法对不同稀释度香蕉束顶病毒样品的检测结果
注+号表示阳性带毒，-号表示阴性不带毒而采用本发明提供的PCR试剂盒检测香蕉束顶病毒的灵敏度试验结果如图2所示，其中，1～5分别为病毒粗提液稀释101～105倍后PCR扩增产物电泳结果。
结果表明用ELISA法检测香蕉束顶病毒样品粗汁液时，可以检测到相当于25μg的病组织，而用PCR方法检测不同稀释度的粗提纯病毒液时，可检测到相当于0.1μg香蕉叶组织量的香蕉束顶病毒，也就是说，PCR方法比ELISA方法在检测香蕉束顶病毒时的检测灵敏度要高250倍。
检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒具体包括如下试剂25mM MgCl250μl；2mM dNTPs50μl；10×酶特异性反应缓冲液100μl；3U/μl耐热DNA聚合酶10μl；50pmol引物30μl；香蕉束顶病毒阳性对照20μl；香蕉束顶病毒阴性对照20μl；ddH2O 1ml。
本发明通过配制一种可检测香蕉束顶病毒的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取香蕉样品模板，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测。试剂盒中各组分的用量和浓度均为实验而得，用该试剂盒检测香蕉束顶病毒重现性好，且无需制备类似ELISA法中过程复杂的单克隆抗体，因而还可降低配置设备的成本，同时也提高了香蕉束顶病毒的诊断和试管苗的脱毒检测水平，使香蕉束顶病毒的检测可以更为简便地进行。
使用阳性或阴性对照目的是用于比较扩增产物的电泳结果，以便判断香蕉样品模板是否含有香蕉束顶病毒。若含有香蕉束顶病毒，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照相同位置的条带；若不含有香蕉束顶病毒，则与阴性对照一样不具有条带。
阳性对照样品可以为已确定是香蕉束顶病毒的样品，阴性对照样品则可以是经实验室无菌培养的香蕉样品。
本发明进一步还在于一次检测实验所用试剂盒中的试剂的量为50pmol引物1μl，2mM dNTPs2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2～0.3μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。
耐热DNA聚合酶有多种，常见的有从水生栖热菌YT1菌中分离的Taq聚合酶、从嗜热栖热菌中分离的Tth DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等。本发明主要采用的是Taq DNA聚合酶，一般以Taq聚合酶称之。
本发明进一步还在于提供了一种检测香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其要点在于，包括如下进行的步骤1、提供待测样品；2、在PCR簿壁管中加入dNTPs、MgCl2、10×酶特异性反应缓冲液、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；3、令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；4、在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；
5、分析结果并进行判断。。
提供待测样品可通过现有技术中任何已知的方法进行，例如采用CTAB法来提取。
在检测香蕉束顶病毒的过程中通常需要设一个阳性及阴性对照，阳性及阴性对照的反应方法及反应体系同检测香蕉模板DNA的反应方法及反应体系相同。
阳性对照实验具体步骤如下1、提供阳性模板DNA；2、在PCR簿壁管中加入dNTPs、MgCl2、10×酶特异性反应缓冲液、引物、DNA聚合酶、香蕉束顶病毒样品模板和ddH2O，混匀；3、令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；4、在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果香蕉束顶病毒在349bp处有一条带。
阴性对照实验则只要将阳性对照实验的阳性模板DNA改为阴性模板DNA即可，不合香蕉束顶病毒的样品模板检测结果无条带显示。
检测所使用的引物的上游引物是5’-CTC GTC ATG TGC AAG GTT ATGTCG-3’，下游引物是5’-GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC-3’。
确定适宜的PCR反应循环参数在整个扩增DNA的过程中显得至关重要，它主要包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数。
PCR扩增参数为94℃4min；94℃45sec，55℃45sec，72℃90sec；30个循环；72℃10min。
其中，94℃4min为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程；94℃45sec为变性温度和时间；55℃45sec为复性温度和时间；72℃90sec延伸温度与时间；30个循环为循环次数；而72℃10min则是为稳定扩增产物而进行的温度和时间。
本发明所称待测样品或为香蕉组织，或为香蕉组织DNA。
本发明经多次的重复性实验及采集大量的田间样品进行试验，发现采用如下含量及浓度的组分进行香蕉模板DNA的检测结果与田间所表现的症状是一模一样的，可见该检测方法的检测精度很高。
检测所用试剂的量为50pmol引物1μl，2mM dNTPs2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2～0.3μl，25mMMgCl22μl，余下体积在除去待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
本发明还在于在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果的具体步骤为1、取5～10μl扩增产物与加样缓冲液混合；2、将混合液上样于琼脂糖凝胶上；3、将琼脂糖凝胶85～100V电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA Marker进行对照；4、观察并记录结果。
其中扩增产物与加样缓冲液的体积比为5∶1。
香蕉束顶病毒应在349bp处有一条带。
根据引物设计的结果，扩增出的香蕉束顶病毒片段长度应为349bp，因此若扩增出349bp左右和阳性对照相同位置的条带，则可判断此香蕉模板DNA带有病毒，详见图3，其中，1、2、4为香蕉束顶病阳性样品，检测到病毒带；3、5为香蕉束顶病阴性样品，无病毒带；6、7号分别为阳性及阴性对照。
综上所述，本发明较之现有技术具有如下优点本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，针对该PCR试剂盒所提供的PCR检测方法检测香蕉束顶病毒的灵敏度高、重复性好、可操作性强、简单易行，用PCR方法检测不同稀释度的粗提纯病毒液时，可检测到相当于100ng香蕉叶组织量的香蕉束顶病毒，检测精度高，而检测成本却相对较低。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
最佳实施例一、检测实验所需材料及设备的准备1、试剂盒组成
1)MgCl2(25mM) 50μl2)dNTP(2mM) 50μl3)10×buffer(10×酶特异性反应缓冲液) 100μl4)Taq polymera se(3U/μl)(Taq聚合酶) 10μl5)Primermixture(引物)(50pmol)30μl6)香蕉束顶病毒阳性对照(CK+) 20μl7)香蕉束顶病毒阴性对照(CK-) 20μl8)ddH2O 1ml每个试剂盒可用于检测20个样品。
其中MgCl2、10×buffer、Taq polymerase由华美生物工程公司提供；dNTP由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；Primermixture为根据福建省农业科学院生物技术中心提供的序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；香蕉束顶病毒阳性对照(CK+)、香蕉束顶病毒阴性对照(CK-)、ddH2O由福建省农业科学院生物技术中心制备。
检测所使用的引物的上游引物是5’-CTC GTC ATG TGC AAG GTT ATGTCG-3’，下游引物是5’-GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC-3’。
2、仪器设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量进样器和0.2mlPCR簿壁管。
3、香蕉样品的采集日期地点 受检香蕉数量2000，11 漳州天宝 42000，11 漳蒲郊区 52001，3 漳州南靖 42001.8漳州云霄 52001.8漳州诏安 62002，5 漳州天宝 4
2002，8 漳州天宝12二、检测实施的操作1、提供各地香蕉待测样品，并用CTAB法分别提取各地香蕉组织DNA；2、用微量进样器分别吸取PCR试剂盒中50pmol引物1μl、2mMdNTPs2.5μl、10×buffer 2.5μl、3U/μl Taq聚合酶0.2μl、25mMMgCl22μl，及2.5μl的待测样品到0.2PCR簿壁管中，最后用ddH2O补足至25μl，充分混匀；3、将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增94℃4min；94℃45sec，55℃45sec，72℃90sec；30个循环；72℃10min。
4、在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果1)取5～10μl扩增产物与加样缓冲液按5∶1的比例混合；2)将混合液上样于1.4％琼脂糖凝胶上；3)将琼脂糖凝胶经85～100电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA Marker进行对照；4)观察前沿指示剂迁移至距加样孔至少5cm处，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。
5、依据如下条件进行结果判断香蕉束顶病毒在349bp左右有一条带。
各地待测香蕉样品必须分别依照上述方法进行检测。而检测香蕉束顶病毒的过程中所设阳性及阴性对照的反应方法及反应体系同检测香蕉待测样品的反应方法及反应体系相同。
阳性对照实验具体步骤如下1、提供阳性模板DNA；2、用微量进样器分别吸取PCR试剂盒中50ng/μl引物1μl、2mMdNTPs2.5μl、10×buffer 2.5μl、3U/μl Taq聚合酶0.2μl、25mMMgCl22μl，及2.5μl的阳性模板DNA到0.2PCR簿壁管中，最后用ddH2O补足至25μl，充分混匀；3、将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增94℃4min；94℃45sec，55℃45sec，72℃90sec；30个循环；72℃10min。
4、在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果1)取5～10μl扩增产物与加样缓冲液按5∶1的比例混合；2)将混合液上样于1.4％琼脂糖凝胶上；3)将琼脂糖凝胶经85～100电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA Marker进行对照；4)观察前沿指示剂迁移至距加样孔至少5cm处，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果5、香蕉束顶病毒在349bp左右有一条带。
阴性对照实验则只要将阳性对照实验的阳性模板DNA改为阴性模板DNA即可，不含香蕉束顶病毒的样品模板检测结果无条带显示。
三、检测结果如下表所示用PCR试剂盒检测福建省各地香蕉的结果日期地点 受检香蕉数量 阳性 阴性2000，11 漳州天宝 43 12000，11 漳浦郊区 54 12001，3 南靖 42 22001.8云霄 54 12001.8诏安 65 12002，5 漳州天宝 42 22002，8 漳州天宝 12 0 1权利要求
1.检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒，包括引物、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’-CTC GTC ATG TGC AAG GTTATG TCG-3’，下游引物是5’-GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC-3’。
2.根据权利要求1所述的检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒，其特征在于，包括如下试剂25mM MgCl250μl；2mM dNTPs50μl；10×酶特异性反应缓冲液100μl；3U/μl耐热DNA聚合酶10μl；50pmol引物30μl；香蕉束顶病毒阳性对照20μl；香蕉束顶病毒阴性对照20μl；ddH2O1ml。
3.根据权利要求2所述的检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒，其特征在于，一次检测实验所用试剂盒中的试剂的量为50pmoll引物1μl，2mMdNTPs2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2～0.3μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒，其特征在于，耐热DNA聚合酶为Tap聚合酶。
5.香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括如下进行的步骤；5.1提供待测样品；5.2在PCR簿壁管中加入dNTPs、MgCl2、10×酶特异性反应缓冲液、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；5.3令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；5.4在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；5.5分析结果并进行判断。
6.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，检测所使用的引物的上游引物是5’-CTC GTC ATG TGC AAG GTT ATG TCG-3’，下游引物是5’-GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC-3’。
7.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增参数为94℃4min；94℃45sec，55℃45sec，72℃90sec；30个循环；72℃10min。
8.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，待测样品或为香蕉组织，或为香蕉组织DNA。
9.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，检测所用试剂的量为50pmol引物1μl，2mM dNTPs2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2～0.3μl，25mMMgCl22μl，余下体积在除去待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
10.根据权利要求5所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为10.1取5～10μl扩增产物与加样缓冲液混合；10.2将混合液上样于琼脂糖凝胶上；10.3将琼脂糖凝胶电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNAMarker进行对照；10.4观察并记录结果。
11.根据权利要求5或10所述的香蕉束顶病毒的PCR检测方法，其特征在于，香蕉束顶病毒应在349bp处有一条带。
全文摘要
本发明涉及一种微生物的测定或检验所用的组合物及其检测方法，具体为一种用于检测香蕉束顶病毒的PCR试剂盒及如何利用该试剂盒检测香蕉束顶病毒。该PCR试剂盒包括引物、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5’－CTC GTC ATG TGC AAG GTT ATG TCG－3’，下游引物是5’－GAA GTT CTC CAG CTA TTC ATC GCC－3’。此PCR试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，针对该PCR试剂盒所提供的PCR检测方法检测香蕉束顶病毒的灵敏度高、重复性好、可操作性强、简单易行，用此方法检测不同稀释度的粗提纯病毒液时，可检测到相当于100ng香蕉叶组织量的香蕉束顶病毒，检测精度高，而检测成本却相对较低。
文档编号C12Q1/25GK1506469SQ0214854
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者周莉娟, 郑伟文 申请人:福建省农业科学院生物技术中心