用于将生物分子印刷到基材上的分子印模的制作方法

专利名称：用于将生物分子印刷到基材上的分子印模的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于将生物分子印刷到基材上的分子印模(stamp)，涉及制造所述印模的方法，且涉及将生物分子印刷到该基材上的方法。
在分子诊断学中使用了阵列，也称之为生物芯片。阵列是在相对较小面积上含有大量探针的基材，目前该面积的级别为1英寸×3英寸，这是常用于基于阵列的基因组学和蛋白质组学中的显微板的尺寸。使用平版印刷技术或喷墨印刷技术可将基因探针置于基材上。这些生产技术以及生物样品非常昂贵。通常采用点样仪来安置蛋白质探针(蛋白质阵列)。可形成具有通常约150μm直径的圆形点。迄今为止报道了约60μm的最小点直径。例如用于生产DNA阵列的平版印刷技术不能用于蛋白质阵列。
除了检测部件以外，诊断试剂盒还包含用于输送流体并且很可能还用于分离的通道，混合和过滤模块/腔室。这些试剂盒总体上的尺寸大约与目前可得到的生物阵列相同。因为诊断试剂盒需要更高的整合水平，因此该检测部分将比整个试剂盒小得多。放置探针的面积通常低于1×1cm2，其远小于显微镜载玻片。
而且，成本节约也推动着检测部件的微型化。首先，因为试剂盒的检测部件可以良好地以硅制造，因此该部件的尺寸应当尽可能小。其次，该生物探针是高度昂贵的分子并且所用数量应当尽可能最少。用于分子诊断学的多分析物检测方案需要具有在单一试剂盒上测量10-1000个生物化合物(DNA/RNA，蛋白质、糖、代谢产物、细胞)的能力。因此，非常需要可将很多(且不同的)生物识别探针放置于小尺度基材上的低廉生产方法。此外，这些方法还应包括放置不同形状(矩形、正方形)的可能性，而并非只是圆形，其是用目前可得的针-点样仪在扁平基材上的唯一可能。最后，该方法应使得该生物探针的生物功能保持完整。例如，当抗体被固定时，它们的亲和常数(Kd)应当保持尽可能高。
US5948621试图解决这些问题。其报道了一种分子印模，该印模包括固体载体和共价结合于所述载体以形成图案化表面的聚合凝胶。该凝胶必须是不可逆地结合于载体并且该凝胶包含吸收待印模印生物材料的孔。用于这些凝胶的材料是酯化到糖上的丙烯酸。该凝胶约0.5-10％，最优选2-4％交联。因为水凝胶增加的脆度以及弹性和处理稳定性的降低，所以不能使用更高的交联密度。而且，实际上仅2-4％交联的凝胶即可提供一致的大且均质的孔，且该2％交联的凝胶是形成该毛细水凝胶的较好选择。制备后这种凝胶的水含量通常为85％。一旦水合则4％和2％交联凝胶的水含量分别增长到90％和97.3％。最终，该图像具有约10μm边距的空间分辨率。尽管这些上述印模具有很多优点并且克服了很多现有技术缺点，但仍需进一步改进。
因此本发明的目的在于提供一种分子印模，其没有现有技术印模的缺点，即提供一种分子印模，其并非必须结合于基材而且可用作自承式印模，其允许生物材料的吸附和吸收而非吸收进入孔中，且其中空间分辨率得到进一步改进，并维持了坚固性、弹性和处理稳定性。
为这一目的，本发明涉及一种用于将生物分子印刷到基材上的分子印模，包括亲水聚合凝胶和图案化表面，其特征在于该凝胶具有至少20％的交联密度。
为获得自承式(即不需要载体并且可原样使用)的印模，该高交联密度是重要的。因此优选增加该交联达到至少30％，更优选至少40％。更优选地，该印模包括至少50％的聚合物浓度。
其它分子印模也有记载，例如在US6444254中。该处所述方法涉及使得生物配体和蛋白质直接在聚合基材上图案化的反应性微印模技术。具有反应性部分的聚合物表面与印模接触。包括另外的反应性部分的配体被吸收到该印模表面上以与该聚合物上的第一反应性部分形成共价键。尽管对该印模几乎不存在任何限制，其并不图案化仅必须能够吸收该生物材料，但是根据该方法仅可使用具体官能化的基材，并且仅可使用包含官能化基团的配体以与该官能化基材形成共价键。其暗示了该方法仅具有受限的应用。
具有用于蛋白质阵列的PDMS印模的微接触印刷技术的应用也被提出(参见例如Bernard，A，Delamarche，E.，Schmid，H.，Michel，B.，Bosshard，H.R.，Biebuyck，H.，Langmuir，14，9，2225-2229，1998和Bernard，A，Renault，J.P. Michel，B.，Bosshard，H.R.，Delamarche，E.，Advanced Materials，12，14，1067-1070，2000)。然而，众所周知的是PDMS是非常疏水的物质并且需要使用表面修饰，其不会产生可重复印模。
本发明的凝胶印模可用于从水溶液中印刷生物分子。通过这些凝胶印模，这些分子在印刷之后可停留在湿状态，这对于保持其生物活性而言是非常重要的。印刷可通过手工或机器，例如波印刷器(waveprinter)进行。
该凝胶可通过使用具有一个或多个反应性基团的亲水性分子合成，包括步骤-在聚合引发剂和非必需的链转移剂的存在下，聚合至少一种水溶性烯属不饱和和/或环氧化单体，该单体包括选自以下的至少一个官能团羟基、烷氧基、胺、烷基取代的胺、羧酸盐、羧酸酯、羧酰胺、酐、尿烷、和尿素基团，和-用具有至少两个烯属不饱和基团和/或环氧基团的交联剂将聚合物交联为具有至少20％交联密度的交联聚合物。
该凝胶也可通过首先将水和非必需的生物分子包含到该混合物中而制备。随后，该混合物可用于通过原位聚合来复制预制表面结构。该方法的优点在于当该聚合物被浸入具有生物分子的溶液时不会进一步膨胀，从而保持复制结构尺寸相同。每一次印刷之前都必须浸渍。
尤其适合用于该聚合中的单体例子是(甲基)丙烯酸酯CH2＝CR-CO-O-Y-E乙烯基醚CH2＝CH-O-Y-E环氧化物 也可使用二硫醇，其在强碱的存在下与例如二乙烯基化合物通过发生迈克尔加成而产生聚合物HS-Y-HS CH2＝CH-Y-CH＝CH2其中R是H、CH3、CH2CH3或卤素，优选Cl，和Y＝((CRR′)m)n或((CRR′)mZ)n，Z＝O、N、C(O)、C(O)O、C(O)N(H)、N(H)C(O)O、OC(O)O和R、R′是H、CH3、C2-8烷基、卤素；和n＝1-25；m＝1-8
E是H、甲基、羟基、烷氧基、胺、烷基取代的胺、羧酸和其盐，例如COOR′，其中R′＝H、Na、K、Li、NR3″其中R″是烷基、羧酸酯、羧酸酐、羧酰胺、异氰酸酯或尿素基团Y-E的例子是醇例如-(CH2)nOH和酸。
对于E，其它基团也是可以的，例如磺酸酯如O-SO3R′，R′具有前述给出的含义。
交联剂的实例是 HS-Y′-HS CH2＝CH-Y′-CH＝CH2CH2＝CH-O-Y′-O-CH＝CH2 其中R具有前述给出的含义且Y’与Y的含义相同或者是其类似物，或者可以是短的非极性基团如烷基或苯基。X是将所述臂结合到一起的小分子例如碳原子或者苯环。链转移剂可非必需地被加入并且例如为HS-Y-R，其中Y和R具有前述给出的含义。
聚合反应可以在水性缓冲溶液例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)，Tris，TE，Hepes缓冲剂中进行。该聚合反应在聚合引发剂例如Darocure1173的存在下进行。引发剂可以是热引发剂，或优选地是光引发剂。
通过附图A-G和实施例阐述本发明。
在

图1A-G中，示意性地表达了用于直接将蛋白质在基材上进行图案化的工艺。
图1A显示了具有所需印模的相反结构的母版(master)。图1B显示了向该母版施加间隔物和覆盖玻璃。图1C中包括官能化单体、交联剂、交联化试剂、缓冲液、光引发剂、和非必需的链转移剂和/或生物分子的液体混合物被施加并且该混合物暴露于UV光以形成聚合物。在图1D中该图案化的凝胶从母版上剥落下来，得到被突出物图案化的印模。图1E中该印模负载了蛋白质缓冲液。负载也可在将该印模与生物材料接触之前执行。因为该聚合在大多数情况下在水性介质中进行，所以膨胀与聚合物的形成同时出现。在图1F中，该印模被缓冲液漂洗和/或在氮气流下干燥并且该生物材料被印模印到基材上。在图1G中，显示了顶部具有某种结构的基材。生物分子被吸附到该凝胶结构和/或被吸附进入该凝胶结构。
实施例制备了适合用于将生物分子印刷到具有极低空间分辨率(1μm宽的矩形)的扁平(金)基材上的高度亲水印模。该印模可被调节使得水含量(膨胀，尺寸)可被控制。高度亲水印模是印刷保持其生物功能的生物分子所必需的。这些印模也可用于印刷很多其它生物样品。
材料和方法金基材的制备金基材的制备如下通过蒸发5nm的Ti，随后通过蒸发25nm的Au到硅基材上。随后，通过经蒸馏的去离子水，乙醇，和庚烷充分漂洗该基材。基材的清洁是通过暴露于氩等离子体5分钟进行的。
化学品的制备用于生产该印模的混合物包含40wt％的丙烯酸羟乙酯(MW116.1，来自Polysciences)，10wt％的聚乙二醇(400)二丙烯酸酯(来自Kayarad)，50wt％的水和0.5wt％的光引发剂Darocure1173(来自Merck)，得到聚合物有20％交联的凝胶。
另一混合物具有以下组成72wt％的丙烯酸羟乙酯，18wt％的聚乙二醇(400)二丙烯酸酯，10wt％的水和0.5wt％的Darocure1173。这再次得到聚合物有20％交联的凝胶。
将在0.01M的PBS缓冲液中的1mg/ml的经标记的蛋白质BSA-FITC(异硫氰酸荧光素结合牛清蛋白(albumin，fluorescein isothiocyanateconjugate bovine))，获自Sigma，用作(pH≈7.3)模型蛋白质。
蛋白质的微接触印刷通过施加间隔物和覆盖玻璃到母版上而制备印模(参见图1A，B)。该模完全填满上述液体混合物(参见图1C)。在模中的聚合混合物进行UV曝光之后获得印模(例如于4mW/cm2下1分钟，参见图1D)。随后，该印模被浸入水性缓冲液中的蛋白质溶液中一段时间(例如20-25℃下1分钟)(参见图1E)。浸渍之后，用蒸馏的去离子水漂洗和/或用氮气流干燥印模。然后将该印模与清洁的金表面接触约1分钟(参见图1G)。
印刷结构的检测用含有Photometric CoolsnapHQ CCD相机，超高压汞灯和Leica滤镜L5的DMLM LeicaFluorescence Microscope获得荧光图像。使用Image-ProPlus 4.5软件进行数据分析。
权利要求
1.一种用于将生物分子印刷到基材上的分子印模，包括亲水聚合凝胶和图案化表面，其特征在于该凝胶具有至少20％的交联密度。
2.权利要求1的分子印模，其中该凝胶可如下获得通过在聚合引发剂和非必需的链转移剂的存在下，聚合至少一种水溶性烯属不饱和和/或环氧化单体，该单体包括选自以下的至少一个官能团羟基、烷氧基、胺、烷基取代的胺、羧酸盐、羧酸酯、羧酸酐、羧酰胺、氨基甲酸酯、尿烷和尿素基团，和用具有至少两个烯属不饱和基团和/或环氧基团的交联剂将该聚合物交联。
3.权利要求1或2的分子印模，其中所述单体是(甲基)丙烯酸羟基烷基酯并且所述交联剂是聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯。
4.权利要求1-3任一项的分子印模，其中该印模是自承式的。
5.权利要求1-4任一项的分子印模，其中交联密度为至少40％。
6.权利要求1-4任一项的分子印模，其中聚合物浓度为至少50％。
7.用于制备权利要求1-6任一项的印模的方法，其包括-在聚合引发剂和非必需的链转移剂的存在下，聚合至少一种水溶性烯属不饱和和/或环氧化单体，该单体包括选自以下的至少一个官能团羟基、烷氧基、胺、烷基取代的胺、羧酸盐、羧酸酯、羧酰胺、酐、尿烷和尿素基团，和-用具有至少两个烯属不饱和基团和/或环氧基团的交联剂将聚合物交联为具有至少20％交联密度的交联聚合物。
8.一种将生物分子印刷到优选为金基材的基材上的方法，包括步骤-非必需地用水或缓冲液膨胀权利要求1-6任一项的印模-通过使该图案化的印模表面与生物分子接触，将生物分子负载到该印模表面上，-非必需地用水或缓冲液漂洗该表面和/或干燥该印模，和-将具有吸附的生物分子的印模表面与基材基础，随后将所述生物分子从该印模转移到该基材。
全文摘要
本发明涉及一种用于将生物分子印刷到基材上的分子印模，包括亲水聚合凝胶和图案化表面，其特征在于该凝胶具有至少20％的交联密度。优选地，该印模包括凝胶，该凝胶可如下获得通过在聚合引发剂和非必需的链转移剂的存在下，聚合至少一种水溶性烯属不饱和和/或环氧化单体，该单体包括选自以下的至少一个官能团羟基、烷氧基、胺、烷基取代的胺、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酰胺、异氰酸酯、氨基甲酸酯、尿烷和尿素基团，和用具有至少两个烯属不饱和基团和/或环氧基团的交联剂将该聚合物交联。
文档编号C12Q1/68GK1894028SQ200480037185
公开日2007年1月10日 申请日期2004年11月24日 优先权日2003年12月16日
发明者T·范博梅二, R·A·M·希克梅特, H·R·斯塔帕特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司