专利名称：一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框的制作方法
技术领域：
本发明属生物制药领域，涉及一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体(VhC3d3)交 联的疫苗读框，即VhC3d3融合蛋白及基因疫苗读框；可增强人类疫苗的体液免疫效应。
背景技术：
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研究表明，血清补体成分C3是补体经典途径、旁路途径、MBL途径的交汇与枢纽。 人的C3d (hC3d)基因位于染色体19pl3.3-p13.2，由308个氨基酸残基组成，分子量 为35KDa。 C3d片段是C3分子被逐级酶解的终末片段，与特异性受体CR2(CD21)结合， 在固有免疫和适应性免疫中起桥梁和纽带作用。首先，C3d-CR2复合物介导、增强B 细胞抗原(Ag)的内化、提呈。CR2胞内结构域酪氨酸残基YY986/987直接或间接参与 蛋白磷酸化作用、信号转导，以促进Ag-CR2内化；并且参与后续Ag-CR2的靶向性， 增强抗原提呈，BCR-CR2交联通过上调B细胞表面CD86分子的表达，增强B细胞作为 APC活化T细胞的功能；其次，C3d-CR2结合促进B细胞活化及分化，Ag-C3d复合物 BCR的Igci/e四聚体与CD21/CD19交联使多种参与Ag识别和信号转导的跨膜分子 [BCR-Igct/e、辅助受体CD21/CD19/CD81 (TAPA-1) /Leul3 (CD225)、 CD45]产生多聚 化，从而诱导Src家族酪氨酸蛋白激酶(PTKs)的Lyn的活化，进一步使Iga / e 、 CD19 胞内段ITAMs中的酪氨酸(Tyr)磷酸化，随即启动3条信号转导途径，即磷脂酰肌醇 途径、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径和磷酸肌醇3激酶(PI3K)，产生不同的第 二信使分别激活不同的转录因子，使B细胞活化、增殖分化。Iga/e与CD21/CD19 交联使细胞内&2+浓度较单独BCR交联增加；CD19能对低水平激活的信号产生放大作 用，从而降低B细胞活化的阈值，促进更有效的免疫应答。C3d-CD21/CD19复合物能通 过CD21/CD19交联，以抗原非特异性依赖方式活化B细胞；且CR2活化不同于CD19、 BCR途径的特异信号转导机制，主要通过活化PI3K后续通路。此外，C3d-CR2结合促 进记忆性B细胞的产生。生发中心的FDC通过其表面CD21富集C3d/C3dg包被的抗原， 持续向B细胞提供抗原信号；B细胞摄取处理提呈抗原，使Th细胞活化；活化的Th 细胞通过其表面的CD40L及其分泌的多种细胞因子，辅助B细胞的增殖和分化。有赖于FDC、 B细胞、Th细胞三者间的相互作用，生发中心的B细胞经历克隆增殖，抗体可 变区体细胞高频突变，受体编辑，抗体类别转换，亲和力成熟等过程，分化为浆细胞 及长寿记忆性B细胞。
C3d是迄今为止唯一被发现具有选择性增强体液免疫效应的分子佐剂。学者们将不 同耙抗原分子分别与mC3d3基因融合，进行DNA免疫和蛋白免疫，发现C3d分子能增 强DNA疫苗及蛋白疫苗的体液免疫效应，是具有发展潜力的分子佐剂。
以hCGP避孕疫苗为例，决定其避孕效果的是体液免疫效力，而非细胞免疫。细 胞免疫不仅没有中和hCG0生物学活性的能力，在一定程度上还存在着导致生殖器靶 细胞自身免疫损伤的危险。因此，用基因工程技术研制hCGP避孕疫苗，并显著增强 其具有抗生育作用的Th2型及体液免疫效应，削弱Thl型及CTL效应是避孕疫苗的研 究目标。有研究将hCGe与3个拷贝鼠源性C3d (mC3d3)基因融合，构建真核表达质粒 pcDNA3-hCG P -mC3d3及phCMVl-hCG P -mC3d3等。分别制备hCG P -mC3d3 DNA疫苗、蛋 白疫苗、乳酸杆菌疫苗，对不同品系小鼠进行肌肉、皮内、阴道粘膜免疫。结果表明， mC3d3明显增强hCGP免疫原性；且呈剂量依赖性；显著促进Th2型体液免疫及抗体亚 型转换，并能选择性促进B细胞克隆扩增；促进抗hCGe抗体亲和力成熟。有研究通 过构建人源性hC3d3的融合质粒一pCI-gs-signal-6His-hCGe -hC3d3并转染CH0细胞 后获得了目的重组蛋白的正确表达。融合蛋白hCGe -hC3d3体外研究发现，hC3d3能显 著增强人免疫活性细胞对hCGP的免疫应答；促进人外周免疫细胞的协同刺激分子表 达。
然而，研究同时发现，pCI-gs-signal-6His-hCGe-hC3d3在CH0细胞中的表达产 物有三种，其大小分别与6His-hCGP-hC3d3、 6His-hCG e -hC3d2、 6His-hCG P-hC3d 一致。此结果与phCMVl-hCG e -mC3d3在CHO细胞中表达产物类似。国外学者研究利用 线性mC3d三聚体来构建哺乳动物表达体系时，发现预期产物105kDa蛋白(mC3d三聚 体)的产量很低，主要产物大小相当于mC3d二聚体(70kDa)和mC3d单体(35kDa)。 进一步研究发现，mC3d 二聚体两端用抗原表位标记并进行构建，发现最终的表达产物 是N末端和C末端存在抗原表位标记的单体蛋白。这些研究提示具同源重组能力的 宿主细胞在表达多个拷贝mC3d时可能发生了有效的同源重组。这种同源重组则影响了 融合蛋白的表达效率，妨碍了与分子佐剂C3d3融合的目的基因高效表达，不利于疫苗
4的大规模制备。
发明内容
本发明的目的是提供一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框及其制 备方法。本发明通过基因工程技术在转录水平上有效的防止3个拷贝hC3d的同源重组， 为高效制备携人源分子佐剂的融合疫苗提供新方法。
本发明公开了一种通过利用定点突变方法，在转录水平防止3个拷贝hC3d发生同 源重组的同义突变体，进而提供一种高效、稳定、经济获得与人分子佐剂C3d3同义突 变体交联hCGe,以hCGe作为靶抗原，制备hCGe-hC3d3融合蛋白疫苗及基因疫苗的 方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现
设计定点突变引物，利用MutanBEST Kit (TaKaRa公司)，分别对野生型hC3d的 重组质粒pMD18-T-hC3d的5'端和3'端进行定点突变，获得携序列1结构的同义突 变体1和序列2结构的同义突变体2的重组质粒pMD18-T-V'hC3d和pMD18-T-V2hC3d(图 2示)，获得含有序列1和序列2的结构与人完整的分子佐剂hC3d3融合的目的基因开 放读框，然后选用真核表达载体pCMV4，分别构建带有6个组氨酸(6His)纯化标签并 携带人hC3d3同义突变体的hCGe-hC3d3融合蛋白的真核表达质粒，即 pCMV4-6His-hCGP-VhC3d3 (图1 )。
本发明所构建的人hC3d3同义突变体及构建的真核表达质粒，经试验证实，能实 现在C0S-7系统中获得融合蛋白hCGP-hC3d3高效表达，鉴定结果显示为较高纯度 的目的蛋白，并无携2个拷贝和单个拷贝hC3d的hCGe重组蛋白。
图1是pCMV4-hCG e -VhC3d3构建图。
图2是pMD18-T-hC3d、 pMD18-T-V^C3d和pMD18-T-V2hC3d测序图， 其中，圈内碱基为同义突变碱基。
图3是pMD18-T-hC3d、 pMD18-T-V'hC3d和pMD18-T-V2hC3d酶切鉴定图 其中，M是DL2000 marker;
1、 2、 3分别是pMD18-T-hC3d, pMD18-T-V'hC3d和pMD18-T-V2hC3d;
54、 6、 8分别是pMD18-T-hC3d, pMD18-T-V'hC3d和pMD18-T-V2hC3d经Nde I 和Bgl II的酶切产物；
5、 7、 9分别是pMD18-T-hC3d， pMD18-T-V^C3d和pMD18_T-V2hC3d经 Hind III和EcoRI的酶切产物。
图4是pCMV4-hCG e -hC3d3、pCMV4-hCG P -VhC3d3和pCMV4-hCG P酶切鉴定，其中， M是入-Hind III marker;
1 、 2、 5分别是pCMV4-hCG e -hC3d3、 pCMV4-hCG P -VhC3d3和pCMV4-hCG P ; 3、 4、 6分别是pCMV4-hCGP-hC3d3、 pCMV4-hCG P -VhC3d3和pCMV4-hCG e经 Hind III和Xba I的酶切产物。
图5是免疫细胞化学鉴定pCMV4-hCG e -hC3d3、pCMV4-hCG e -VhC3d3、pCMV4-hCG P 和pCMV4转染C0S-7细胞48小时后的转染效率，
其中，A、 B和C分别显示pCMV4-hCGP -hC3d3、 pCMV4-hCG e -VhC3d3和pCMV4-hCG 转染的C0S-7细胞呈现阳性着色；D是pCMV4转染的C0S-7细胞呈现阴性着色。
图6是放射免疫法测定pCMV4-hCG P -hC3d3、 pCMV4-hCG e -VhC3d3和pCMV4-hCG e 转染C0S-7细胞24、 48和72小时后上清中融和蛋白hCGP -hC3d3和蛋白hCGP分泌量。
图7是Western blotting鉴定转染72小时后上清中融和蛋白hCGP-hC3d3和蛋白 hCGP的分泌，
其中，1是pCMV4-hCG0 -hC3d3转染COS-7细胞上清中的分泌产物； 2是pCMV4-hCG P -VhC3d3转染COS-7细胞上清中的分泌产物； 3是pCMV4-hCG P转染C0S-7细胞上清中的分泌产物。
具体实施例方式
实施例1
重组质粒pMD18-T-V'hC3d (hC3d同义突变体1)、 pMD18-T-V2hC3d (hC3d同义突变体2) 及pMD18-T-VhC3d3的构建
设计定点突变引物，采用MutanBEST Kit (TaKaRa公司)，分别对野生型hC3d的重 组质粒pMD18-T-hC3d的5'端和3'端进行定点突变，获得携同义突变体1: 5'端:
67的氨基酸密码子中同义突变6个碱基；3'端4的氨基酸密码子中同义突变3个碱 基和同义突变体2: 5'端5的氨基酸密码子中同义突变3个碱基；3'端6的氨基 酸密码子中同义突变6个碱基的重组质粒pMD18-T-V'hC3d和pMD18-T-V2hC3d (图1)。 经测序(图2)和酶切鉴定(图3)质粒构建完全正确。通过酶切、连接反应后得到质 粒pMD18-T -VhC3d3，测序和酶切鉴定构建完全正确。
实施例2构建真核表达质粒pCMV4-6His-hCG P -VhC3d3
利用质粒pMD18-T-VhC3d3和pMD18-T-hCG e (市购)进行酶切、连接反应后得到质 粒pMD18-T-hCGP-VhC3d3，进一步与真核质粒pCMV4酶切、连接得到真核表达质粒 pCMV4-hCGe-VhC3d3，经测序和酶切鉴定(图4)质粒构建完全正确。
实施例3重组蛋白的表达及其鉴定
1) 真核表达质粒pCMV4-hCG P -VhC3d3、 pCMV4-hCG e -hC3d3、 pCMV4-hCG3和pCMV4 转染COS-7细胞，
采用Invitrogen公司Lipofectamine 2000通过脂质体介导pCMV4-hCG P -VhC3d3、 pCMV4-hCG P -hC3d3、 pCMV4-hCG e和pCMV4 (市购)转染COS-7细胞；
2) 免疫细胞化学鉴定转染效率
转染后的C0S-7细胞经培养48h后，利用hCG0抗体进行免疫细胞化学法(图5)鉴 定转染，结果显示，pCMV4-hCGP-hC3d3、 pCMV4-hCG P -VhC3d3、 pCMV4-hCGP转染组 C0S-7细胞浆呈阳性着色，对照组pCMV4转染组COS-7细胞浆呈阴性；
3) 放射免疫法测定hCGe和融合蛋白hCGe-hC3d3的表达
上述质粒pCMV4-hCGP-VhC3d3、 pCMV4-hCGe -hC3d3、 pCMV4-hCGP转染后的C0S-7 细胞经培养24h， 48h， 72h后，收集培养上清，经放射免疫法测定，结果显示， pCMV4-hCG P -hC3d3转染组重组蛋白hCGP-hC3d3的产量分别为263、 600和974 mIu/ml/1.5X105cells， pCMV4-hCGe-VhC3d3转染组重组蛋白hCGP-hC3d3的产量分 别为643， 3833和8554 mlu/ml/1.5XlQ5cells，而pCMV4-hCGP转染组hCGP蛋白的产量分别为462、 3743和9966 mlu/ml/l. 5X 105cells。
4) Western blottiong鉴定融合蛋白的表达
收集转染后C0S-7细胞培养72h后的上清，经浓縮后经Western blottiong分析显 示，pCMV4-hCG e-VhC3d3转染组上清的表达产物为一条带，分子量约为136KDa，即 hCGP-VhC3d3，无携2个拷贝和单个拷贝hC3d的hCGP重组蛋白的表达；而 pCMV4-hCGe-hC3d3转染组上清的表达产物为三条带，分子量大小约为136KDa、 100KD 和64KDa，分子量分别相当于携3个拷贝、2个拷贝和单个拷贝hC3d的重组蛋白； pCMV4-hCGe转染组上清的表达产物约为24KDa。
试验结果证实，本发明构建的人hC3d3同义突变体及构建的真核表达质粒，能实 现在C0S-7系统中获得融合蛋白hCGe-hC3d3高效表达，鉴定结果显示为较高纯度 的目的蛋白，并无携2个拷贝和单个拷贝hC3d的hCGe重组蛋白。
权利要求
1、一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框，其特征是包含携序列1结构的同义突变体1和序列2结构的同义突变体2的重组质粒pMD18-T-V1hC3d和pMD18-T-V2hC3d。
2、 按权利要求1所述的与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框， 其特征是所述的读框是开放读框。
3、 按权利要求1所述的与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框的 制备方法，其特征是通过下述步骤采用MutanBESTKit，通过PCR定点突变， 分别对携野生型hC3d的重组质粒pMD18-T-hC3d的5'端和3'端进行定点突变， 获得含序列1的同义突变体1和序列2的同义突变体2的重组质粒 pMD18-T-V、C3d和 PMD18-T-V2hC3d ， 通过酶切连接获得质粒 pMD18-T-hCG卩-VhC3d3和pCMV4陽hCG卩陽VhC3d3 。
4、 权利要求1的与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框在制备 hCG(3-hC3d3融合蛋白疫苗或基因疫苗中的用途。
5、 一种hCG(3-hC3d3融合蛋白疫苗，其特征是含有权利要求2的开放读框。
全文摘要
本发明属生物制药领域，涉及一种与人分子佐剂hC3d3同义突变体交联的疫苗读框。本发明采用MutanBEST Kit，分别对携野生型hC3d的重组质粒pMD18-T-hC3d的5’端和3’端进行定点突变，获得含序列1的同义突变体1和序列2的同义突变体2的重组质粒pMD18-T-V<sup>1</sup>hC3d和pMD18-T-V<sup>2</sup>hC3d，通过酶切连接获得质粒pMD18-T-hCGβ-VhC3d3和pCMV4-hCGβ-VhC3d3。所构建的人hC3d3同义突变体及构建的真核表达质粒，经试验证实，能实现在COS-7系统中获得融合蛋白hCGβ-hC3d3高效表达，经鉴定为较高纯度的目的蛋白，并无携2个拷贝和单个拷贝hC3d的hCGβ重组蛋白。本发明在转录水平上有效的防止3个拷贝hC3d的同源重组，为高效制备携人源分子佐剂的融合疫苗提供新方法。
文档编号C12N15/62GK101497881SQ200810033499
公开日2009年8月5日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者李大金, 李明清 申请人:复旦大学附属妇产科医院