专利名称：CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒,具体来说,特别是涉及到CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒。
背景技术：
毒品快速检测是公安部门、禁毒机构、体育赛事、入伍、入职部门常需要应用的一个检测项目。目前市场上的产品比较单一，生产单位也很局限，胶体金试纸是目前毒品快速检测基本选择，但是胶体金试纸灵敏度不高，存在较高的假阳和假阴性结果，且重复性较低，也无法定量。、毒品检测主要是利用化学的(层析色谱)或者生物的(抗原抗体反应)方法检测人尿液、头发、以及血液中毒品及其代谢物。目前主要有以下几种手段简易试纸检测原理是利用毒品胶体金和尿液中毒品竞争有限的抗体结合位点，主要优点是快速直观、无需设备，缺点是特异性敏感性低、易受其他药物干扰，检测结果仅做參考，阳性样品需要进ー步用化学的方法检测才能确定。气相色谱(GC/MS)检测利用气相层析的方法来检测尿中的毒品，优点是准确灵敏，是目前为止最可靠的方法，缺点是操作复杂，样品需要事先处理，仪器操作要求高、检测时间长、费用高，不适合筛选。ELISA检测原理是利用尿液中的毒品与标记的抗体反应，用相应的仪器进行信号的读取，其中又有多种方法，比如 Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA), enzymesmultiplied immunoassay technique(EMIT)和Kinetic interactionof microparticle insolution (KIMS)，优点是快速，敏感度和特异度都比试纸有显著提高，缺点是仍须进ー步检测确定。以上几种方式都有各自无法克服的缺陷，因此急需一种更价格便宜、简便快速、准确可靠能定量的新的现场检测方式来取代现有的检测方式。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，发明CEDIA ImmunoChip毒品检测
试剂盒。该CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒具体内容如下首先制备酶供体和酶受体的最佳组合，在Cloned Enzyme DonorImmunoassay (CEDIA)技术平台上运用常规的DNA重组技术制备β_半乳糖苷酶(β -galactosidase)的两个片段,大片段为酶受体(Enzyme Acceptor, EA),小片段为酶供体(Enzyme Donor, ED),单独的两个片段均无活性,只有在一定条件下结合后才能显示出相应的酶活性。 其中所述的酶供体是半乳糖苷酶近N端的片段，大小为3(Γ70个氨基酸，相对于酶供体而言，酶受体是缺失相应序列的半乳糖苷酶，大小为94(Γ980个氨基酸。
所述的酶供体上有个别氨基酸将突变使之带有巯基或氨基，目的使酶供体带有疏基或氨基，便干与毒品小分子通过化学键藕联。为获得具有最佳结合和催化效果的一对酶受体和供体，本发明采用高通量的基因和蛋白质工程，进行酶受体和供体库的构建，再将库里的酶受体导入噬菌体，然后通过高通量的噬菌体呈现技术(Phage Display),筛选较佳的结合动力学组合,在这些组合之上再筛选较佳的酶动力学组合，与此同时我们还要考虑到酶受体和供体的稳定性，抗体的竞争效应，最終达到具有结合和酶动力学俱佳的组合。所述免疫芯片(ImmunoChip)技术,将带孔的こ烯薄膜粘合到透明有机玻璃片上，并用化学刻蚀法刻好设计好的“路线”ー预先设计的两个空腔中，将上述的酶供体和酶受体的组合及新型荧光底物及毒品抗体置于免疫芯片中，然后进行冻干处理。使用时，将检测样品(尿液)和缓冲液分别滴在特定的孔中，样品和缓冲液分别流经预先用化学刻蚀技术刻好的“路线”进行混合，反应，最终进入底部透明的检测腔。新型突光底物D-luciferin-ο-β-galactoside在β _半乳糖苷酶作用下分解成 突光素Iuciferin和半乳糖galactoside,突光素Iuciferin在突光素酶Iuciferase的存在下产生荧光信号通过测定荧光信号的強弱就能判断荧光素的含量。当待测样品中的抗原(毒品分子)与供体标记的外源性抗原(毒品分子)竞争结合特异性抗毒品抗体，从而降低体系中供体与受体结合效率，最終表现为β -半乳糖苷酶活性的下降，β -半乳糖苷酶活性的下降直接影响新型荧光底物下分解成荧光素和半乳糖，从而直接体现在信号強弱上，产生的荧光信号用便携式荧光光度计直接检测，得到标准的检测结构。相应的抗毒品分子抗体由现有市场提供。荧光分子使得检测的灵敏度大大提高，对复杂检测仪器的依赖大大降低，样品需要量少(20-50ul)。本发明提供的克隆酶受体免疫检测Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA)技术平台上构建的一种酶受体(EA)和供体(ED)组合，是结合动力学和酶动力学俱佳的组合；同时酶受体和供体的稳定性好，抗体的竞争效应强。毒品检测试剂盒上的免疫芯片的制作方法制作简单，方便携帯；毒品检测试剂盒上的毒品检测定量方法与现有技术相比反应灵敏，准确率高，没有交叉反应，可重复性高，操作简便。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步说明，但并不对本发明造成任何限制。CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于固定有酶供体和酶受体组合的免疫芯片，所述的酶供体与毒品小分子能通过化学键藕联形成酶供体标记的外源性抗原，用于通过CEDIA ImmunoChip毒品检测方法检测待测样品中是否存在能与所述酶供体标记的外源性抗原竞争结合特异性抗毒品抗体，并使用新型荧光底物标定。Cloned Enzyme Donor Immunoassay (CEDIA)技术运用 DNA 重组技术制备 β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)的两个片段,大片段为酶受体(Enzyme Acceptor, EA),小片段为酶供体(Enzyme Donor, ED),单独的两个片段均无活性,在一定条件下结合后才能显示出相应的酶活性。
其中克隆酶受体免疫检测技术系统中采用高通量的基因和蛋白质工程，进行构建最佳的酶受体(EA)和供体(ED)组合酶供体是半乳糖苷酶近N端的片段，大小为50个氨基酸左右，酶受体是缺失相应序列的半乳糖苷酶，大小为960个氨基酸左右。酶供体上个别氨基酸将突变使之带有巯基或氨基，以便于与毒品小分子通过化学键藕联。为获得具有最佳结合和催化效果的一对酶受体和供体，本发明采用高通量的基因和蛋白质工程，进行酶受体和供体库的构建，再将库里的酶受体导入噬菌体，然后通过高通量的噬菌体呈现技术(Phage Display),筛选较佳的结合动力学组合,在这些组合之上再筛选较佳的酶动力学组合，与此同时我们还要考虑到酶受体和供体的稳定性，抗体的竞争效应，最終达到具有结合和酶动力学俱佳的组合。免疫芯片(ImmunoChip)技术,将带孔的こ烯薄膜粘合到透明有机玻璃片上,并用化学刻蚀法刻好设计好的“路线”ー预先设计的两个空腔中，然后进行冻干处理。使用吋，将检测样品(尿液)和缓冲液分别滴在特定的孔中，样品和缓冲液分别流经预先用化学刻蚀 技术刻好的“路线”进行混合，反应，最终进入底部透明的检测腔。在免疫芯片上预先将所述的酶受体和酶供体的最佳组合及特异性毒品抗体固定，加入特异性毒品抗体及新型荧光底物。待测样品中的抗原(毒品分子)与酶供体标记的外源性抗原(毒品分子)竞争结合特异性抗毒品抗体，从而降低体系中供体与受体结合效率，最終表现为酶活性的下降。新型突光底物D-luciferin-o-β-galactoside在β _半乳糖苷酶作用下分解成Iuciferin (突光素)和galactoside (半乳糖)，前者在Iuciferase (突光素酶)的存在下产生荧光信号，通过测定荧光信号的強弱就能判断荧光素的含量，从荧光素的含量可以得知β -半乳糖苷酶的含量，从而推知与毒品抗体结合的供体含量，因待测样品中的毒品分子与供体标记的外源性抗原(毒品分子)竞争结合特异性抗毒品抗体，所以可以推算出待测样品中的毒品含量。荧光分子使得检测的灵敏度大大提高，对复杂检测仪器的依赖大大降低，样品需要量少(20-50ul)。CEDIA检测技术具有操作简便(三步完成，不需洗脱)、时间短(5-10分钟)、灵敏度高、可靠性好、重复性强等特点。高通量筛选具有良好结合和酶活性的酶受体和供体组合是CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒的关键技术之一，免疫芯片设计的合理性和有效性是关键技术之ニ。评判的主要技术指标为(检测试剂盒):I.灵敏度6ng/ml ；2.准确率(以气相色谱/质谱(GC/MS)检测为參照)97. 8% (阳性)，100% (阴性)。3.交叉反应没有明显交叉反应报告。4.重复性99%。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进ー步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，包括固定有酶供体和酶受体组合的免疫芯片， 所述的酶供体与毒品小分子能通过化学键藕联形成酶供体标记的外源性抗原，用于通过 CEDIA ImmunoChip毒品检测方法检测待测样品中是否存在能与所述酶供体标记的外源性 抗原竞争结合特异性抗毒品抗体，并使用新型荧光底物标定。
2.根据权利要求1所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于所述酶受 体和酶供体组合的制备方法为运用常规的DNA重组技术制备P -半乳糖苷酶的两个片段， 大片段为酶受体，小片段为酶供体。
3.根据权利要求1或2所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于所述 酶供体是半乳糖苷酶近N端的片段，大小为30 70个氨基酸，相对于酶供体而言，酶受体 是缺失相应序列的半乳糖苷酶，大小为940 980个氨基酸。
4.根据权利要求3所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒,其特征在于所述酶供 体上有个别氨基酸突变，使酶供体带有疏基或氨基，以便于与毒品小分子通过化学键藕联。
5.根据权利要求4所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒,其特征在于所述 3 -半乳糖苷酶的两个片段单独均无活性，只有在一定条件下结合后才能显示出相应的酶 活性。
6.根据权利要求5所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于将所述的 半乳糖苷酶的两个片段——酶供体和酶受体，采用高通量的基因和蛋白质工程，进行酶受体和供体库的构建，再将库里的酶受体导入噬菌体，通过高通量的噬菌体呈现技术，筛选 较佳的结合动力学组合，在这些组合之上再筛选较佳的酶动力学组合，筛选的同时考虑酶 受体和供体的稳定性，抗体的竞争效应，得到具有结合动力学和酶动力学俱佳的组合。
7.根据权利要求1所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于所述免疫 芯片是将带孔的乙烯薄膜粘合到透明玻璃片上，用化学刻蚀法刻好设计的路线，然后进行 冻干处理。
8.根据权利要求1所述的CEDIAImmunoChip毒品检测试剂盒，其特征在于所述的新 型荧光底物标定其方法为，待测样品在免疫芯片上检验时，新型荧光底物在3 -半乳糖苷 酶作用下分解成荧光素和半乳糖，荧光素在荧光素酶的存在下产生荧光信号，用便携式荧 光光度计直接根据荧光信号强弱来进行待测物的检测。
全文摘要
毒品快速检测是公安部门、禁毒机构、体育赛事、入伍、入职部门常需要应用的一个检测项目，胶体金试纸是目前毒品快速检测基本选择，但是胶体金试纸灵敏度不高，存在较高的假阳和假阴性结果，且重复性较低，也无法定量。本发明描述了CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒，包括固定有酶供体和酶受体组合的免疫芯片，所述的酶供体与毒品小分子能通过化学键藕联形成酶供体标记的外源性抗原，用于通过CEDIA ImmunoChip毒品检测方法检测待测样品中是否存在能与所述酶供体标记的外源性抗原竞争结合特异性抗毒品抗体，并使用新型荧光底物标定。其反应灵敏，准确率高，没有交叉反应，可重复性高，操作简便。
文档编号G01N33/558GK102662057SQ20121018532
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者马军 申请人:广州易航生物科技有限公司