专利名称：嗜水气单胞菌的pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的测定或检验所用的组合物及其检测方法，特别涉及一种可用于检测嗜水气单胞菌的PCR试剂盒及如何利用该试剂盒检测嗜水气单胞菌。
背景技术：
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属弧菌科气单胞菌属，是鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类的致病菌，该菌也是中华鳖、鳗鱼等高价值的水产动物暴发性传染病的主要病原，该菌产生的毒素会导致动物腐皮、穿孔、溃疡、出血、败血等综合症状，从而间接导致人类腹泻。
为了减少或防止这种病害，一般要对易发病动物进行嗜水气单胞菌的检测，以便对已感染病菌的动物进行隔离和治疗，或者可以通过检测确定病因。
目前对嗜水气单胞菌的检测以常规生物学检测方法为主，该检测方法存在如下缺点检测过程较多的出现假阳性、假阴性情况；生化检测操作过程复杂，检测周期长，通常需要两到三天才能检测完一次待测样品；生化检测通常需要将待测菌株经较长时间的培养才能进行检测；生化检测需要较高的技术和设备条件，检测成本高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种用于检测嗜水气单胞菌的灵敏度高、速度快、简便、准确、检测周期短的PCR试剂盒及如何利用该试剂盒检测嗜水气单胞菌的存在。
本发明的目的可经如下方案来实现。
嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其要点在于，其中的上游引物是5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’，下游引物是5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’。
DNA聚合酶链反应(PCR)可以模拟DNA复制反应，通过与特定DNA区域两端互补的寡核苷酸引物，在试管中由DNA聚合酶选择性地复制合成介于两引物之间的DNA片段。PCR反应目前是人们用于获得目标基因的常用方法。
根据科学研究表明致病力与其产生的溶血素、内毒素、溶胞素、气溶素和细胞毒素等多种具有生物活性的毒素有关。通过对已感染动物的血液生化和内脏细胞超微结构的分析，得出了如下结论该菌产生的毒素是导致动物腐皮、穿孔、溃疡、出血、败血等综合症状的重要原因。在这些毒性因子中，气溶素(aerolysin)被认为是最具致病性的毒素，它由一个多肽链(54-kDa的毒素前体)和一个位于氨基末端的肽组成。在结合到真核细胞的专一受体后，该毒素即集聚成六聚体，并插入细胞的类脂双分子层，形成3纳米的通道。
引物对5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’和5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’就是根据气溶素前肽基因的碱基排列顺序设计合成的寡核苷酸引物，它位于基因序列上645-664和834-853位置。该引物可在试管中由DNA聚合酶选择性地复制合成介于两引物之间的DNA片段(针对嗜水气单胞菌为209bp靶DNA片段)，因而可以将其量极微的(fgDNA)目的基因在较短的时间内(1-2小时)扩增到极易检测的微克水平。
实验表明使用本发明所提供的PCR检测试剂盒检测嗜水气单胞菌，一般只需要三到四小时就可对一组的待检测样品进行检测，检测周期缩短了，检测速度加快了，同时，PCR检测方法只需要待测样品中含有10个左右的嗜水气单胞菌菌体就可检测得到它的存在。这样，克服了常规生化检测检测周期太长、不适应市场检测需要等缺点。并且采用PCR检测方法同普通生化检测方法对比可排除假阳性反应，检测灵敏度提高了，避免了因检测的失误而导致的不必要损失。
本发明还在于嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒包括如下试剂25mM MgCl250μl；2mM dNTP50μl；10×酶特异性反应缓冲液100μl；3U/μl耐热DNA聚合酶10μl；引物30μl；嗜水气单胞菌阳性对照20μl；嗜水气单胞菌阴性对照20μl；ddH2O 1ml。
本发明通过配制一种可检测嗜水气单胞菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测。试剂盒中各组分的用量和浓度均为实验所得，用该试剂盒检测嗜水气单胞菌所使用的实验设备简单，检测成本低。
使用阳性或阴性对照目的是用于比较扩增产物的电泳结果，以便判断待测样品是否含有嗜水气单胞菌。若含有嗜水气单胞菌，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照相同位置的条带；若不含有嗜水气单胞菌，则与阴性对照一样不具有这一条带。
本发明进一步讲还在于一次检测实验所用试剂盒中的试剂的量为引物1μl，2mMdNTP2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去1μl待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。
耐热DNA聚合酶有多种，常见的有从水生栖热菌YT1菌中分离的Taq聚合酶、从嗜热栖热菌中分离的Tth DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等。本发明主要采用的是Taq DNA聚合酶，一般以Taq聚合酶称之。
本发明进一步还在于提供了一种嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其要点在于，包括如下进行的步骤1、提供待测样品模板；2、在PCR簿壁管中加入dNTP、MgCl2、10×酶特异性反应缓冲液、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；3、令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；4、在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；
5、分析并进行结果判断。
待测样品模板可以是养殖水体、动物组织破碎样本、动物组织破碎样本DNA、动物组织病原菌、动物组织病原菌DNA、嗜水气单胞菌阳性对照样品和嗜水气单胞菌阴性对照样品。
检测所使用的引物的上游引物是5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’，下游引物是5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’。
确定适宜的PCR反应循环参数在整个扩增DNA的过程中显得至关重要，它主要包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数。
PCR扩增参数为95℃10min 1个循环；94℃2min，55℃2min，72℃1min，35个循环；72℃16min 1个循环。
其中，95℃10min 1个循环为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程；94℃2min为变性温度和时间；55℃2min为复性温度和时间；72℃1min延伸温度与时间；35个循环为变性、复性、延伸的循环次数；而72℃16min循环1次则是为稳定扩增产物而进行的温度和时间。
整个PCR扩增反应结束后在温度4℃保持等待进行琼脂糖凝胶电泳观察。
本发明提供的PCR检测方法每次检测所用试剂的量为引物1μl，2mM dNTP2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl Taq聚合酶0.2μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去1μl待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
本发明针对不同的待测样品提供了不同的提取方法，具体如下第一种针对养殖水体1、吸取待测养殖水体水样；2、涂布水样于培养基上培养；3、从培养基上挑取待测菌落进行离心洗涤；
4、离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板。
第二种针对动物组织病原菌样品1、从动物样本中分离病原菌；2、取少量病原菌于离心管中离心洗涤；3、离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板。
第三种针对动物组织病原菌样品DNA用微量DNA提取试剂盒(Genomic DNA Minipreps Kit)提取动物组织病原菌样品DNA作为模板，该试剂盒在市面上可以购得。
第四种针对动物组织破碎样品取动物样本加缓冲液后研磨破碎，破碎液即为模板；第五种针对动物组织破碎样品DNA取动物样本加缓冲液后研磨破碎，接着从破碎液中用常规方法提取DNA即为模板。
阳性对照样品为已确定是嗜水气单胞菌的样品，阴性对照样品则为经实验室确定为不是嗜水气单胞菌样品，如假单胞菌。
本PCR试剂盒若用嗜水气单胞菌全细胞悬液进行PCR扩增，与经提取的嗜水气单胞菌DNA作为模板扩增所得的结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是动物组织破碎样，或者只需对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。
在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为1、取5～10μl扩增产物与加样缓冲液混合；2、将混合液上样于琼脂糖凝胶上；3、将琼脂糖凝胶电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNAMarker进行对照；4、观察并记录结果。
其中扩增产物与加样缓冲液的体积比为5∶1。
采用本发明所提供的PCR检测方法进行扩增的嗜水气单胞菌应在209bp处有一条带。
根据引物设计的结果，扩增出的嗜水气单胞菌片段长度应为209bp，因此若扩增结果在209bp左右具有和阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有病菌，详见
图1，其中，A为待测样品，检测到病菌带；+阳性对照；-阴性对照，M为DNA marker。
综上所述，本发明较之现有技术具有如下优点本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，针对该PCR试剂盒所提供的PCR检测方法检测嗜水气单胞菌的灵敏度高、检测周期短、速度快、可操作性强、简单易行，该PCR方法检测灵敏度可达10个菌或1ng的模板DNA，检测精度高，而检测成本却相对较低。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
最佳实施例一、检测实验所需材料及设备的准备1、试剂盒组成1)MgCl2(25mM) 50μl2)dNTP(2mM) 50μl3)10×buffer(10×酶特异性反应缓冲液)100μl4)Taq polymerase(3U/μl)(Taq聚合酶) 10μl5)Primer mixture(引物)(50pmol) 30μl6)嗜水气单胞菌阳性对照(CK+)20μl7)嗜水气单胞菌阴性对照(CK-)20μl8)ddH2O 1ml每个试剂盒可用于检测20个样品。
其中MgCl2、10×buffer、Taq polymerase由华美生物工程公司提供；dNTP由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；Primermixture为根据福建省农业科学院生物技术中心提供的序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；嗜水气单胞菌阳性对照(CK+)、嗜水气单胞菌阴性对照(CK-)、ddH2O由福建省农业科学院生物技术中心制备。
检测所使用的引物的上游引物是5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’，下游引物是5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’。
2、仪器设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量进样器和0.2mlPCR簿壁管。
3、待测样品的提供1993年以来从福建省各地甲鱼场发病甲鱼中分离、纯化的病原菌；发病甲鱼养殖池的水样；发病甲鱼中提取的DNA。其中大部分菌株经由福建省卫生防疫站弧菌室鉴定为嗜水气单胞菌，其鉴定结果具体见下表表1供试菌株的生化检测结果
注AH嗜水气单胞菌，AA温和气单胞菌，A气单胞菌未定种，Z假单胞菌属。
二、检测实施的具体操作将上述经普通生化检测的47株嗜水气单胞菌、4株温和气单胞菌、3株假单胞菌属的菌株进行了同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。
1、待测样品的提供第一种针对养殖水体1)吸取待测养殖水体水样；2)涂布水样于营养肉汤培养基上分离培养；3)从培养基上挑取少量待测菌落于装有1mlTEbuffer的高速离心机中离心洗涤，取沉淀加1mlTEbuffer重悬后离心；4)离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板(菌量约107-104个菌/ml)，-20℃保存备用。
第二种针对动物组织病原菌样品1)从动物样本中分离病原菌；2)挑取少量病原菌于1.5ml离心管中，加1mlTEbuffer离心洗涤；3)离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板(菌量约107-104个菌/ml)，-20℃保存备用。
第三种针对动物组织病原菌样品DNA用微量DNA提取试剂盒(Genomic DNA Minipreps Kit)法提取动物组织病原菌样品DNA，-20℃保存备用。
2、用微量进样器分别吸取PCR试剂盒中50pmol引物1μl、2mMdNTP 2.5μl、10×buffer 2.5μl、3U/μl Taq聚合酶0.2μl、25mM MgCl22μl，及1μl的待测样品到0.2PCR簿壁管中，最后用ddH2O补足至25μl，充分混匀；3、将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增95℃10min 1个循环；94℃2min，55℃2min，72℃1min；35个循环；72℃16min 1个循环。
4、在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果
1)取5～10μl扩增产物与加样缓冲液按5∶1的比例混合；2)将混合液上样于1.4％琼脂糖凝胶上；3)将琼脂糖凝胶经85～100电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA Marker进行对照；4)观察前沿指示剂迁移至距加样孔至少10cm处，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。
5、依据如下条件进行结果判断嗜水气单胞菌应在209bp处有一条带。
阳性对照和阴性对照实验只要将待测样品换成嗜水气单胞菌阳性模板及嗜水气单胞菌阴性模板即可，含嗜水气单胞菌的样品模板检测结果在209bp处有一条带，不含嗜水气单胞菌的样品模板检测结果无条带显示。
电泳结果记录如图2、图3、图4、图5(M为DNA marker)所示有41株嗜水气单胞菌具有209bp片段，而6株无此片段；4株温和气单胞菌、3株假单胞菌属对照无此片段，说明采用PCR检测方法同普通生化检测方法对比可排除假阳性反应，检测准确度提高了，避免了因检测的失误而导致的不必要损失。
权利要求
1.嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’，下游引物是5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’。
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂25mM MgCl250μl；2mM dNTP50μl；10×酶特异性反应缓冲液100μl；3U/μl耐热DNA聚合酶10μl；引物30μl；嗜水气单胞菌阳性对照20μl；嗜水气单胞菌阴性对照20μl；ddH2O1ml。
3.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，一次检测实验所用试剂盒中的试剂的量为引物1μl，2mMdNTP2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.2μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去1μl待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
4.根据权利要求1或2或3所述的嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，耐热DNA聚合酶为Tap聚合酶。
5.嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下进行的步骤5.1提供待测样品模板；5.2在PCR簿壁管中加入dNTP、MgCl2、10×酶特异性反应缓冲液、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；5.3令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；5.4在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；5.5分析并进行结果判断。
6.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，检测所使用的引物的上游引物是5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’，下游引物是5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’。
7.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增参数为95℃10min 1个循环；94℃2min，55℃2min，72℃1min；35个循环；72℃16min 1个循环。
8.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，检测所用试剂的量为引物1μl，2mM dNTP2.5μl，10×酶特异性反应缓冲液2.5μl，3U/μl Taq聚合酶0.2μl，25mM MgCl22μl，余下体积在除去1μl的待测样品的量后用ddH2O补足至25μl。
9.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，提取待测样品模板的具体步骤为9.1吸取待测养殖水体水样；9.2涂布水样于培养基上培养；9.3从培养基上挑取待测菌落进行离心洗涤；9.4离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板。
10.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，提取待测样品模板的具体步骤为10.1从动物组织样本中分离病原菌；10.2取少量病原菌于离心管中离心洗涤；10.3离心后的沉淀加蒸馏水重悬后即得模板。
11.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，提取待测样品模板的具体步骤为用微量DNA提取试剂盒(GenomicDNA Minipreps Kit)提取动物组织病原菌样品DNA。
12.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为12.1取5～10μl扩增产物与加样缓冲液混合；12.2将混合液上样于琼脂糖凝胶上；12.3将琼脂糖凝胶电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA Marker进行对照；12.4观察并记录结果。
13.根据权利要求5或12所述的嗜水气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于，嗜水气单胞菌应在209bp处有一条带。
全文摘要
本发明涉及一种可用于检测嗜水气单胞菌的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5－CCAAGGGGTCTGTG GCGACA－3’，下游引物是5’－TTTCACCGGTAACAGGATT G－3’；PCR检测方法提供待测样品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、MgCl
文档编号C12Q1/04GK1506468SQ02148540
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者宋铁英, 郑伟文 申请人:福建省农业科学院生物技术中心