与基质芯片相关的方法和组合物的制作方法

专利名称：与基质芯片相关的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及细胞生物学和癌症诊断。特别地，本发明涉及 用于检测入侵性哺乳动物细胞、区别细胞入侵程度之间的差异以及识 别调节细胞入侵性的化合物的组合物、方法和设备。
背景技术：
现有技术已经设计了大量的方法用于癌症的检测。这些方法从通 过X-ray和光学技术对肿瘤物质的成像到对由活检获得的组织样品中 的细胞进行评价再到对由癌细胞释放到体液例如血液和尿液中的蛋白 和其它分子种类的检测。在这些方法中，只有对活检获得的细胞的直 接评价对癌症的检测、定位和表征是确定的且因此是被选择用于这些 目的的方法，抑或作为单独的方法或作为对通过使用其它方法获得的 结果确认或细化的手段。
癌症的细胞水平的检测、诊断、分类和表征传统地通过对组成组 织或细胞样本的细胞形态的视觉显微镜评估进行。更近地，用于检测 和量化在癌细胞中特异性或差异性表达的某些细胞表面蛋白(标记) 的自动图像分析法和免疫组织化学法已被用于该目的。正在开发蛋白
质组学技术，该技术通过评估大批蛋白表达的变化识别癌细胞，但该 技术还没有进入常规的临床应用。尽管这些新技术在癌细胞的检测中 具有一些应用，对细胞形态的视觉显微镜评估仍然是用于这些检测的 确认以及癌症的诊断、分类和表征的被接受的标准。
将细胞形态学用于癌症检测的主要限制很大程度上来自于该方法
中固有的低信噪比(SNR)。癌症细胞如果存在，通常是临床样本中的 小部分。例如，在广泛用于子宫颈癌的"帕氏涂片(Pap smear)"筛 选测试中，在组成典型样本的大约50， 000至300， 000个细胞的群落中， 1至10个异常细胞的存在通常足以宣布该样本对于癌症的存在而言是 阳性的。因此仅根据这一基础，对阳性样本的信噪比可以为1/300,000 之低。该信噪比进一步地被其它因子降低，最显著地是"生物学噪音"。
在这些样本中的生物学噪音来自两个主要的来源。 一个来源是在 各患者之间的内在变化，这种变化反映了大量的遗传和环境因素，包 括但不限于病史、人口统计学和激素状况。另一来源来自一事实，即 细胞的形态学特征占据了从正常细胞到明显的癌症的连续范围且并没 有呈现出区分癌和非癌细胞的明显的界限。实际上，很多与癌细胞相 关的形态学特征即使没有包含也与作为正常细胞过程的结果所观察到 的特征非常相似，例如受伤修复或对事件例如感染的反应。相关形态 学标准在各种类型癌症之间也有一些变化。类似这样的因素使得通过 细胞形态评估进行的癌症检测有些主观且使得这些评估必须由经过专 门训练的、高度熟练的人员进行。尽管存在这些训练和大量尝试已将 细胞形态学的评估系统化，关于具体细胞是否确实是癌细胞以及如果 是的话，该细胞代表的癌症类型以及其预后仍然常常难以达成一致。 如同所预料的，该主观性也对评估细胞形态学的自动化系统的性能产 生了显著的限制。
开发检测癌症的免疫组织化学和蛋白质组学技术的一个主要驱动 力是为了提高检测的敏感性和特异性而提高检测过程的信噪比的需 要。免疫组织化学法中的目的是通过强调呈现细胞表面标记的细胞促
进正常和癌细胞之间的区分，这些细胞表面标记是特定类型的癌症所 特有的或超量表达的。随后对这些被强调的细胞进行形态学评估以确 认检测并开始对癌症的分类和表征过程。蛋白质组学法对大量的"指 示物"进行统计学和/或参数解释，其中没有任何一种其本身对于相似 的目的是必须确定的。然而，已知两种方法均受到生物学噪音的影响 且因此与形态学分析结合使用以获得明确的结论。
经济学和人口统计学因素正在驱动着关于"护理的标准"的全球 性变化，这些标准涉及癌症的检测。传统的重点是使用高度敏感的筛 选测试在尽可能早的阶段检测癌症。这些高度敏感的测试本质地产生 高水平的假阳性结果，这些结果要求广泛的和昂贵的后续工作且因此 代表了对保健资源的显著浪费。流行病学和其它研究目前显示至少对 某些癌症，利用高度特异性且优选地预后性的测试将筛选的群落分成 明显正常的组、明显具有癌症的组而"疑似组"是医学上和经济上更 有效的。在该模型中，后续手段和治疗重点放在明显显示患有癌症的 患者而疑似组的患者接受提高的监督水平。这反过来将传统上花费在 解决假阳性实验结果上的资源转向了提高筛选的幅度和频率上。至少 在该改进进行的最先进的子宫颈癌的筛选领域内，该方法己经明显地 证明以经济可行的方式提高了护理的质量和有效性。考虑到增加的人 口、这些人口增加的平均年龄和接受细胞形态学评估的训练的人数的 持续减少，这是特别重要的。
因为所有原因，需要检测癌症的确定的和经济有效的方法，该方 法敏感、高度特异、通常适用于广泛的癌症类型，且为了达到临床有 用的结论需要最少的使用者的技术和解释。同样希望方法是预后的， 因为其确定检测到的癌症的入侵潜能。

发明内容
本发明的具体实施方式
涉及用于评估细胞间、和/或细胞和细胞基 质材料间相互作用的设备和方法。由于这些相互作用形成的细胞分布
模式对特定细胞的入侵潜能具有指示性。此外，这些设备和方法可以
提供对入侵性细胞转移的优选位点的指示；对使用到这些细胞上的抗 癌药物的功效的指示；以及对试剂促进或提高肿瘤生长或转移的潜能 的指示。
本发明基于对各种类型细胞与不同类型和厚度的胞外基质和/或 各种基质材料的特征间的相互作用的说明。本发明的具体实施方式
包 括用于癌症检测、诊断和表征，以及评估抗癌药物和治疗的功效；评 估潜在的癌症促进和提高试剂；以及用于细胞生长、分化和基因表达 的研究的设备和方法。具体地，本发明包含将细胞生长和细胞形态学 评估为包含蛋白和/或其它基质材料的下层的性质和厚度的函数的设 备和将这些设备用于癌症检测、诊断和表征；药物开发和评估；用于 癌症促进或提高活性的试剂的筛选；以及细胞生物学领域的研究和探 索的方法。
本发明的具体实施方式
包含用于评估细胞的设备，该设备包含底 物，该底物具有包含基质材料的一或多个细胞生长区域，其中区域内 的该基质材料是a)具有厚度A，在该厚度待评估的细胞没有穿透和 重塑该区域的基质材料；b)具有厚度B，在该厚度待评估的细胞可以 穿透并重塑该区域的基质材料，但不允许细胞被包埋在该材料中；c) 具有厚度C，在该厚度待评估的细胞能够穿透、重塑和被包埋在该区域 的基质材料中；或d)它们的组合。在本发明的某些方面中，厚度A 小于50微米，厚度B在50至100微米之间，且厚度C大于100微米。 基质材料可包含胞外蛋白和/或其它基质材料。在某些具体实施方式
中，基质材料可包含蛋白质成分例如层粘蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白 原、纤连蛋白、从一或多个生物学组织中分离出的细胞基质材料，或 它们的组合。该设备的一或多个细胞生长区域可通过喷涂、移印、转 印、丝网印刷、喷墨沉积、印刷举离法(lift off)、凹凸印、软刻 蚀、制模、压铸、刻蚀并充填(嵌刻)，或它们的组合形成。 一或多 个细胞生长区域可以在底物或支持材料的表面上或其中的腔内形成。
待经本方法评估的细胞可以是人细胞，特别是具有癌性或病理性过量 增殖潜能的人细胞。该设备进一步包含作为参照的纤连蛋白的一或多 个参照区域，由在包含其它基质材料的细胞生长区域上生长的细胞形 成的模式与该参照区域进行比较。
在某些具体实施方式
中， 一种用于评估细胞的设备包含底物，该 底物具有包含基质材料的一或多个细胞生长区域，其中一或多个细胞 生长区域在厚度上变化。在各种具体实施方式
中， 一或多个细胞生长 区域以连续的方式在厚度上变化。在本发明的某些方面中， 一或多个 细胞生长区域的厚度从(i)足以允许细胞贴附并在基质材料上生长， 和(ii)不足以允许细胞穿透并重塑该区域的基质材料的最小厚度变 化到足以允许细胞穿透、重塑和被包埋在该区域的基质材料中的最大
厚度。细胞生长区域的厚度从小于50微米变化到大于500微米或更大。 在某些优选具体实施方式
中，组成细胞生长区域的基质材料是层粘蛋 白、胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、从一或多个生物学组织中分 离出的细胞基质材料或它们的组合。 一或多个细胞生长区域可以通过 喷涂、移印、转印、丝网印刷、喷墨沉积、印刷举离法、凹凸印、软 刻蚀、制模、压铸、刻蚀并充填(嵌刻)形成。 一或多个细胞生长区域 可以在底物的表面上或在底物中的腔内形成。待评估的细胞包括但不 限于人细胞。本发明的设备可进一步包含纤连蛋白的一或多个参照区 域，由在包含其它基质材料的细胞生长区域上生长的细胞形成的模式 与该参照区域进行比较。
本发明的另一具体实施方式
包括一种确定细胞入侵潜能的方法， 包括a)将待评估的细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物上， 该区域包含基质材料；b)在允许细胞迁移、生长、或迁移和生长的条 件下在一或多个细胞生长区域上培养该细胞；c)识别由细胞在一或多 个细胞生长区域上迁移、生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及d) 解释该细胞模式以确定细胞的入侵潜能。在某些具体实施方式
中，一 或多个细胞生长区域的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被
包埋在基质材料中的厚度。本方法可进一步包含用e)细胞通透化试
剂；f)核酸内切酶ALU、核酸酶例如DNA酶、或两者；以及g)核酸 染料处理生长在一或多个细胞生长区域上的细胞。待评估的细胞可以 是入侵性细胞、疑似入侵性细胞和/或非入侵性细胞的混合物。在某些 方面，可用MSP I酶处理待评估的细胞，并随后将其暴露于核酸染料 例如溴化乙锭。
在本发明的某些方面， 一或多个细胞生长区域的至少一部分具有 足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的厚度。本方法可包 含用e)细胞通透化试剂；f)核酸内切酶ALU、核酸酶DNA酶、或两 者；以及g)核酸染料处理生长在一或多个细胞生长区域上的细胞。在 某些方面，可用MSP I酶处理待评估的细胞，并随后将其暴露于核酸 染料例如溴化乙锭。
在本发明的另一方面，如在此所述，在一或多个细胞生长区域上 生长的正常或非入侵性细胞层之上沉积细胞的混合物。在各具体实施 方式中， 一或多个细胞生长区域的至少一部分具有足以允许细胞穿透、 重塑并被包埋在基质材料中的厚度。本方法可进一步包括用e)细胞 通透化试剂；f)核酸内切酶ALU、 DNA酶或两者；以及g)核酸染料处 理细胞混合物。在某些方面，可用MSP I酶处理待评估的细胞，并随 后将其暴露于核酸染料例如溴化乙锭。
本发明的具体实施方式
包括一种确定入侵性细胞可能转移至的组 织或器官位点的方法，包括a)将待评估的入侵性细胞沉积在具有一 或多个细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料，其中该基质材 料获自或来自入侵性细胞可能转移至的组织或器官；b)在允许细胞迁 移、生长、或迁移和生长的条件下在一或多个细胞生长区域上培养该 入侵性细胞；c)识别由该细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、生长、 或迁移和生长产生的细胞模式；以及d)解释该细胞模式以确定入侵性 细胞可能转移至的组织或器官位点。在某些方面，其中细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的
厚度。本方法可进一步包括用e)细胞通透化试剂；f) ALU核酸内切
酶、DNA酶或两者；以及g)核酸染料处理细胞。在某些方面，可用MSP
I酶处理待评估的细胞、组织或器官，并随后将其暴露于核酸染料例如 溴化乙锭。
更进一步的具体实施方式
可包括一种筛选化合物、药物或药物组
合物作为抗癌化合物、药物或药物组合物的功效的方法，包括a)将
癌细胞或前癌细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物上，该区
域包含基质材料；b)用待评估的化合物、药物或药物组合物处理癌细 胞或前癌细胞；c)在允许该癌细胞或前癌细胞迁移、生长、或迁移和 生长的条件下在一或多个细胞生长区域上培养该癌细胞或前癌细胞；
d)识别由该癌细胞或前癌细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、生长、 或迁移和生长产生的细胞模式；以及e)解释该细胞模式以确定该化合 物、药物或药物组合物对该癌细胞或前癌细胞的作用。在某些方面， 一或多个细胞生长区域的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并 被包埋在基质材料中的厚度。本方法也包括在有核细胞或去核细胞(细 胞质)上评估抗癌药物或药物组合物的功效。本方法可进一步包括用 f)细胞通透化试剂；g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及h)核 酸染料处理癌细胞或前癌细胞。在某些方面，可用MSP I酶处理待评 估的细胞，并随后将其暴露于核酸染料例如溴化乙锭。
在更进一步的具体实施方式
中，预期了一种确定抗癌药物或药物 组合物的功效的方法，包括a)将已经过抗癌药物或药物组合物处理 的癌细胞或前癌细胞沉积在具有细胞生长区域的底物上，该区域包含 基质材料；b)在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在细 胞生长区域上培养该细胞；c)识别由该细胞在细胞生长区域上迁移、 生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及d)解释该细胞模式以确定 该抗癌药物或药物组合物对该细胞的作用。在某些方面，该细胞基质 材料的至少某些部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质 材料中的厚度。可以评估抗癌药物或药物组合物对有核细胞或去核细
胞(细胞质)的功效。本方法可进一步包括用f)细胞通透化试剂； g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及h)核酸染料处理该癌细胞或
前癌细胞。在某些方面，可用MSP I酶处理待评估的细胞，并随后将
其暴露于核酸染料例如溴化乙锭。
其它具体实施方式
包括检测起始、促进或加强细胞内癌行为的化
合物的方法，包括a)将正常的或非入侵性的细胞沉积在具有一或多 个细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料；且b)用待评估的化 合物处理该细胞；c)在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件 下在一或多个细胞生长区域上培养该细胞；d)识别由该细胞在细胞生 长区域上迁移、生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及e)解释该 细胞模式以确定该化合物是否起始、促进和/或加强该细胞内的癌行 为。在某些方面， 一或多个细胞生长区域的至少某些部分具有足以允 许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质材料中的厚度。本方法可进一步 包括用f)细胞通透化试剂；g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以 及h)核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。在某些方面，可用MSP I 酶处理待评估的细胞，并随后将其暴露于核酸染料例如溴化乙锭。
本发明的具体实施方式
包括检测起始、促进或加强细胞内癌行为 的化合物的方法，包括a)将己经过待评估的化合物处理的正常的或 非入侵性的细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物上，该区域 包含基质材料；b)在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下 在一或多个细胞生长区域上培养该细胞；c)识别由该细胞在一或多个 细胞生长区域上迁移、生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及d) 解释该细胞模式以确定该化合物是否起始、促进或加强该细胞内的癌 行为。在某些方面， 一或多个细胞生长区域的至少某些部分具有足以 允许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质材料中的厚度。可以评估抗癌 药物或药物组合物对有核细胞或去核细胞(细胞质)的功效。本方法 可进一步包括用细胞通透化试剂；ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；
以及核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。在某些方面，可用MSP I酶 处理待评估的细胞，并随后将其暴露于核酸染料例如溴化乙锭。
在本发明的进一步的具体实施方式
中，本发明的设备和方法可被 用于治疗试剂对顽固的入侵性癌症的功效的体外评价中。在这样的设 备中可以方便地将薄和厚基质层并列由此生长在薄基质上的细胞作为 生长在厚基质上的细胞的程序对照。在所有的情况中，来自患者或其 它来源的癌细胞在胞外基质的薄层和厚层上生长至某点，在该点厚基
质上的细胞形成肿瘤巢(tumor nest)。随后将细胞暴露于治疗试剂， 典型地通过将试剂加入细胞培养基，且观察这样的暴露的结果。有效 试剂将标记生长在薄基质上的所有细胞且将穿透入在厚基质上形成肿 瘤巢的细胞簇。功效与增加的试剂穿透性相关。通过在延长暴露于治 疗试剂后观察肿瘤巢的坏死和/或凋亡迹象可以获得功效的进一步的 证据。通过将接受治疗试剂处理的细胞以在此所述的方式暴露于核酸 酶例如ALU或DNA酶可以获得功效的额外指示。
在本发明的更进一步的具体实施方式
中，使用本发明的设备和方 法，细胞生长在薄和厚基质上，或它们的梯度上。分别收获生长在薄 和厚基质上的细胞。为了避免常用于该目的的使用化学方法例如用鳌 合剂如EDTA或EGTA或用蛋白水解酶如胰蛋白酶的处理可能伴随的假 相，收获优选地通过机械方式进行。随后为了应用于"基因阵列"芯 片例如Affymetrix II微阵列(Affymetrix)，分别制备从薄和厚基 质收获的细胞。随后分析从这些芯片获得的数据，优选地使用配对T 检测、关联性分析或相似的方法，以识别特定基因，在生长在薄基质 和厚基质上的细胞之间该基因的表达不同。本发明的方法包括识别调 节细胞表型的治疗或治疗靶点。表型可以是衰老的或入侵性的表型。 需要的表型基于需要的治疗效果，例如入侵性表型可能对特定治疗更 加敏感，而衰老表型可能对治疗产生抗性，但转移的可能性降低了。 将转移最小化可与手术或其它癌症治疗结合使用。
本发明的具体实施方式
包括用于肿瘤组织和/或细胞的标准化组 的分析的其它方法，潜力抗癌试剂的功效可以针对其进行评价。 一些 这样的组包含从患者肿瘤切下的活体组织而其它组包含在底物上或悬 浮液中生长的培养的肿瘤细胞。改进的肿瘤组可以通过使用本发明的 设备和/方法生长必要类型的肿瘤细胞构建。在某些方面，肿瘤组对环 境更具代表性，在其中发生体内肿瘤生长且因此提供了对抗癌试剂的 功效更实际的评价。这些改进的组和包含肿瘤组织的组相比提供了更 明确的和受控的环境且因此促进了比较性评价。在薄基质上生长的入 侵性肿瘤细胞比在厚基质上生长的相同细胞对抗癌试剂的作用更加敏 感。因此，针对在薄基质上生长的入侵性细胞测试的试剂的表观功效 将被人为地提高。相反地，在厚基质上生长的肿瘤细胞的入侵性行为 比在薄基质上生长的相同细胞的入侵性行为少。这可以掩盖待测试剂 的功效。如果以本发明具体说明的方式将在薄和厚基质上生长的细胞 作为参考材料，可以进行更准确的测试。
在进一步具体实施方式
中，方法包括对液体悬浮液中的样本细胞 的直接利用而不需要首先将细胞转移至固体底物上。本方法包括培养 来自或并非来自患者样本的细胞。如果在单层培养中生长细胞或细胞 被包括在活检或其它肿瘤样品中，可以机械地收获细胞。通过离心沉
淀细胞。将细胞沉淀物重悬于合适的缓冲液；在室温培养合适的时间； 沉淀；并重悬。将碘化丙啶加入一份这样的悬浮液中。将Alu I限制 性内切酶加入存留的细胞悬浮液中且在将该制备放置在37°C。在不同 时间，例如在加入ALU 0 (基线)、1、 3和5小时后取等份的混合物 用于评估。将碘化丙啶分别加入这些经消化的样品。根据标准方法使 用FACS分析或相似方法分析生成的经消化和染色后的细胞悬浮液。在 通透后用PI处理而没有用ALU消化的一份细胞悬浮液作为处理开始前 的各细胞制备中存在的DNA量的参照。
据预期，在此所述的任何方法或组合物可以参考在此所述的任何 其它的方法或组合物实施。
当在权利要求书和/或说明书中结合术语"包含"使用时，单词"一" 可以表示"一"，但也和"一或多"、"至少一"和"一或多于一" 的意思一致。
在权利要求书中术语"或"的使用被用于指"和/或"，除非被明 确说明仅指替换或替换是相互排他的，尽管本公开物支持仅为替换和 "和/或"的定义。
本发明的其它目的、特征和益处将通过以下具体说明变得明显。 但是，应当明白尽管指示了本发明的特定具体实施方式
，具体说明和 特定实施例仅作为说明提供，因为通过该具体说明，在本发明的精神 和范围内的各种变化和改进对本领域技术人员而言将变得显而易见。


以下附图构成本说明书的一部分且被包括以进一步说明本发明的 某些方面。通过参考一或多幅这样的附图结合在此提供的特定具体实 施方式的具体说明将可以更好地理解本发明。
图1A-1C、图1A显示了生长在胞外基质蛋白上的高度入侵性MUM2B 细胞。基质蛋白的厚度从左边(箭头标记)的大约35 nm (吸收蛋白) 变化至右边(长箭头标记)的大约lmm。在高达大约50微米(黑线的 左侧)的基质厚度上，细胞形成随机的单层聚集物。在大约50至150 微米之间(选中标记)的基质厚度范围内，细胞形成模拟肿瘤血管化 的束状结构。在大约150-250微米以上的厚度，细胞形成圆柱状或球 状肿瘤巢，其周围由重塑的基质蛋白包围。图1B显示了在相似基质梯 度(厚度向右增加)上生长的非入侵性OCM-la细胞。这些细胞在基质 蛋白的所有厚度形成离散的随机聚集物。图1C显示了非进攻性细胞在 任何厚度的基质上形成球状。
图2A-2D、图2A显示了在大约35 nm厚的吸收的层粘蛋白的均一 层上沉积的大约IOO微米厚的数字"3"形状的层粘蛋白基质蛋白的亮 场图像。MFC-10A乳腺癌细胞被均匀地沉积在整个区域上并用DNA酶消
化。图2B显示了该相同区域在用DNA染料溴化乙锭染色后的荧光图。 细胞DNA在最厚的基质蛋白的定位是明显的。图2C和2D显示了逐渐 提高的放大倍率下图2B中显示区域的中心部分的图。生长在薄基质上 的细胞未受到DNA酶作用的影响。在细胞周围的吸收基质蛋白区的小 荧光物体是在细胞中的DNA被DNA酶处理后留下的核仁。
图3、该图显示了由基质材料线组成的芯片的"楔"或"梯度"形 状，基质材料具有从大约35 rnn (通过从溶液中将蛋白吸收到玻璃上形 成的膜的厚度)到大约l mm的厚度。
图4A-4E、图4显示了与图3中相似的芯片的一部分，除了基质线 以栅栏模式排列。线是纤连蛋白或胶原蛋白且方块是层粘蛋白。图4B 和4C显示了在该芯片上的进攻性MB231细胞且图4D和4E显示了相同 芯片上的非进攻性MCF10a细胞。两组细胞已经用ALU处理60分钟。 每对中的上图是相位对比而下图对是用溴化乙锭染色后的荧光图。在 厚(1 mm)层粘蛋白上的进攻性细胞保持完整而在纤连蛋白或胶原蛋 白上的进攻性细胞和在两种基质蛋白上的非进攻性蛋白被严重降解。
图5A-5H、图5A、 5C、 5E和5G显示了在相位对比中成像的细胞而 图5B、 5D、 5F和5H显示了在溴化乙锭染色后荧光成像的相同细胞。 图5A、 5B、 5E和5F是对照，显示了在分别经过30和150分钟消化后 的细胞。图5C、 5D、 5G和5H显示了在经与相应对照相同条件下消化 前经实验聚胺抗癌药物处理大约15分钟的细胞。在两种情况下，聚胺 稳定了 DNA免受降解。
图6A-6C、显示了纤维原细胞(图6A) 、 OCMla (图6B)(弱入侵 性黑素瘤)和MIM2B (图6C)(高度入侵性黑素瘤)在与MSP I培养 24小时后的敏感性的研究。注意到纤维原细胞核在24小时内完全消 化。OCMla细胞核显示了一些局部残留染色，而固M2B细胞核呈现了 完全的稳定性和对甲基化特异性酶的屏蔽。
图7A-7B、图7A显示了 WI-38纤维原细胞(正常细胞)；0CM1 (弱 入侵性原发眼色素层黑素瘤)；M619 (高度入侵性原发眼色素层黑素
瘤)和而M2B (高度入侵性转移性眼色素层黑素瘤)在暴露于Alu I 限制性内切酶1、 3和5小时并随后用PI染色后测量的流式细胞计数 荧光强度直方图。图7B显示了各时间点的荧光强度的组合。
具体实施例方式
如在此所述，本发明的具体实施方式
解决目前的诊断设备、组合 物和方法的各种局限性。本发明涉及检测和/或确定细胞的入侵性和区 别细胞入侵性之间的差异的组合物、方法和/或设备。在某些具体实施 方式中，本发明涉及评估细胞之间、细胞和基质之间的相互作用的设 备和方法，其中作为这些相互作用的结果形成的细胞分布模式是细胞 和细胞混合物、组织、器官和其它生物学样品的一或多个细胞的入侵 潜能的指示剂。此外，这些设备和方法可以提供对入侵细胞的转移的 优选位点的指示；用于这些细胞的的抗癌药物的功效的指示；以及试 剂促进和增强肿瘤生长或转移的潜力的指示。
和本发明相反，目前用于癌细胞研究的细胞培养方法是基于悬浮 液中的细胞生长或不允许超汇合生长，作为固体支持物上的单层生长。 当按照可接受的操作进行时，悬浮培养物基本上仅允许细胞通过细胞-细胞相互作用和其它细胞贴附。在这些条件下，正常细胞或低入侵潜 力的癌细胞易于形成有由分离的细胞组成的悬浮液而在相似条件下培 养的高度进攻性的癌细胞能够形成显著体积(直径为毫米)的细胞聚 合物。
单层细胞培养允许细胞-细胞和细胞-底物相互作用。为了鼓励单 层细胞生长，接受的操作是将厚度为数百纳米的血清蛋白层吸收至固 体支持物上。该蛋白层促进细胞对固体支持物的贴附，而由于具有仅 为细胞厚度的小部分的厚度，其将贴附的细胞限制在个平面中。在这 些条件下，观察到的细胞生长模式是生长的细胞类型所特有的。替换 的但较不常用的方法通过Chemicon International (Temecula, CA) 投放市场的"体外血管新生分析试剂盒(In-Vitro Angiogenesis Assay
Kit)"说明。在该方法中，细胞以一定方式生长在相对厚的凝胶状细 胞培养基层(典型地超过1 mm)上，该方式与微生物细胞培养的方式 相似。这些细胞类型例如用于参考的血管新生分析中的细胞类型在凝 胶的表面生长而其它能够穿透凝胶和在凝胶的内部生长。再一次地， 观察到的生长模式是细胞类型的功能。
已知细胞通过不同家族的细胞表面蛋白例如"整合素受体"彼此 发生相互作用和与胞外基质发生相互作用。进一步已知细胞可以在它 们的细胞骨架中产生机械张力且该张力能够产生施加在细胞和胞外基 质之间的牵引力。这些力的调制可以引起细胞改变形状并在生长和分 化之间转换。该转换行为暗示着细胞表面和胞外基质的机械相互作用 与胞内功能例如基因表达和细胞周期进程之间的关系的存在。根据本 发明的一个观察是该关系似乎存在着显著的机械成分，因为人工施加 到细胞表面整合素受体的机械力造成了细胞核和胞质细胞形态的即刻 变化，该变化与在生物学条件下观察到的相同。
根据本发明的第二个观察是细胞及其集合的形态学即使不受到与 细胞接触的胞外基质的性质和厚度的控制，也受其强烈影响。与之相 关观察到该影响由细胞是否是癌细胞调节；由细胞的入侵程度调节； 以及由可能与待研究的细胞相接触的其它细胞调节。进一步观察到很 多这样的相同的形态学变化由去核细胞(细胞质)实现。
在本发明中，己经确定在厚度居于以上说明的厚度之间的胞外基 质层上生长细胞产生相对独立于细胞类型的细胞生长模式，但该模式 强烈地依赖于细胞的入侵潜力。对于该目的，可以定义三个不同厚度 的方案。吸收在固体支持物上的血清蛋白层，包括但不限于胞外基质 胶原蛋白和层粘蛋白，典型地具有小于数百纳米的厚度。生长在这些 层上的细胞似乎未穿透该层也似乎没有重塑它们中发现的胞外基质蛋 白。在厚度大于50微米但小于IOO微米的胞外基质(薄基质)上生长 的细胞能够穿透和重塑基质蛋白层，但没有被包埋在其中。在大于大
约100微米的厚度的层上，细胞能够穿透、重塑并被包埋在基质蛋白中。
除了正常血管内皮细胞的例外，当在吸收于固体支持物上的血清
蛋白或在厚度范围在小于50微米至大于1000微米的胞外基质层上生 长至少于汇合密度时，正常细胞和低入侵潜力的癌细胞形成包含少量 细胞的簇。甚至在细胞生长因子的饱和浓度的存在下或在缺氧条件下 生长时，这些细胞没有显示出可识别的细胞分布模式。在吸收的血清 蛋白上生长至汇合密度的正常血管表皮细胞形成典型的"鹅卵石"单 层。这些正常的表皮细胞当生长在薄基质上时形成明显的束状结构且 当生长在厚基质上时形成这些束的网络。通过向培养基中加入抗血管 新生试剂例如药物TNP-470 (烟曲霉素的衍生物)可以预防这些血管束 的形成，这些血管束被认为是血管形成的前体。
以相似的方式，当在吸收的血清蛋白上生长至亚汇合密度时，高 度进攻性的癌细胞也形成了没有可识别模式的聚集物。但是这些聚合 物比当正常细胞和/或非进攻性癌细胞在相同条件下生长时观察到的 聚合物大。当在薄基质上生长时，进攻性癌细胞形成束状结构，该结 构在外表上与正常内皮细胞在同等条件下形成的结构相似。这些束由 被重塑的基质蛋白包围的癌细胞组形成且能够短距离传导液体。但是， 由于通过向培养基中加入抗血管新生试剂不能抑制它们的形成它们不 是生血管性的，且没有证据证明它们能够成熟成为血管。这些束被描 述为呈现出"血管生长拟态"。在厚基质上，进攻性癌细胞形成由肿 瘤细胞组成的球体至圆柱体肿瘤"巢"，肿瘤细胞被包埋并封闭在高 度重塑的基质蛋白的复杂网络中。当垂直于基质层平面观察时，这些 巢似乎是由明显的"环"模式界定的细胞簇，其由肿瘤细胞和胞外基 质的混合物组成。在肿瘤活检样本中观察到相似的环模式且该模式与 高度入侵性的和转移性的癌症的存在相关。
癌细胞形成的模式基本上不依赖细胞类型，除了依赖于细胞类型 在入侵潜力上的差异程度。在细胞生长要求的限度内，这些模式也不
依赖于各种细胞生长因子、氧压力和与细胞培养过程相关的相似因子。 由正常的和非进攻性癌细胞产生的模式不受到由进攻性癌细胞产生的 可溶性因子的影响。在以下讨论的一些限制内，正常的、非进攻性的、 进攻性的细胞的混和培养物中的各亚群独立于混合物中的其它细胞类 型生长和形成模式。在本发明的上下文中，已经确定，在所有的评估 的基质蛋白中，只有纤连蛋白和高度变性的I型胶原蛋白不支持入侵 性细胞特有的生长模式的形成且不保护在这些基质上生长的细胞的染
色质免受核酸酶例如DNA酶的消化。这允许使用这些基质材料作为"阴 性"对照，特别是在诸如药品评估的应用中，其中多类基质材料被使 用。基质材料可包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白、透明 质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸蛋白聚糖、纤 维蛋白、弹性蛋白、肌腱蛋白或它们的组合。制备基质的各种材料是 本领域己知的且可与本发明结合使用。
在癌症于厚基质或组织中形成环模式的倾向与由于肿瘤转移的消 极预后或结果之间已经建立了紧密的临床关联。在该背景下，相关地 注意到进攻性癌症形成这些环模式的能力依赖于癌症和胞外基质的类 型。例如黑素瘤的转移表型很容易在厚胶原蛋白层中形成环模式，胶 原蛋白是在原发瘤形成的典型位点的胞外基质的主要组成，且在肝的 厚胞外基质层中形成环模式，这是黑素瘤转移的优选位点，但较难在 骨的厚胞外基质层中形成环模式，这是黑素瘤转移的第二位点。类似 地，首先转移到骨的前列腺癌的转移表型易于在该型基质中形成环模 式。相反地，通常不转移到胶原蛋白富集位点的乳腺癌在厚胶原蛋白 层中不形成环模式。换句话说，支持环模式的形成的基质类型暗示了 转移癌症的靶位点。相关的，至今还没有可能诱导任何癌症类型在厚 纤连蛋白基质上形成环模式。该观察的临床重要性还没有确定，但在 基于胞外基质的细胞模式的形成的分析中纤连蛋白似乎可以作为阴性 对照。
当正常的、最低入侵性的和高度入侵的细胞混合物在相同的薄或 厚基质上一同生长时可以证实本发明的相关方面。具体地，正常的和 最低入侵性的细胞可以相互接触共同存在延长的时间期间，但高度入 侵细胞对正常的和最低入侵性的细胞是高度细胞毒性的和细胞裂解性 的并且在典型的细胞培养条件下在接触的1小时内杀死这些细胞。该 行为仅在细胞-细胞接触的条件下呈现。换句话说，高度入侵细胞裂解 和杀死与它们接触的正常和最低入侵性细胞，但对不存在物理接触的 这些细胞没有明显的作用。例如，从肿瘤样本获得的并加在生长在薄 基质上的正常细胞层上方的细胞分散液将在存在肿瘤的进攻性细胞的 位点穿透并裂解正常细胞层，但在正常和/或非入侵肿瘤细胞存在的位 点没有作用。通过使用本发明可以检测和评估细胞-细胞接触的这些效 应。
可以使用本发明筛选具有功效的化合物例如抗癌药物或相反地， 筛选具有促进或提高癌症进攻性的能力的试剂。在此前的例子中，在 于厚基质上培养细胞之前用待评价的化合物或药物处理进攻性癌细胞 并确定药物治疗是否抑制环模式的形成。相反地，通过用试剂处理基 质上的正常或最低入侵性细胞并观察产生的细胞模式的变化可以评价 疑似促进或提高细胞进攻性的试剂。以相似的方式，通过将用待测药 物或试剂对合适的细胞类型的处理产生的模式与用相同的药物或试剂 对从相同细胞类型制备的细胞质或去核细胞的处理产生的模式进行比 较，本发明可被用于确定抗癌药物或疑似试剂的作用是否作用在细胞 核和/或细胞质水平。
本发明的另一方面是为了根据在各种厚度的胞外基质上形成的形 态模式区分正常的、最低入侵性的和高度入侵性的细胞，不需要细胞 核或基因转录。特别地，当接种在胞外基质层上时，由正常和最低入 侵性细胞类型的去核制备的细胞质形成分离的细胞质簇而来自进攻性 细胞的胞质形成束状结构，该结构与完整的进攻性细胞在薄基质上形
成的结构很相似。但是，没有观察到去核的高度入侵性细胞在厚基质 上形成环模式。
注册于2004年6月7日题为Quantitative Chromosome Stability Assay的待审专利申请序列号10/862, 235说明了根据染色质对核酸内 切酶、核酸酶和/或与蛋白酶的组合的消化的敏感性差异区分正常和癌 细胞的方法，该申请文件在此被完整参考引用。特别地，核酸酶DNA 酶优先降解正常和非入侵性细胞的染色质而保持入侵性细胞中的染色 质基本完整。用于分析的细胞可以在悬浮培养物中或作为包被了吸收 血清蛋白的固体支持物上的单层培养物生长。
相对于在相同条件下在吸收在底物上的血清蛋白上或在悬浮液中 生长的细胞，在胞外基质上生长的细胞中，细胞染色质对DNA酶消化 的敏感性被进一步地降低。在本发明中，该提高的差异敏感度被用于 区分基质上和基质外的正常和入侵性细胞。例如，用DNA酶处理Triton X-100通透化的细胞1小时降解在血清蛋白上的正常和入侵性细胞以 及在基质上的正常细胞的染色质，但保持了生长在基质上的入侵性细 胞的染色质的完整。对条件例如DNA酶的浓度和暴露的时间的调节实 现更精细的区分例如在于基质上形成降解抗性的束结构的中度入侵细 胞和形成肿瘤巢和环模式的甚至更降解抗性的高度入侵细胞之间进行 区分。当捕捉和评估本发明产生的细胞模式时，该特征，特别是与用 核酸染料对DNA酶消化后的细胞进行随后的处理相结合时，提供了信 噪比的显著增强，核酸染料例如但不限于溴化乙锭、阿霉素或双苯甲 酰胺。
正常/非入侵性细胞和入侵性细胞之间以及在血清蛋白上生长的 细胞与在基质上生长的细胞之间在对于核酸酶、核酸内切酶和/或与蛋 白酶的组合的消化的染色质的稳定性上观察到的差异强烈地暗示在这 些细胞类型和生长条件之间存在染色质屏蔽和基因表达的显著差异。 指向该相同结论的另一指示是基于使用"基因阵列芯片"对基因表达 的评估。在两表型之间比较基因表达显示了 1081个差异，其中在基质
上生长的M-619细胞相对于在吸收的血清蛋白上生长的相同细胞，其 546个基因被上调且535个基因被下调。表达模式的其它变化可以显示 在正常的、最低入侵性的和入侵性的细胞之间；显示在不同基质蛋白 层上生长的细胞之间；且显示在分离的细胞和与其它细胞接触的细胞 之间。
注册于2004年6月7日题为Quantitative Chromosome Stability Assay的待审专利申请序列号10/862， 235公开了可与本发明结合使用 的方法，该专利文件在此被参考引用。定量染色体稳定性分析基于染 色质对某些核酸内切酶、核酸酶和蛋白酶的消化的敏感性，这反映了 包含或提供染色质的细胞的入侵程度。
发明人假设在更具入侵性的细胞的整个基因组中甲基化通常可以 在更高级的染色质结构水平上增加。典型地，特定基因的甲基化可以 使用MSP PCR使用一些分子"试剂盒"检测，这些试剂盒可以从不同 公司获得，例如，Serologicals公司(Norcross， GA) 、 0ncoMethylome Sciences S. A. (Durham, NC)等。例如，Qiagen (Valencia, CA) 已经开发了 MSP PCR将甲基化特异性PCR用于数个特定启动子。根据 权利要求，这些启动子的甲基化特异性PCR实现了对DNA的GC富集区 的DNA甲基化模式的精确扫描。据推测启动子区域的过甲基化常常是 人癌症中肿瘤抑制基因失活的决定性因素。
但是，至今绝大多数被识别的肿瘤抑制基因仅在连锁研究成为可 能的家族性癌症中被识别。根据NCI的"癌症发生列表"，这些癌症 的发生为所有癌症的大约1%。这意味着99%的癌症没有可被检测甲 基化的标记基因，这也是为什么MSP PCR工业、研究人员和专家一致 认为前方的挑战是识别主要偶发性癌症中的重要基因，这些癌症中连 锁分析是不可能的，例如偶发性乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌和 大多数其它癌症。甚至在肿瘤抑制基因已被识别的家族性癌症，绝大 多数作者将被测试的靶基称为"推定的肿瘤抑制基因"。
由于这些困难，发明人已经开发了分析，该分析在裂解的细胞膜 型、在使用流式细胞计数的分析中、以及在与帕氏涂片相似的涂片制 备中在正常生理离子条件下进行细胞群的染色体测试。该测试基于细 胞作为完整的机械单元，其遗传屏蔽和暴露不仅由组蛋白八聚体或拓
扑异构酶(Maniotis等,1997; Bojanowski 1998)的水平控制，而且 由更高级的染色质结构水平控制(Karavitis等，2003; Maniotis等， 2003)。通过测试Alu、 Eco RI、 Mbo、 PST-1和其它特异性和非特异 性核酸酶和蛋白酶，本发明人已确定当细胞增加它们的入侵行为时以 及当细胞与特定的基质分子和基质厚度相关时，富含二硫键的蛋白差 异性地屏蔽Alu序列。此外，细胞依赖于它们的细胞骨架组织差异性 地屏蔽Alu序列。
作为增加入侵和恶性行为的细胞内的细胞核的一般性质，测试MSP I消化敏感性或消化不敏感性。如以下所述，这些研究的结果显示甲基 化位点的屏蔽和暴露在更高级的染色质折叠水平发生，且不仅仅在特 定的推定的癌症基因或基因序列水平发生。
I、基质材料
某些胞外基质材料例如胶原蛋白、层粘蛋白和纤连蛋白可以获自 商业来源的各种类型、形式、级别、纯度和模式的制剂且可被用于本 发明的操作中。其它胞外基质材料可以通过本领域已知的方法制备， 一般性的示例方法见美国专利6， 372， 494、 5， 830， 708和5， 162, 114， 各专利在此被参考引用。基质材料可以包括蛋白质的(例如胞外基质 材料)和非蛋白质的材料，或它们的组合。基质材料可以包括但不限 于胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、软骨 素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸蛋白聚糖、纤维蛋白、弹性蛋白、 肌腱蛋白、肌动蛋白、钙粘蛋白、IC扁s/VCAMs、整合素、驱动蛋白、 分区蛋白、微管相关蛋白、肌球蛋白、神经丝蛋白、profilactin、微 丝结合蛋白(profilins)、粘附因子(pronectin)、选择素、凝血
因子、肌钙蛋白、微管蛋白、维生素、玻连蛋白或它们的组合。基质 材料指对置于其上的细胞提供至少物理支持且可以包括对生长和其它 生命过程的生理支持的基质材料。例如，肝组织的胞外基质可以如下 制备。用冰冷的去离子水或双蒸水洗涤新鲜的肝组织；切成小片段(大
约I,3);并在0.02M磷酸缓冲盐溶液(PBS)p^7.3 (0.5mMNaH2P04、 1.9 mM Na2HP04、 17.9 mM NaCl)悬浮和匀浆。产生的悬浮液在4 °C 静置5分钟后以2500 XG离心5分钟。通过具有0. 22微米孔径的膜 滤器过滤回收包含肝胞外基质蛋白的上清液并储存在一4'C。来自其他 组织的胞外基质蛋白，例如但不限于淋巴结、胸腺外皮(thymic husk)、 骨、大脑和肺，可使用相似的方法和/或本领域己知的对应的方法分离。
II、设备制造
适用于本发明的设备可由一或多个限定组分和厚度的材料区域或 区组成，该材料被沉积或形成在底物上或底物内。在某些具体实施方 式中，这些设备包括沉积或形成在底物上或底物内的材料的多个区域 或区。各区域可以具有与相同底物上的一或多个其它材料区域相同或 不同的组分和/或厚度。在某些实施例中，各区域相互比邻是理想的。 在其它实施例中，各区域分开或由栅栏分隔开是理想的。
玻璃显微镜盖玻片组成一方便的用于制备本发明的设备的底物， 该盖玻片具有平、滑、厚度均匀、透明和相对惰性且具有能够方便地 结合和固定蛋白和细胞的表面化学性质的优点。硅板和特别是生长了 或沉积了合适厚度的氧化物、氮化物或其它包被的硅板是另一合适的 底物材料，尽管其具有不透明和高度反射可见光的缺点。相似地，聚 合物材料可被用于本目的，包括但不限于经配制没有任何填充剂、成 塑剂或其它添加剂的原始聚苯乙烯且已在一定条件下处理该聚苯乙 烯，使得聚合物中未反应的单体和低分子量寡聚体的量最小化。可以 进一步地包被、调节、改善或制备这些底物的表面以提高蛋白质贴附 和其它性质。在各种具体实施方式
中，通过使用制剂可以使得玻璃表
面没有有机污染物，制剂例如3份30X的H202与7份浓H2S(V混合。通 过制剂例如3份30%H20jQ 7份浓HC1或浓NH40H的处理，可以进一步 地处理表面以去除金属污染物并将玻璃表面置于疏水或亲水状态。可 以通过盐试剂例如氯化-二甲基-氨基丙基盐的处理进一步修饰这样的 表面。可以通过例如气体等离子体或电晕放电处理等方式相似地制备 聚合物表面。引用的底物材料和处理方法意在示范且不包含穷尽性的 或全面的列表。大量的其它的这样的材料和方法是本领域技术人员己 知的且在不背离本发明的精神的情况下可被用于本发明的操作。
以相似的方式，存在且本领域技术人员已知大量的在选定底物上 或在其中沉积或形成基质蛋白区域或区的方法。如以上提及，厚度为 数百纳米的包含基质蛋白的蛋白层可被从蛋白溶液吸收至底物表面 上。这些吸收层本身可被用作底物，在其上细胞能够生长，且可被用 作促进其它随后沉积或形成的蛋白层的贴附的层。底物的整个表面可 通过方法例如浸渍、旋转包被或喷射包被由具有受控厚度的均一蛋白 质层包被，所有这些方法是本领域技术人员充分已知的。通过这些方 法形成的蛋白层的厚度是大量操作变量的敏感函数，例如但不限于蛋 白溶液的蛋白浓度、表面张力和粘度；底物的表面自由能；回收率或 旋转速度参数；环境温度和湿度；气流速度和分布等。形成的层厚度 可通过调节这些和相似参数和/或通过将多层相同或不同蛋白加至底 物上加以控制。
书写、喷涂和印刷方法，包括但不限于丝网印刷和"喷墨"印刷， 代表了另一类将基质蛋白区沉积到底物上或底物中的方法。作为该类 的实施例，使用"笔"可以在底物上"写上"大约10微米宽100微 米长20-50微米厚的基质区，通过微锻仪将精细的玻璃棒下方制成直 径为大约5微米的点来制备该"笔"。可以将该笔安装在显微操作器 中，浸入基质蛋白溶液中，且通过将笔尖与底物接触将贴附在笔上的 蛋白溶液转移至底物上并相对于底物以一定方式移动笔尖由此以希望 的模式将蛋白溶液加在底物上。可替换地，可以将理想体积的基质蛋
白质溶液液滴放在底物上且使用笔将该溶液在底物的理想区域上分 散。
这样的方法的另一个实施例利用一层柔性材料例如硅橡胶，其已 通过本领域技术人员已知的任何方法例如用微制造工具进行压铸形成 理想沉积模式的阴性图像。该层的图像表面可被浸入理想的基质蛋白 的溶液且通过将该层的图像表面与底物接触将附着在该层上的蛋白溶 液转移到底物上。在绝大多数情况下，适用于这些方法的"墨水"可
以通过将理想的基质蛋白溶解在溶剂中制备，该溶剂由含有0.15 M NaCl和0.002 M MgCl2的去离子水组成，该蛋白的浓度范围包括大约 0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9、或大约11、 12、 13、 14、 16、 17、 18、 19或20 mM间的所有中间值，且大约10 mM是大多数基质材料或 蛋白的优选浓度。例如，包括O. 5 raM至20 mM、 9 mM至20 mM、 9 raM 至ll mM和0.5 mM至ll mM的范围。通过这样的方法形成的蛋白层的 厚度是大量的过程变量的敏感函数，例如但不限于蛋白溶液的蛋白浓 度、表面张力和粘度；底物和笔尖或层的表面自由能；接触压力；书 写速率；环境温度和适度；气流速度和分布等。形成的层的厚度可以 通过调节这些和相似的参数和/或通过将多层这样的或不同的蛋白加 在底物上加以控制。
在底物上或底物内制备基质蛋白区的另 一类方法根据充分已知的 嵌刻或"刻蚀并填充"法。这样的方法制造出将在底物表面上或表面 中形成的模式的阴性凸版图像。随后该阴性凸版图像被填入基质蛋白。 在该方法的众多已知变化中的一个变化中，通过一定方法在柔性材料 例如硅橡胶上制造罩，方法例如将橡胶在带有理想模式的阴性凸版图 像的合适工具上压铸或根据理想的基质沉积模式切割硅橡胶层或在其 中打入洞。在支持材料例如开放式泡沬中固定基质蛋白也属于该类别。
可替换的形成这样的罩的方法是将理想厚度的光刻胶层加在底物 上且通过标准的光刻技术在光刻胶中形成理想的阴性凸版模式。术语 光刻胶通常指包含一些光化学活性聚合物(PAC )的粘性聚合物树脂(溶
液)，典型地这些聚合物通过暴露于光成为相对于洗涤溶液不可溶的 或可溶的。通过光刻胶的方法，选定的模式可以在底物上成像。没有 暴露于电磁辐射的正作用光刻胶区可通过洗涤程序被去除。液体光刻 胶例如用于半导体制造的或膜光刻胶例如用于印制电路板的制造的可 被用于该目的。光敏感的明胶的组合物例如用于体积和相位全息图的 制备的组合物可相似地被用于该目的，尽管在绝大所述这样的组合物 中优选的光敏剂二氯酸钾是细胞毒性的且必须在使用前从产生的罩中 完全去除。正作用光刻胶在该应用中是最方便的，因为它们帮助形成 多层结构，其中底物上基质的不同区具有不同的厚度。然而，负作用 光刻胶可以被类似地使用，但在不同层中的凸版区域位点上有一些限
制或必须有伴随步骤例如六甲基二硅氮烷(HMDS)或沉积的中间刻蚀 停止。在任何实施例中，根据具体光刻胶材料的特有的步骤使用、光 制模、显影和硬化的合适的光刻胶材料可以在底物上形成合适的罩用 于底物上基质蛋白模式的沉积。
制备用于该方法的另一个方法是使用本领域技术人员充分已知的 方法将合适的凸版模式压铸、制模、凹凸刻、雕刻、刻蚀或烫印进底 物的表面。这些方法与传统的嵌刻法最接近且实现了在这些底物中制 造出的基质蛋白图像的暴露表面存在于底物表面平面中的益处。潜在 有害材料的存在也被避免了。
通过上述的任何方法制备的底物可被用作压铸基质蛋白的模。当 罩的进入面具有存在于不同平面的图像时，在这样的实施例中，可以 通过将事先经计算的基质蛋白溶液体积合适地分散充填进腔来充填罩 的腔。该同样的方法可被用于充填进入面在单个平面中的罩的腔。在 该情况下，被分散的液体体积可足以完全地或部分地充填腔。部分地 充填腔可以使用具有单一厚度的罩创造出不同厚度的基质区。作为替 换，罩的整个表面可被基质蛋白溶液湮没由此充填所有的腔且通过使 用医用刀片的刮擦、旋转、倾析或相似方法去除多余溶液。
在注册于2003年11月19日的题为"Three Dimensional Multilayer Microstructure of Cells and Biopolymers Created by Microfluidic Layer—by—Layer Technique ，， 的美国专禾U申请 60/427， 646中说明了在底物上形成模式基质蛋白的另一方法。
通过压铸或添加在底物上， 一些基质蛋白形成直接适用于本发明 的稳定的胶。很多基质蛋白在诸如沉积或压铸的条件下不能形成足够 稳定的胶且可能例如当暴露于细胞培养条件时溶解。因此，在某些实 施例中可能希望将沉积的或压铸的基质蛋白在55 "C烘烤大约1小时 使得蛋白变性并使其不可溶且机械耐久。在将基质蛋白变性后，硅橡 胶和相似的罩可从底物上去除留下基质蛋白的分离的岛，它们被无蛋 白包被或血清蛋白包被的底物分隔。不破坏基质蛋白区，很难将光刻 胶罩，特别是那些使用负作用光刻胶形成的罩从底物上移除。在使用 设备期间，最好将这样的罩留在原位。如果将被去除的光刻胶合适地 暴露于高强度UV光使其可溶于合适的溶剂，可将一些正作用光刻胶， 甚至在硬烤后，从底物上去除而不破坏基质蛋白。
III、从组织的细胞制备
通过本领域技术人员已知的方法可以从组织例如肿瘤切片中分离 细胞(关于一般综述，见Freshney， 1987)。这些方法与说明用于从 肝分离胞外基质蛋白的方法总体上相似除了组织可以与含有蛋白水解 酶例如胰蛋白酶以破坏细胞-细胞相互作用的培养基培养或在其中匀 浆且在细胞沉淀而非上清液中发现理想的细胞。
可以根据本领域技术人员已知的方法进行细胞培养。在绝大多数 实施例中，合适的培养基由补充了 10%胎牛血清和在相关时补充了合 适浓度的细胞生长因子的DMEM (Walkersville， MD)组成，该细胞生 长因例如但不限于基本纤维原细胞生长因子、转化生长因子P、血管 上皮生长因子、白介素和被培养的特定细胞类型的正常生长可能需要 的其它类似的试剂。在某些具体实施方式
中，在用于本发明的操作的
细胞的培养中没有使用抗细菌或抗真菌试剂因为己知这些试剂干扰原
代细胞类型的分化。在由大约5% 0)2/平衡空气组成的大气中在37 °C 进行细胞培养。
IV、数据捕获&解释
通过本领域技术人员充分已知的显微成像方法可以视觉监测或作 为电子图像捕获生长和模式形成用于随后的定量分析，关于一般方法 见 Current Protocols in Cell Biology (2001); Murphy， Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (2001)。 用于视觉成像和显微图像捕获的一个合适的显微镜平台由Leica DM IRB倒立显微镜(Leica， Wetzlar,德国)组成，该显微镜配置了透射 光、相位对比、微分干扰对对比和放大率为20X、 40X和63X的落谢 荧光视觉和电子图像。显微镜平台还配备了将被成像的样本保持在任 何温度的设备，最通常在25 "C或37 °C，以促进在延长时间段中对反 应时程的监控。也可以使用相当配置的正立显微镜例如Leica LS或LB 型。
可以通过CCD摄像机电子捕获样本的图像并将其电子存储于计算 机存储器、磁性或光学存储介质例如CD-ROM或录像带中，摄像机配有 或未配有图像增强器。也可以进行其它方式的图像捕获和存储。可以 使用本领域技术人员充分己知的图像分析方法评估电子捕获的图像， 关于一般的方法见Current Protocols in Cytometry (1997)或 Digital Image Processing: PIKS Inside (2001)。例如，通过利用 自调节阈值设定方法将图像分成像素强度高于(推定的核)和低于阈 值的区域且随后确定以上各阈值区域的大小、形状和积分的像素强度 的平均值，可以完成染色质已被DNA酶消化并荧光染色和未被消化的 细胞之间的区分。这样的方法的很多可能使用的具体实施方式
中的一 个是使用DAGE MTI (Michigan City, IN)或Photometries (Tucson, AZ)冷却式CCD相机捕获样本的图像。使用包含在VayTek Microtome图
像恢复软件包(Vaytek， Fairfield, IA)中的约束迭代自动聚焦算法完 成自动图像聚焦。可以人工地定义感兴趣的区域且使用Scanlytics IPLab图像定量软件(Scanalytics， Fairfax, VA)确定这些区域内的 平均像素信号水平。也可以使用该软件进行常规的图像制备操作包括 但不限于像场平整；背景和"坏点"修正；以及固定的和/或自调节的 阈值设定。本领域技术人员已知更多精细的方法，例如但不限于像素 跟踪；形态学分析；模式匹配；关联性和类似算法的图像分析法，在 对本发明的具体应用合适时，可以有益地使用这些方法。
外源材料的存在，如普遍用于加强细胞、细胞组成物和细胞结构 在透射光、反射光和荧光显微镜技术中的可视性的染料，能潜在地干 扰细胞的生长。因为该原因，某些具体实施方案使用相位对比或其它 类似的成像形式，这些成像形式在细胞生长完成之前不需要使用这样 的对比增强剂以提高样本可视性和/或成像，在细胞生长完成时，用DNA 结合染料、染色剂或其它能够选择性地提高样本中染色质和其它材料 之间对比的试剂处理样本。例如，在本发明优选实施例的以下说明中 具体说明了荧光DNA结合染料溴化乙锭。本领域技术人员已知大量的 其它合适的荧光的、吸收的和其它类型的对比增强剂，例如见 Molecular Probes : Handbook ， 2003年9 月 7 日更新， probes.com/handbook，该手册在此被参考引用。在这些染料中，某些 荧光DNA结合剂对本发明中希望对DNA的存在量进行定量的某些具体 实施方式特别有益，这些染料包括但不限于T0-PR0、 Y0-Y0、 YO-PRO和 PO-PRO家族染料(Molecular Probes, Eugene OR)，它们特异地且以 化学计算量与DNA结合并且因为与DNA的结合荧光出现显著地增强。
本领域技术人员已知其它大量的合适的显微成像、图像捕捉和图 像分析方法。在此确认的方法为了示范性目的而不以任何形式限制或 约束本发明的范围。
一种分析染色和评价细胞DNA的方法是通过流式细胞计数法或激 光扫描细胞计数法。在更优选的具体实施方案中，对由定量的DNA染
料染色的细胞进行流式细胞计数。流式细胞计数可以使用本领域已知
的荧光激活细胞分选仪(FACS)进行。可以使用的典型的FACS仪器包 括FACS-Calibur (Becton Dickinson; Mountain View, Calif.)禾口 Coulter流式细胞仪(Hialeah, Fla.，美国)EPICS Elite 。定量可 以使用CellQuest (Becton Dickinson; Mountain View, Calif.)、 WinList (Verity Software House公司，Topsham， Me.) 、 Multicycle 软件(Phoenix Flow Systems, San Diego, Calif.，美国)和FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, Calif.)软件。
流式细胞仪测量与各细胞相关的发光物质的量以及其它参数并以 诸如直方图、点阵图或百分比表的形式提供结果。与各细胞相关的一 种发光物质的量可以与该细胞的其它性质进行比较，例如细胞群同样 已经暴露的另一种发光物质的量、细胞大小、粒度或固有的光发射。
当含有鞘液的细胞典型地逐个依次通过激光时，细胞暴露于不同 波长的光中。细胞仪检测到的各颗粒被称作一次"事件(event)"。 事件传递或散射入射光的程度提供了对该事件特征的度量，如相关发 光物质的特征。例如，该事件可以自发发光或可以发射由引入该事件 的荧光物质产生的荧光。这些物质的一个实施例是荧光DNA染料。荧 光发色团对特定频率的入射光产生响应，在已知频率发射光，该光被 例如细胞仪的光电倍增管(PMTs)检测。发射或反射光的强度被细胞 计数仪测量并储存。
细胞计数仪将发射数据编辑成直方图。直方图可以以一维的形式 报告。可替换地，该直方图可以和由其它入射波长产生的发射光的直 方图结合。这样的结合典型地以"点阵图(dot plot)"的形式报道， 其中在坐标图中对事件进行描点，且坐标图的轴对应于被测量的两个 参数。例如，可以将事件暴露于特定波长的入射光中并分析前向散射 和在另一波长的发射。
可以根据DNA含量对细胞群进行分类。在对应于细胞正常DNA含 量的碘化丙啶(PI)染色处将出现一个峰。在单倍体数目n的更高倍
数体处也出现峰，可能对应于多倍体或有丝分裂的细胞。峰或超出背
景的平台也可以发生在不对应于单倍体数目n的倍数的碘化丙啶染色 水平处。这些事件可能对应于那些对各种DNA降解剂敏感的细胞。可 以形成通道将落入不同DNA含量范围的细胞与具有不同DNA含量的细 胞区分开。
识别细胞DNA含量的其它方法使用定量DNA染料和组织化学法。 这些技术还可以与流式细胞计数分析相结合。例如，通过流式细胞计 数法，可以将某些细胞从其它细胞中分离。随后可以使用非流式细胞 计数技术分析细胞的DNA含量。
V、试剂盒和诊断
在本发明的各方面中，设计了用于诊断和/或检测细胞入侵性的试 剂盒。在某些具体实施方式
中，本发明设想了用于检测人组织样品或 活检中的细胞的细胞入侵性的诊断试剂盒。为了识别、分析或检测在 此所述的细胞入侵性，该试剂盒可以包含能够检测基质或细胞成分的 试剂。试剂盒的试剂可以包含至少一个底物，该底物在底物的表面或 其中具有一或多个基质材料的区域，区域内或区域间具有不同的厚度， 并且包含以下任意试剂培养基、缓冲液、免疫组织化学试剂、显微 镜试剂、抗体或抗原、或它们的组合。
在某些具体实施方式
中，该试剂盒也可包含合适的容器设备，该 设备是不与试剂盒成分反应的容器，例如印pendorf管、分析板、注 射器或试管。
该试剂盒可进一步包含说明书页，该页概述了分析的程序性步骤 并将遵照与在此说明的或普通技术人员已知的基本相同的程序。
实施例
包含了以下的实施例以演示本发明的优选具体实施方式
。本领域 的技术人员应当认同在以下实施例中公开的技术代表了在本发明的操
作中运作良好的技术，且因此可被认为构成了该操作的优选模式。但 是，本领域的技术人员在本发明公开内容的启发下认识到在不背离本 发明的精神和范围的情况下，可以在公开的各具体实施方式
中进行很 多改变且仍能获得相同或相似的结果。
实施例1
设备构建-离散的高度
适用于本发明的操作的设备可以由限定组分和厚度的材料的一或 多个区域或区组成，该材料被沉积或形成在底物上或底物中。在某些具体实施方式
中，这样的设备包括沉积在底物上或底物中的材料的多 个区域或区。各区域可以具有与相同底物上的一或多个其它材料区域 相同或不同的组分和/或厚度。在某些实施例中，希望区域彼此相邻。 在其它实施例中，希望区域间隔开或由栅栏分开。这样的方法的实施
例包括但不限于使用SU-8/250负光刻胶(Microlithography Chmical 公司)制造的罩，该罩可如下制备在200 。C将适当清洁的底物去水 1小时并在干燥空气中冷却至室温。随后将底物装入板涂布机的卡盘 中；合适体积的SU-8光刻胶被静止地沉积在底物的中心并允许其扩散 25秒；并随后以850 RPM旋转15秒。光刻胶包被的底物随后在95 °C 被软烤至少6小时；通过负光罩暴露于通量为20 J/cm2的UV光11秒； 在95 'C硬烤15分钟并在SU-8显影液中显影。可以使用该光刻胶以该 方式制备厚度达300微米的单层罩。其它光刻胶或相同光刻胶的多种 应用可被用于制备更厚的罩以及其中图像具有不同控制深度的罩。
实施例2 设备构建-梯度
在某些实施例中，区内的基质蛋白厚度以连续的方式在最小值和 最大值之间以连续的方式变化是方便的或理想的。通过按照上述的任 何嵌刻步骤但改进步骤使得底物以相对于水平面某一角度被支撑以在
底物表面上形成基质区可以最方便地实现这一点，该角度经计算可以 在该过程的变性烘烤步骤中产生理想的厚度梯度。可替换地，通过在 添加基质蛋白之前压铸、制模、凹凸印、雕刻、刻蚀或烫印可以在底 物中形成理想的厚度梯度。
实施例3细胞入侵性的确定
通过将各条线压铸入上述硅橡胶罩的开口中，将由两组胶原蛋白 基质蛋白的两条平行线组成的设备制作在玻璃显微镜盖玻片上，各条
线在100微米的中心延伸大约10微米宽，100微米长。通过调节沉积 在罩的开口内的基质蛋白溶液的量控制组成各条线的基质材料的厚 度。在55 "C退火1小时后，两组平行线分别具有大约30微米(薄基 质)和200微米(厚基质)的基质蛋白厚度。在去除罩后，将具有基 质蛋白标记线的盖玻片置于塑料细胞培养皿的底上并用大约30 mL的 补充了 10%胎牛血清的DMEM细胞培养基覆盖。用微量吸管以大约每条 线10， 000个细胞的密度用非入侵性0CM-la黑素瘤细胞接种各组中的 一条线。以相似的方式，以相似的密度分别用M-619中度入侵性黑素 瘤细胞和MUM-2B高度入侵性黑素瘤细胞接种各组中的第二和第三条 线。同样的，邻近的线间空间被接种了 0CM-la、 M-619和MUM-2B细胞。 这些线间区域内的底物表面由从细胞培养基中吸收至底物上的血清蛋 白组成。通过在由5% C02/平衡空气组成的大气中在37 "C培养24小 时培养使接种在底物上的细胞生长。
在吸收的血清蛋白、薄基质和厚基质上的非入侵性0CM-la细胞的 相位对比图像显示这些细胞在所有三种条件下形成离散的小簇。在吸 收的血清蛋白、薄基质和厚基质上的中度入侵性M-619细胞的相位对 比图像显示这些细胞在吸收的血清蛋白上形成离散的细胞簇且在薄和 厚基质上形成束状结构。在吸收的血清蛋白、薄基质和厚基质上的高 度入侵性MUM-2B细胞的相位对比图像显示在吸收的血清蛋白上生长的 细胞形成离散的细胞簇，其具有比相同条件下生长的0CM-la或M-619
观察到的簇更大的尺寸。在薄基质上，细胞形成束状结构的网络而在 厚基质上，这些细胞形成包埋在广泛重塑的基质蛋白中的肿瘤巢且呈 现出与该型结构相关的环模式。
将具有吸收的血清蛋白和具有厚基质的底物区域之间的交界处的 M丽-2B细胞的相位对比图与该相同区域的荧光图相比在细胞被0.1
%的Triton X-100通透化3分钟；用DNA酶处理60分钟；并用核酸 染料溴化乙锭染色后显示在该处理后，在厚基质上的高度进攻性 MUM-2B细胞的染色质保持完整。大的、基本球状的、明亮染色的细胞 核意味着完整的细胞而在吸收的血清蛋白上的MUM-2B细胞的染色质被 降解成点状其中仅保持了核仁(图像中小的、明亮的光点)。在这些 条件下，无论细胞是否在基质上或吸收蛋白上，正常细胞、非入侵性 0CM-la细胞和中度入侵性M-619细胞的染色质被完全降解。减少用于 DNA酶消化的时间和条件的严格性允许染色质的维持，以从最稳定至最 不稳定细胞的接近降序的顺序排列基质上的入侵性细胞、基质上的 正常或非入侵性细胞、吸收蛋白上的入侵性细胞和吸收蛋白上的正常 或非入侵性细胞。
同样的，图1A显示了在胞外基质蛋白上生长的入侵性MUM-2B细 胞。基质的厚度从左侧的(箭头标记)大约35nm (吸收蛋白)变化至 右侧(长箭头标记)的大约1皿。在高度大约50微米(黑线的左侧) 的基质厚度上，细胞形成随机的单层聚集物。在大约50至150微米(选 中标记)之间的基质厚度范围内，细胞形成模拟肿瘤血管化的束状结 构。在大约150-250微米以上的厚度内，细胞形成圆柱形或球状肿瘤 巢，其周围由重塑的基质蛋白包围。图1B显示了生长在相似基质梯度 (厚度向右增加)上的非入侵性OCM-la细胞。这些细胞在基质蛋白的 所有厚度形成离散的随机聚集物。此外，图1C显示了在任何厚度的基 质上形成球状的非进攻性细胞。
图2A显示了在大约35 rnn厚的吸收的层粘蛋白的均一层上沉积的 大约100微米厚的数字"3"的形状的层粘蛋白基质蛋白的亮场图像。
MFC-10A乳腺癌细胞被均匀地沉积在整个区域上并用DNA酶消化。图 2B显示了该相同区域在用DNA染料溴化乙锭染色后的荧光图。细胞DNA 在最厚的基质蛋白的定位是清楚明显的。图2C和2D显示了逐渐提高 的放大倍率下图2B中显示区域的中心部分的图。生长在薄基质上的细 胞未受到DNA酶作用的影响。在细胞周围的吸收基质蛋白区的小荧光 物体是在细胞中的DNA被DNA酶处理消化后留下的核仁。
实施例4在混和的细胞培养物中检测入侵性细胞 入侵性的且因此癌性的细胞在细胞或组织样本例如可能通过活检 或相似方法从患者中获得的样本中的存在可以通过上述确定细胞入侵 潜能的方法确定，除了接种在设备上的细胞基质和吸收的血清蛋白区 上的细胞由通过细胞或组织样本的解离制备的细胞类型的混合物组 成。在低细胞密度下，其中由于最初接种在底物上的细胞的生长造成 的细胞间的细胞-细胞接触被最小化，接种在底物上的细胞类型混合物 中存在的各细胞类型的行为基本独立于可能存在的其它细胞类型。因 此，例如，中度入侵性细胞将在薄和厚基质上形成束状结构而高度入 侵性细胞将在薄基质上形成束的网络且在厚基质上形成具有相关环模 式的肿瘤巢。该行为可以在相同样本中从入侵性的并由此癌性的细胞 中区分出样本中正常的和非入侵性的细胞。通过根据前述的DNA酶消 化步骤确定组成混合物的细胞中染色质的敏感性可以进一步完善该区 分并进一步提高该确定的信噪比。尤其是，混和细胞类型在厚基质上 生长后对染色质的DNA酶消化和用核酸染料对染色质的染色提供了入 侵性(癌性)和正常细胞之间的明确的区分。
通过在允许细胞生长以相互接触时观察细胞的行为可以获得对样 本中的入侵性细胞的存在进一步的观察，该样本包括细胞类型的混合 物。例如在厚基质上，正常细胞和非入侵性细胞可以相互接触共存。 此外，正常细胞能够穿透非入侵性细胞层或簇，但非入侵性细胞很少 穿透正常细胞层或簇。此外，在厚基质上，正常细胞不和入侵性且特
别是高度入侵性细胞共存。特别地，当与入侵性细胞接触时，正常细 胞迅速(典型地小于1小时)裂解且被杀死。入侵性细胞可以进一步 轻易地穿透正常细胞层和簇，但正常细胞不能穿透由入侵性细胞形成 的结构。当细胞混合物根据本发明生长时，从产生的细胞模式中，这
些行为非常明显，且当通过前述的方法进行DNA酶消化和细胞染色质 的荧光染色提高这样的模式的信噪比时更加明显。
本方法的可替换的执行是在某些临床场合中的使用。在一可替换 执行中，对应于正常细胞类型的正常细胞单层在合适的条件下在薄或 厚基质上生长，该细胞类型组成临床样本获取的组织的类型。通过将 组成临床样本的细胞分散获得的一份混合的细胞类型随后如前述被以 低密度接种在正常细胞单层的上部并培养。在分散的临床样本中存在 的入侵性细胞将穿透并裂解它们接触的下方的正常细胞，造成了显著 的、易于识别的对单层结构的局部破坏。通过以前述方式对细胞染色 质的DNA酶消化和荧光染色提高了这些模式的信噪比。可能存在于分 散的临床样本中的正常和非入侵性细胞不会穿透和裂解正常细胞层且 因此不会破坏单层的结构。
实施例5转移位点
通过将各条线压铸进上述的硅橡胶罩的开口中将两个典型的设备 制作在显微镜盖玻片上，各设备包括基质蛋白的七条平行线，各条线 在IOO微米的中心延伸大约IO微米宽，IOO微米长。由此形成的各条 线由不同的基质蛋白组成，具体为纤连蛋白、层粘蛋白、胶原蛋白I 和从肝脏、骨、肺和胸腺外皮组织分离出的基质材料。通过调节沉积 在罩的开口内的基质蛋白溶液的量控制组成各条线的基质的厚度。在
55 'C退火1小时后，线具有大约200微米(厚基质)的基质蛋白厚度。 在去除罩后，将具有基质蛋白标记线的盖玻片置于塑料细胞培养皿的 底上并用大约30 mL适用于待评估的细胞类型的培养基覆盖。作为实 施例，用于黑素瘤细胞的培养基是的补充了 10X胎牛血清的DMEM，当
被用于乳腺癌细胞的生长时，该培养基进一步补充了基本氨基酸、表 皮生长因子和胰岛素。
T4乳腺癌细胞以大约每条线10， 000个细胞的密度接种在一设备 上的基质蛋白的各条线上，而MUM-2B黑素瘤细胞被相似地接种在另一 设备的基质蛋白线上，各设备被浸入如上所述适于各细胞类型的的培 养基中。在对产生的细胞生长模式进行评估之前，带有接种细胞的各 设备在5XC02/平衡空气的大气中在37 r下培养24小时。
没有细胞类型在纤连蛋白基质上形成肿瘤巢、环模式或束状结构。 T4乳腺癌细胞在层粘蛋白、骨、肺和胸腺外皮基质材料上产生了十分 明确的细胞模式，但在胶原蛋白和肝基质材料上没有产生除了聚集物 以外的明确的结构。MUM-2B细胞在除了纤连蛋白以外的所有基质材料 上形成十分明确的细胞生长模式且在肝基质上形成的模式最充分。这 些观察与己知的T4乳腺癌细胞首先转移至层粘蛋白富集位点随后二次 转移至肺和胸腺但不转移至肝的倾向一致且与MUM-2B癌细胞首先转移 至肝并随后转移至骨和其它位点的已知的倾向一致。来自其它癌症类 型的细胞相似地显示了对原发肿瘤形成和转移位点特征性的基质蛋白 的偏好。
通过将生长在不同类型的基质蛋白上的细胞用Triton-X100通透 化；用DNA酶处理细胞染色质；和用DNA染料例如前述的溴化乙锭对 细胞染色可以进一步表征肿瘤细胞的转移偏好和倾向。通过观察改变 消化试剂中的DNA酶浓度和将细胞暴露于DNA酶的时间对染色质降解 程度的影响可以预测生长在不同基质材料上的细胞对DNA酶的染色质 降解的相对敏感性。在该方法中，可以显示层粘蛋白基质上的T4乳腺 癌细胞、肝基质上的MUM-2B细胞和骨基质上的前列腺癌细胞中的染色 质和生长在其它基质材料上的相同细胞染色质相比对DNA酶消化具有 显著更高的抗性。
有时为确定转移偏好和倾向的优选的可替换设备的结构与上述结 构相同，除了用于基质蛋白区形成的罩材料被留在原位或通过前述方
法将基质蛋白包埋在底物体内而非在底物上形成。在任一情况下，基 质材料的暴露表面与周围的罩或底物材料共平面。这样的结构允许单 个体积的细胞悬浮液与存在于底物上的所有基质区的暴露表面接触且 当目的为筛选细胞混和群落中入侵性和转移性细胞的存在时特别方 便，例如通过对活检样本的解离获得的群落。按上述方式使用该结构 的设备除了有时为了限制接种在基质区上的细胞密度，希望在一定的 静置时间后但在培养开始前从设备去除残留细胞悬浮液。
实施例6药物评估
本发明的典型设备也可在临床和药物开发环境下用于筛选和评估 抗癌药物。尤其是，本发明的具体实施方式
可用于筛选若干抗癌药物 对多种癌症类型的功效并确定对患者的治疗最有效的抗癌药物或这些 药物的组合。通过下述方法说明这些应用。
如上所述通过将各条线压铸在硅橡胶罩的开口中，将包括四组胶 原蛋白或其它选定基质蛋白的两条平行线的设备制作在玻璃显微镜
上，各条线大约在100微米的中心上延伸IO微米宽，100微米长。通 过调节分散在罩的开口中的基质蛋白溶液的量控制组成各条线的基质 材料的厚度。在55 r退火l小时后，每组平行线中的一条线具有大约 30微米的基质蛋白厚度(薄基质)而该组中的另一条线具有大约200 微米的厚度(厚基质)。在将罩去除后，将带有基质蛋白标记线的盖 玻片置于塑料细胞培养皿的底上并用大约30 ml的补充了 10%胎牛血 清的DMEM细胞培养基将其覆盖。
使用微量吸管以每条线大约10， 000个细胞的密度用未处理的 MUM-2B细胞接种一组线中的薄和厚基质线并以面积比密度(大约 90，000个细胞)接种线之间的暴露的吸收的血清蛋白。以相似的方式， 分别用正常内皮细胞、用聚胺11157根据建立的处理方法处理后的 MUM-2B;以及以同样方法经聚胺11157处理的正常内皮细胞接种组成 第二、三、四组线的线和间隔空间。在该实施例中，聚胺处理的MUM-2B
细胞组成实验样品而加在其它组的线中的细胞作为对照。明显地，可 以增加底物上线的组数以接受重复的样品；另外的药物和处理方案； 另外的对照；和/或另外的癌症类型，只要使用的培养基与底物上待评 估的所有细胞类型的生长相容。通过在5XC02/平衡空气的大气中在 37 。C培养24小时(对某些其它细胞类型更长)，生长接种在底物上 的细胞。
通过任何前述的方法检测在基质线和间隔空间上产生的细胞模式 以确定化合物、药物或处理的功效。在抗癌药物、候选药物和处理方 案的情况中，通过相对于未处理的癌细胞对照，在实验样品中对束状 结构、肿瘤巢和环模式的形成的抑制表明功效。同时，有效的处理对 相同底物上的正常细胞对照的生长和行为没有影响。药物或处理在异 常细胞中降低染色质对DNA酶消化的抗性而不影响正常细胞对照的行 为的能力也可以成为药物或化合物功效的指示。筛选抗癌药物的该方 法是特别有益的，因为不像目前用于该目的的方法，本发明方法直接 解决了已知的事实，即已经形成肿瘤巢的癌细胞对抗癌药物的抗性比 在传统培养条件下生长的相同细胞多150倍。
该相同方法可被用于识别对特定患者特别有益的药物、药物组合 物或治疗方案。以所述用于药物筛选的相同方式实施该方法，除了通 过解离来自患者的含有癌症的活检样本获得使用的癌细胞且通过解离 获自相同组织或器官的正常细胞获得正常对照细胞。
该方法也可以相反方式被使用，其中实验细胞被暴露于待评估以 确定其促进或加强癌转化能力的材料。用于该目的的细胞将典型地为 正常的或最低入侵性表型。促进或加强癌转化的材料造成这些初始细 胞的一部分呈现与入侵性细胞表型相关的形态学特征例如束、束网络 和/或环模式的形成。该方法可应用与一些领域包括但不限于职业健 康、环境检测和生物学研究。
实施例7药物评估-细胞质
本发明的另一个新颖的方面是生长在基质蛋白上的细胞的形态学 在很多方面不受发生在细胞核内的基因表达和其它过程的控制，而是 由细胞质中的过程和事件控制。基于该观察，明确地区分例如药物的 行为成为可能，诸如区分影响细胞核内的过程的抗癌药物和影响细胞 质过程的药物。
细胞质和细胞核过程之间的明确区分需要从待评估的细胞中去除 细胞核。尽管可以通过微观手术完成，通过该方法获得足够数量的去 核细胞(细胞质)是劳动强度极大的和费时的。因此，己经开发了细 胞去核的批处理方法。在该方法中，待去核的细胞在包被了血清纤连 蛋白的玻璃显微镜盖玻片上生长至接近汇合。随后将盖玻片细胞一侧
向下置于含有10 mg/mL细胞松弛素B的50 mL离心管中并以8， OOOX G离心30分钟以迫使细胞核通过细胞膜移位。由此形成的细胞质仍然 附着在盖玻片上且可作为悬浮液回收或可通过将细胞质与基质蛋白接 触一段时间将细胞质直接转移到层粘蛋白或其它基质蛋白上。
当细胞质在基质上生长时，这种方法制备的细胞质基本上包含了 由母细胞表达的形态学。具体地，当在吸收在底物上的血清蛋白上生 长时，来自正常的、非入侵性的、中度入侵性的和高度入侵性的细胞 的细胞质形成离散的簇。当这些相同的细胞质在例如厚基质上生长时， 来自正常的和非入侵性细胞的细胞质形成离散的簇(或对于正常内皮 细胞形成鹅卵石状单层)，而来自入侵性表型的细胞质在厚基质上形 成束状结构。来自高度入侵性细胞的细胞质在厚基质上没有被诱导形 成肿瘤巢和环模式。为了区分待评估的药物的细胞核和细胞质效应的 目的，在上述药物评估测试中，细胞质可被直接用于替换完整细胞或 与完整细胞差异性地使用。
实施例8基于载玻片的方法
技术领域：
本发明的某些具体实施方式
包括基于载玻片的测试。基于载玻片 的测试的一个实施例包括获取测试样品(例如从它们的培养板中刮取细胞)；将样品悬浮在磷酸缓冲盐(PBS)中；将一滴细胞悬浮液滴在 层粘蛋白包被的载玻片上。加在包被的载玻片上的样品被允许空气干
燥(大约15分钟)。对干燥的载玻片进行ALU消化(大约15分钟)。 在消化后，用溴化乙锭对载玻片染色(l分钟)并在荧光下成像。除了 很迅速，该方法是标准"涂片"法(例如Pap测试)的改进，因为其 对于空气干燥的假相不敏感，该假相引起了标准方法中的主要问题且 使得使用防腐剂和固定剂成为必需。可替换的取样技术包括通过将载 玻片与组织区接触沉积细胞。脱落的细胞(这些细胞为感兴趣的细胞) 粘在载玻片上而绝大部分其它细胞不粘。
实施例9机械破坏的纤维原细胞
使用在此所述的组合物、方法和设备的另一实施例包括使用机械 破坏的纤维原细胞作为样品。当被消化和染色时，已经观察到被破坏 细胞中显著的百分比产生明显的"环"模式。被破坏的纤维原细胞可 被用作"反应的"和"修复的"细胞的模型。被破坏的纤维原细胞是 从物理损伤、感染等中恢复的正常细胞。在标准显微镜法和免疫化学 测试中很难将这些受损的纤维原细胞或与受损纤维原细胞相似的细胞 从异常细胞中区分出来。缺乏将进行修复过程的基本正常的细胞与异 常细胞加以区分的能力是假阳性的常见原因。在本发明的各种具体实 施方式中，反应的和修复的细胞被清楚地从异常细胞中区分。
实施例10反转形式
在本发明的另一方面中，基于载玻片的形式可被"反转"。艮P， 呈现出对在此所述的处理具有敏感性的细胞可以经这样的方式处理由 此敏感细胞将对处理不敏感且不敏感的细胞将对处理敏感。因此，该 方法的结果被反转。通过将巯基试剂例如DTT加入处理溶液可以产生 测试的反转。换句话说，如果设置常规测试使得异常细胞保持完整且
正常细胞被降解，加入DTT将逆转该结果使得正常细胞保持完整且异
常细胞被降解。
实施例11 MSP I消化
方法
用橡皮刮勺从塑料细胞培养瓶底物刮下人纤维原细胞、弱入侵性 人黑素瘤细胞(0CM-1)和高度入侵性人黑素瘤细胞(MUM-2B)以避免 EGTA对它们染色质结构的破坏，或胰蛋白酶对它们的糖萼的破坏。将 25 u L的各细胞胞桨的液滴置于玻璃载玻片上并放置30分钟至1小 时，直至含有液滴的细胞完全干燥。随后，将0.5 uL的MSP I加入 25 uL的DMEM或PBS液滴，且将25 U L液滴置于干燥的细胞斑点上， 且随后将载玻片置于密封潮湿的箱体内的37 "C培养箱中24小时。在 消化后，去除MSP I并用溴化乙锭取代，在落谢荧光显微镜下观察并 对斑点拍照。
结果
无论在MSP I中培养2、 4、 5、 6和24小时，对MSP I消化的屏 蔽似乎随着增加的入侵性细胞行为而增加。正常的基质细胞，例如纤 维原细胞和弱入侵性细胞或高度入侵性细胞相比以更大程度被消化。 典型地机械地获取细胞，因为在胰蛋白酶-EGTA溶液中对细胞的消化产 生对酶的非特异性的敏感且有时是完全不敏感。例如，当使用胰蛋白 酶EGTA时，无论细胞类型，和机械分离的细胞相比，细胞染色质对所 有限制性内切酶的消化稳定得多。大部分时间，细胞证实了敏感性的 顺序，正常细胞最敏感，弱入侵性细胞次敏感，且高度入侵性细胞如 果不是对MSP I和其它限制性内切酶完全不敏感，也是最不敏感的(图 6A-6C)。
从瓶中刮下细胞而非从瓶中EGTA-胰蛋白酶消化它们，典型地为了 两个目的服务1)预期在一转换的环境中使用MSP I消化，在该环境
中蛋白酶如胰蛋白酶通常不被且不能被用于从人患者体内获得细胞，
且2)避免使用试剂EGTA，该试剂通常被用于加速细胞从组织或组织 培养烧瓶中的分离。此外，用EGTA或EDTA去除主要离子如镁可以特 异性地破坏贴附受体的假设已经显得过于简单，因为这些螯合剂对染 色质组织和结构存在显著效应(Maniotis等，1997)的事实。使用EGTA-胰蛋白酶作为分离细胞的方法的实验已经显示，很可能由于EGTA的作 用，不同细胞类型对限制性内切酶消化的敏感性更加稳定，且由于胰 蛋白酶诱导凝集导致细胞聚集的差异。因此，为了提高潜在的临床应 用，并且为了避免改变染色质的组织构造，在没有蛋白酶消化或EGTA 存在时使用MSP I，取而代之的是简单地从其环境中将细胞机械地分 离，正如从患者体内将它们分离一样。
MSP I消化能够区分属于正常、弱侵袭性和高侵袭性细胞的细胞核 的事实暗示更高级结构的甲基化是重要的，且可能是调节细胞癌或非 癌状态以及细胞的甲基化模式的关键因子。因为消化是细胞类型特异 性的，而非基因类型特异性的，该分析能够潜在地从连锁群未知且家 族连锁没有建立的偶发性肿瘤(99% )以及其中可疑癌基因(p53、 p21、 眼癌(rb)等)被认为是重要诱因的家族性肿瘤(1%)中区分正常的、 低入侵性的和高入侵性的细胞。
实施例12评价入侵性肿瘤细胞的药物抗性
本发明的典型设备也可被应用于对入侵性肿瘤细胞的药物抗性的 评价中。此类的信息与用于对癌症治疗的治疗药物的选择、用于作为 抗癌药物的新化学卖体的评估以及其它相似目的相关。已知入侵性肿 瘤细胞形成"肿瘤巢"，该肿瘤巢由包埋在高度重塑的胞外基质蛋白 中的肿瘤细胞组成，且整个结构被表面类似但不是血管的输注管道包 围。肿瘤中这样的结构的存在与不理想的预后、对抗癌药物的抗性以 及高死亡率紧密相关。
在胞外基质蛋白的厚层上生长的入侵性肿瘤细胞在体外形成肿瘤 巢且可被用作评估抗癌药物对体内相似结构的功效的模型系统。通过
微注射进入肿瘤巢的窦状隙中的荧光染料德州红(Texas Red)的荧光 显微图像将典型地显示染料在肿瘤巢中的肿瘤细胞群之间的输注管道 中的移动。当中性荧光染料被加入包含肿瘤巢的组织或基质蛋白层而 非被注射进巢中时，该相同的输注模式是明显的。使用荧光标记的右 旋糖苷偶联物进行的相似测量显示高达至少2,000,000分子量的中性 分子能够进入并堆积在这些输注管道和相邻的细胞簇中。
当在胞外基质蛋白的薄层上生长时，肿瘤细胞，甚至是高度入侵 型的细胞不形成肿瘤巢。而是它们形成细胞簇或细胞层，没有输注管 道形成的迹象。在薄基质上生长的肿瘤细胞的细胞核被荧光DNA结合 染料例如双苯甲酰胺或抗肿瘤药物阿霉素快速且有效地标记。当相同 类型的入侵性肿瘤细胞在它们形成肿瘤巢的条件下生长且巢以上述方 式被暴露于DNA结合试剂例如双苯甲酰胺和阿霉素时，甚至在延长的 暴露后，仅在形成巢的肿瘤细胞簇的外周上的细胞核被染料标记。在 厚基质上体外生长且通过向培养基中加入双苯甲酰胺染色的入侵性肿 瘤细胞显示染色局限在形成肿瘤巢的各细胞簇的外周细胞的细胞核。 这些实验和其它相似的实验揭示极性试剂例如双苯甲酰胺和阿霉素被 系统性地排除在组成肿瘤巢的细胞之外而这些细胞是相似分子量的中 性分子可以进入的。
实施例1、 2、 3和5中说明的设备(以上)和可替换的方式和形 式例如在孔中包含合适厚度和组合物的基质蛋白的微滴定板可以有益 地使用于治疗试剂对顽固的入侵性癌症的功效的体外评价中。在这样 的设备中可以方便地将薄和厚基质层并列由此生长在薄基质上的细胞 作为生长在厚基质上的细胞的程序对照。在所有的情况中，来自患者 或其它来源的癌细胞在胞外基质的薄层和厚层上生长至某点，在该点 厚基质上的细胞形成肿瘤巢。随后将细胞暴露于治疗试剂，典型地通 过将试剂加入细胞培养基，且观察这样的暴露的结果。有效试剂将标
记生长在薄基质上的所有细胞且将穿透入在厚基质上形成肿瘤巢的细 胞簇。功效与增加的穿透性相关。通过在延长暴露与治疗试剂后观察 肿瘤巢的坏死和/或凋亡迹象可以获得功效的进一步的证据。通过将接
受治疗试剂处理的细胞以前述方式暴露于核酸酶例如ALU或DNA酶可 以获得功效的额外指示。
实施例13:对治疗干涉的靶点的识别
本发明的设备和方法可被进一步用于在癌症治疗中的治疗干涉的 潜在靶点的识别和用于直接导向这些靶点的治疗试剂的设计、开发和 评估。如同在此前的实施例中说明的，入侵性细胞中染色质对试剂例
如ALU的降解的敏感性和这些细胞对化疗试剂的抗性依赖于这些细胞 生长的胞外基质蛋白的组分和厚度。这些特征在某些测量中反映了细 胞内的基因组分和基因转录活性，这反过来暗示着治疗干涉的耙点。
作为实施例，使用诸如在此前的实施例1、 2和3中说明的设备， 在薄和厚基质上生长高度入侵性MUM-2B黑素瘤细胞。为了该实施例的 目的，优选地，但不是必需地，薄和厚基质区以及在其上生长的细胞 相互足够靠近以确保所有细胞在相同的环境中生长除了基质蛋白的厚 度或其它待评估的变量不同。生长在薄和厚基质上的细胞随后被分别 收获。为了避免常用于该目的的化学方法的使用例如用鳌合剂如EDTA 或EGTA或用蛋白水解酶如胰蛋白酶的处理可能伴随的假相，收获优选 地通过机械方式进行。随后为了根据芯片制造商规定的程序应用于"基 因阵列"芯片例如Affymetrix II微阵列(Affymetrix)，从薄和厚 基质收获的细胞被分别制备。随后分析从这些芯片获得的数据，优选 地使用配对T检测、关联性分析或相似的方法，以识别特定基因，在 生长在薄基质和厚基质上的细胞之间该基因的表达不同。
在一具体实施例中，在生长在薄基质和生长在厚基质上的MUM-2B 细胞之间大约1044个基因差异性表达。生长在薄基质上的MUM-2B细 胞差异性地表达各种蛋白，包括但不限于多种类型的细胞周期蛋白；
若干组蛋白；血小板反应素(thrombospondin);基质蛋白例如层粘 蛋白、胶原蛋白和纤连蛋白；以及这些基质蛋白相应的细胞表面附着 受体。这些蛋白的表达在相同条件下生长在厚基质上的细胞内被抑制。 相反地，生长在厚基质上的细胞表达基因包括但不限于P21、 SPP1、骨 桥蛋白、BPAG和血栓调节蛋白，这些基因在生长在薄基质上的细胞中 没有明显的表达。换句话说，生长在薄基质上的高度入侵性MUM-2B细 胞呈现的差异性基因表达模式是和从快速增殖迁移(入侵性)细胞预 期的模式相一致的模式而生长在厚基质上的相同细胞呈现的模式对应 于从完全分化的衰老细胞预期的模式相一致的模式。将厚基质上的细 胞转移至薄基质造成它们从衰老逆转成增殖性的-入侵性的基因表达 模式，且反之亦然。
来自大量辅助来源的数据可以与本发明的方法产生的差异性基因 表达相关联以识别被激活或抑制的通路且识别它们之间的调节反馈环 路。这样的分析也可以导致此前未知的基因和基因功能的识别。作为 有限的实施例，SPP1基因编码骨桥蛋白，该蛋白涉及多重生物学功能 包括骨生长和止血的磷酸化蛋白。在生长在薄基质上的而M-2B细胞中 SPP1表达被抑制(入侵状态)且在厚基质上生长的细胞中被充分提高 (衰老状态)。血栓调节蛋白在生长在薄基质上的细胞中被上调，该 蛋白是多功能蛋白，其功能包括参与凝血酶介导的骨桥蛋白的裂解。
已知裂解的骨桥蛋白和血小板反应素与来自很多型肿瘤的癌细胞 的CD44整合素受体结合且似乎诱导细胞和胞外基质之间的贴附。进一 步已知在薄基质上生长的细胞中锚定蛋白和BPAG的表达被升高，锚定 蛋白将CD44受体连接到细胞骨架的肌动蛋白丝上，BPAG在肌动蛋白丝 和中间丝之间形成连接。其它数据显示CD44受体通过肌动蛋白丝和其 它细胞骨架成分与核孔机械相连且施加在CD44受体上的机械力可以将 细胞核内的染色质在衰老和入侵表型之间"转换"。这些事件的总效 应是细胞入侵潜能的下调。血栓调节蛋白对骨桥蛋白的裂解逆转了该 下调。该简单的说明性环状通路暗示入侵性细胞应答外部条件可以在
入侵和衰老表型之间可逆地转换且暗示破坏该通路中若干步骤中的任 何步骤可以将细胞锁定在某一或其它表型。
癌症治疗的传统的"战术性的"方法是根据通过对具体通路和/或 分子靶点的破坏选择性地破坏癌细胞。本发明提供了识别这些战术耙 点的方法和评估及确认针对靶点开发的试剂的方法。上述说明性的通 路，甚至尽管没有完全说明，但被足够具体地陈述以同样地暗示某些 "策略性的"治疗替换和补充方法。以实施例6中说明的方式进行本 发明及其替换的操作可以证实根据癌细胞是处于它们的入侵或衰老表 型，癌细胞对治疗试剂的反应可显著不同。本发明建议的一策略性替 换方法是使用将癌细胞锁定在一表型的治疗试剂，典型地锁定在对第 二种治疗试剂最敏感的入侵表型。本发明建议的且与高度进攻性的、 快速迁移的癌症特别相关的另一策略性替换方法是使用将细胞锁定在 衰老表型由此有效地将急性疾病状态转化成慢性疾病状态并为实施有 效的治疗提供额外的时间的治疗试剂进行的治疗。相似的策略性治疗 可证实是手术去除实体瘤的有效辅助手段，因为在手术前，癌症可被 置于衰老态以将入侵性细胞的脱落最小化。此外，通过将癌细胞转化 成入侵的和在化疗期间更加药物敏感的状态，手术后化疗的功效可被 提高且在化疗后将它们转化成衰老态以抑制转移。
以相似的方式，可以使用实施例5的设备识别特定分子和调节性
靶点，这些分子和靶点在转移的特异性抑制中可能有用。在这些情况 下，设备的一个区包含在原发瘤中发现的基质蛋白组分而另一个区的 组分对应于在肿瘤可能转移至的组织中发现的胞外基质的组分。由两 种类型的基质调节的差异性基因表达可被用于识别潜在的治疗靶点和 试剂。如果改进该设备，使得不同基质组分和/或厚度的区以允许改变
其它参数例如气体压力、PH和存在的细胞因子的混合物的方式相互分 离，这些研究可被进一步优化以更准确地反映组织涉及的相应的环境。 如同结合此前的实施例所说明的，可以进一步使用这些设备评价 根据本实施例开发的治疗试剂的功效。
实施例14:用于抗癌试剂评估的参考材料
国家癌症研究所和其它组织准备、可使用和/或使用肿瘤组织和/ 或细胞的标准化组，潜力抗癌试剂的功效可以针对其进行评价。 一些 这样的组由从患者肿瘤切下的活体组织组成而其它组由在底物上或悬 浮液中生长的培养的肿瘤细胞组成。如同此前实施例中证实的，肿瘤 细胞的行为受到它们所生长的条件特别是与胞外基质相关的条件的严 重影响。在目前具体说明的肿瘤组中，该环境敏感性既没有被预期也 没有被说明。改进的肿瘤组可以通过在设备例如此前在实施例1、 2、 3
和5中说明设备上生长必要类型的肿瘤细胞构建，其中细胞在其上生
长的基质蛋白的组分和厚度通过此前说明的方式加以控制。这些改进 的组对环境更具代表性，在其中体内肿瘤生长发生且因此提供了对抗 癌试剂的功效更实际的评价。这些改进的组较由肿瘤组织组成的组提 供了更明确的和受控的环境且因此促进了比较性评价。作为实施例， 常常通过在由吸收的血清蛋白组成的底物上生长肿瘤细胞来制备肿瘤 组。该底物对应于此前说明的"薄基质"条件且不支持肿瘤巢的形成 和在厚基质层上观察到的入侵性细胞的其它表现。如已在此前的实施 例中观察到的，在薄基质上生长的入侵性肿瘤细胞比在厚基质上生长 的相同细胞对抗癌试剂的作用更加敏感。因此，针对在薄基质上生长 的入侵性细胞测试的试剂的表观功效将被人为地提高。相反地，同样 如同在此前实施例中观察到地，在厚基质上生长的肿瘤细胞的入侵性 行为比在薄基质上生长的相同细胞的入侵性行为少。这可以掩盖待测 试剂的功效。如果以本发明具体说明的方式将在薄和厚基质上生长的 细胞作为参考材料，可以进行更准确的测试。
实施例15:通过流式细胞计数法对入侵性细胞的检测 在本发明的前述实施例中说明的用于检测入侵性细胞的方法要求 在用染色质降解剂处理细胞之前，将细胞与底物接触，典型地与胞外 基质蛋白层接触。该步骤在临床环境中可能引起不便。血癌的细胞典 型地以液体基质如血液或淋巴液中的细胞悬浮液形式收集。类似地，
某些方法如普通临床用于从实体瘤起始收集样本的细针抽吸法(FNA) 形成了被收集细胞在液体基质中的悬浮液。此外，将细胞在液体基质 中分散是在显微镜载玻片上进行单层制备过程和通过组织培养和相似 方法制备评估样本的根本要素。因此，能够以直接利用液体悬浮液中 的样本细胞的方式操作本实验而不需要首先将细胞转移至固体基质如 玻璃盖玻片上是方便的。以下说明了在本发明的操作中悬浮细胞的使 用，该使用以与在以上实施例3和4中的方法相似的方式进行。
在本实施例中，具有不同入侵性程度的培养细胞被用于说明性目 的。类似地，可以使用来自患者样本的细胞悬浮液。本实施例中使用 的培养细胞系是WI-38纤维原细胞(正常细胞)；0CM1 (弱入侵性原 发眼色素层黑素瘤)；M619 (高入侵性原发眼色素层黑素瘤)；以及 MUM2B (高入侵性转移性眼色素黑素瘤)。根据充分已知的标准方法在 单层培养中生长所有细胞；在DMEM培养基中机械收获细胞并在台式离 心机中用1400 RPM离心5分钟沉淀细胞。相比于使用试剂例如胰蛋白 酶和EGTA将细胞从它们的底物上释放，更优选地使用对这些培养细胞 的机械收获。这避免了使用EGTA中发生的对染色质结构的潜在破坏和 由胰蛋白酶引起的对糖萼的破坏。
将细胞沉淀物重悬于0. 1% Triton X-100中；在室温放置1分钟； 再次用1400 rpm离心沉淀5分钟；并重悬于DMEM中。将碘化丙啶(PI; 10 Pl/ml; Molecular Probes, Eugene, OR)加入一份这样的悬浮液 中。将含有0. 5 u 1 Alu I限制性内切酶的40 p 1函EM加入存留的 细胞悬浮液中且在将该制备放置在37。C。在加入ALU 0 (基线)、1、 3和5小时后取等份的混合物用于评估。将碘化丙啶分别加入这些经消 化的样品。根据标准方法使用FACS Calibur流式细胞计数仪(BD Bioscience, San Jose， CA)分析生成的经消化和染色后的细胞悬浮 液，该流式细胞计数仪配有488 nm激发激光、前向和侧向散射的监测 仪和520、 575和675 nm荧光信号的监测仪。对10， 000个细胞进行计
数用FACS点阵图和直方图分析结果。使用CellQuest软件(BD Bioscience)进行统计分析。
碘化丙啶是一化学计量的DNA荧光染色试剂，由此可以通过流式 细胞计数法测量的荧光信号强度确定待评估细胞的DNA含量。在通透 后用PI处理而没有用ALU消化的一份细胞悬浮液作为处理开始前的各 细胞制备中存在的DNA量的参照。图7显示了在暴露于Alu I限制性 内切酶1、 3和5小时后进行PI染色的各细胞系测量出的流式细胞计 数荧光强度直方图。
在1小时观察到UM54正常眼色素层黑素细胞的PI信号的降低， 在3和5小时有进一步地降低。在5小时，基线信号的主要部分降低 至仪器检测阈值的限度之下(图7a，第一行)。这标志着在正常眼色 素层黑素细胞中DNA的显著降解。弱入侵性OCMla黑素瘤细胞在Alu I 酶消化1小时后呈现出相似的PI信号的降低，但是此后，信号强度没 有显著下降(图7，第二行)。
不同于UM54正常眼色素层黑素细胞和弱入侵性OCMla黑素瘤细 胞，高入侵性M619或MUM2B黑素瘤细胞在Alu I消化1小时的时候未 显示PI信号的显著丧失(图7a,底部两行)。但是，高入侵性的原发 M619黑素瘤细胞的PI信号在3小时出现下降，而高入侵性转移性MUM2B 黑素瘤细胞甚至在5小时和基线信号没有显著不同。因此，根据将通 透细胞暴露于Alu I限制性内切酶不同时间段后测量的PI信号，可能 区分4种细胞系并由此将流式细胞计数法用于入侵性细胞的检测和分 类。
实施例16:使用细胞核的药物评估
如上所述制备贴附于直径为12 mm玻璃盖玻片上的细胞。将带有 贴壁细胞的盖玻片的细胞一侧向下置于50 cc锥形离心管中，该离心 管含有5 cc含有10 mg/ml细胞松弛素B的正常培养基，由此盖玻片 的边缘置于管的锥形壁上且盖玻片平面与管的长轴垂直。以1400 RPM
离心5分钟导致细胞核移出细胞膜并作为离心管底的沉淀物被收集。 去核细胞仍然贴附在盖玻片上。
在用ALU或DNAase处理之前，用DMEM洗涤收集的细胞核并用含 有0. 1 %去垢剂Triton X-100的DMEM溶液处理细胞核2分钟使其通透。 如上所述，ALU选择性地降解正常细胞和非入侵性细胞中细胞核内的染 色质。进一步地，用100单位DNA酶在DMEM中处理通透的细胞核30 —60分钟消化来自正常和非入侵性细胞的核染色质而来自入侵性细胞 的核染色质大部分保持完整。与实施例13相关但为在此说明的的其它 数据暗示可由光散射检测到的细胞骨架的变化可以影响细胞核染色质 的状态。在本方法中发生的细胞核通过细胞膜的转移似乎足够迅速， 由此可以区分核与胞质因子而没有明显水平的混淆性的交互作用。
以上特定具体实施方案的说明意在作为本发明的代表而不对本发 明发生限制。尽管本发明的设备和方法已通过优选具体实施方案进行 说明，在不背离本发明的构思、精神和范围的基础上进行在此说明的 可替换的实施、组合物和/或方法对于本领域技术人员将是显而易见 的。更具体地，可以使用替换手段实施在此所述的设备以及可以为了 与具体细胞和样本类型的相容性改变在此所述的组合物和条件而仍然 获得如在此所述的相同的或相似的结果将是显而易见的。对本领域技 术人员显而易见的所有这些相似的取代和改进被视为在所附权利要求 所定义的本发明的范围和精神内。
参考文献
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权利要求
1、一种用于评估细胞的设备，该设备包含底物，该底物具有包含基质材料的一或多个细胞生长区域，其中区域内的该基质材料是a)具有厚度A，在该厚度待评估的细胞没有穿透和重塑该区域的基质材料；b)具有厚度B，在该厚度待评估的细胞可以穿透并重塑该区域的基质材料，但不允许细胞被包埋在该材料中；c)具有厚度C，在改厚度待评估的细胞能够穿透、重塑和被包埋在该区域的该基质材料中；或d)它们的组合。
2、 根据权利要求1中所述的设备，其中厚度A小于50微米、厚 度B在50至100微米之间，且厚度C大于100微米。
3、 根据权利要求1中所述的设备，其中该基质材料包括层粘蛋白、 胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、从一或多个生物学组织中分离出 的细胞基质材料，或它们的组合。
4、 根据权利要求1所述的设备，其中一或多个细胞生长区域通过 喷涂、移印、转印、丝网印刷、喷墨沉积、印刷举离法、凹凸印、软 刻蚀、制模、压铸、刻蚀并充填(嵌刻)，或它们的组合形成。
5、 根据权利要求1中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 在底物表面上形成。
6、 根据权利要求1中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域在 底物内形成。
7、 根据权利要求1中所述的设备，其中待评估的细胞是人细胞。
8、 根据权利要求1中所述的设备，进一步包含作为参照的纤连蛋 白的一或多个参照区域，由在包含其它基质材料的细胞生长区域上的 细胞生长形成的模式与该参照区域进行比较。
9、 一种用于评估细胞的设备，该设备包含底物，该底物具有包含 基质材料的一或多个细胞生长区域，其中一或多个细胞生长区域在厚 度上变化。
10、 根据权利要求9中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 以连续的方式在厚度上变化。
11、 根据权利要求9中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 的厚度从(i)足以允许细胞贴附并在基质材料上生长，和(ii)不足 以允许细胞穿透并重塑该区域的基质材料的最小厚度变化到足以允许 细胞穿透、重塑和被包埋在该区域的基质材料中的最大厚度。
12、 根据权利要求9中所述的设备，其中细胞生长区域的厚度从小于50微米变化到大于500微米。
13、 根据权利要求9中所述的设备，其中组成细胞生长区域的基 质材料是层粘蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、从一或多个 生物学组织中分离出的细胞基质材料或它们的组合。
14、 根据权利要求9中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 通过喷涂、移印、转印、丝网印刷、喷墨沉积、印刷举离法、凹凸印、 软刻蚀、制模、压铸、刻蚀并充填(嵌刻)，或它们的组合形成。
15、 根据权利要求9中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 在底物表面上形成。
16、 根据权利要求9中所述的设备，其中一或多个细胞生长区域 在底物内形成。
17、 根据权利要求9中所述的设备，其中待评估的细胞是人细胞。
18.根据权利要求9中所述的设备，进一步包含作为参照的纤连 蛋白的一或多个参照区域，由在包含其它基质材料的细胞生长区域上 的细胞生长形成的模式与该参照区域进行比较。
19. 一种确定细胞入侵潜能的方法，包括a) 将待评估的细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物上， 该区域包含基质材料；b) 在允许细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在一或多个细 胞生长区域上培养该细胞；c) 识别由细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、生长、或迁移和 生长产生的细胞模式；以及d) 解释该细胞模式以确定细胞的入侵潜能。
20.根据权利要求19中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的 厚度。
21.根据权利要求19中所述的方法，进一步包括用:e) 细胞通透化试剂；f) 核酸内切酶ALU、核酸酶DNA酶或两者；以及g) 核酸染料处理生长在一或多个细胞生长区域上的细胞。
22、根据权利要求19中所述的方法，进一步包括用:e) MSP I酶；和f) 核酸染料处理生长在一或多个细胞生长区域上的细胞。
23、根据权利要求19中所述的方法，其中待评估的细胞是入侵性 和非入侵性细胞的混合物。
24、根据权利要求23中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的 厚度。
25、根据权利要求23中所述的方法，进一步包括用-e) 细胞通透化试剂；f) 核酸内切酶ALU、核酸酶DNA酶或两者；以及g) 核酸染料处理生长在一或多个细胞生长区域上的细胞。
26、根据权利要求23中所述的方法，其中入侵性和非入侵性细胞 的混合物被沉积于在一或多个细胞生长区域上生长的正常细胞层之 上。
27、根据权利要求26中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的 厚度。
28、根据权利要求26中所述的方法，进一步包括用:e) 细胞通透化试剂；f) 核酸内切酶ALU、 DNA酶或两者；以及g) 核酸染料 处理该细胞混合物。
29、 一种确定入侵性细胞可能转移至的组织或器官位点的方法，包括a) 将待评估的入侵性细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料，其中该基质材料获自或来自入侵性细胞可能转移至的组织或器官；b) 在允许细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在一或多个细 胞生长区域上培养该入侵性细胞；c) 识别由该细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、生长、或迁移 和生长产生的细胞模式；以及d) 解释该细胞模式以确定入侵性细胞可能转移至的组织或器官位点。
30、根据权利要求29中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的 厚度。
31、根据权利要求29中所述的方法，进一步包括用:e) 细胞通透化试剂；f) 核酸内切酶ALU、 DNA酶或两者；以及g) 核酸染料 处理该细胞。
32、 一种筛选化合物、药物或药物组合物作为抗癌化合物、药物 或药物组合物的功效的方法，包括a) 将癌细胞或前癌细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域的底物 上，该区域包含基质材料；b) 用待评估的化合物、药物或药物组合物处理癌细胞或前癌细胞;c) 在允许该癌细胞或前癌细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件 下在一或多个细胞生长区域上培养该癌细胞或前癌细胞；d) 识别由该癌细胞或前癌细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、 生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及e) 解释该细胞模式以确定该化合物、药物或药物组合物对该癌细 胞或前癌细胞的作用。
33、 根据权利要求32中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少一部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在基质材料中的 厚度。
34、 根据权利要求32中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对有核细胞的功效被评估。
35、 根据权利要求32中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对去核细胞(细胞质)的功效被评估。
36、 根据权利要求32中所述的方法，进一步包括用f) 细胞通透化试剂；g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及h) 核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。
37、 一种确定抗癌药物或药物组合物的功效的方法，包括a) 将已经过抗癌药物或药物组合物处理的癌细胞或前癌细胞沉积 在具有一或多个细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料；b) 在允许该癌细胞或前癌细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件 下在细胞生长区域上培养该细胞；C)识别由该细胞在细胞生长区域上迁移、生长、或迁移和生长产生的细胞模式；以及d)解释该细胞模式以确定该抗癌药物或药物组合物对该细胞的作用。
38、 根据权利要求37中所述的方法，其中该细胞基质材料的至少 某些部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质材料中的厚 度。
39、 根据权利要求37中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对有核细胞的功效被评估。
40、 根据权利要求37中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对去核细胞(细胞质)的功效被评估。
41、 根据权利要求37中所述的方法，进一步包括用f) 细胞通透化试剂；g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及h) 核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。
42、 一种检测起始、促进或加强细胞内癌行为的化合物的方法，包括a) 将正常的或非入侵性的细胞沉积在具有一或多个细胞生长区域 的底物上，该区域包含基质材料；且b) 用待评估的化合物处理该细胞；c) 在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在一或多个细胞生长区域上培养该细胞；d) 识别由该细胞在细胞生长区域上迁移、生长、或迁移和生长产 生的细胞模式；以及e) 解释该细胞模式以确定该化合物是否起始、促进和/或加强该 细胞内的癌行为。
43、根据权利要求42中所述的方法，其中一或多个细胞生长区域 的至少某些部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质材料 中的厚度。
44、根据权利要求42中所述的方法，进一步包括用:f) 细胞通透化试剂；g) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及h) 核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。
45、 一种检测起始、促进或加强细胞内癌行为的化合物的方法， 包括a) 将已经过待评估的化合物处理的正常的或非入侵性的细胞沉积 在具有一或多个细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料；且b) 在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在一或多个 细胞生长区域上培养该细胞；c) 识别由该细胞在一或多个细胞生长区域上迁移、生长、或迁移 和生长产生的细胞模式；以及e)解释该细胞模式以确定该化合物是否起始、促进或加强该细胞 内的癌行为。
46、 根据权利要求45中所述的方法，其中该一或多个细胞生长区 域的至少某些部分具有足以允许细胞穿透、重塑并被包埋在该基质材 料中的厚度。
47、 根据权利要求45中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对有核细胞的功效被评估。
48、 根据权利要求45中所述的方法，其中抗癌药物或药物组合物 对去核细胞(细胞质)的功效被评估。
49、 根据权利要求45中所述的方法，进一步包括用 e) 细胞通透化试剂；f) ALU核酸内切酶、DNA酶或两者；以及g) 核酸染料处理该癌细胞或前癌细胞。
50、 一种识别差异性表达的基因的方法，包括a) 将细胞的第一群落沉积在具有第一细胞生长区域的底物上，该 区域包含基质材料，其中基质材料厚度小于100微米；b) 将细胞的第二群落沉积在具有第二细胞生长区域的底物上，该区域包含基质材料，其中基质材料厚度至少为IOO微米；c) 在允许该细胞迁移、生长、或迁移和生长的条件下在基质材料的第一和第二区域上培养该细胞；d) 比较第一和第二细胞群落之间的基因表达；以及e) 识别在第一和第二细胞群落之间差异性表达的基因。
51、 根据权利要求50中所述的方法，其中使用核酸阵列比较基因 表达。
全文摘要
本发明涉及用于评估细胞间和细胞与基质材料间相互作用的设备和方法，其中由于这些相互作用形成的细胞分布模式是对细胞入侵潜能的指示物。此外，这些设备和方法可以提供对入侵性细胞转移的优选位点的指示；对使用到这些细胞上的抗癌药物的功效的指示；以及对试剂促进或提高肿瘤生长或转移的潜能的指示。
文档编号C12N5/00GK101389753SQ200480037140
公开日2009年3月18日 申请日期2004年10月13日 优先权日2003年10月14日
发明者卡拉·瓦尼纳吉, 安德鲁·J·曼尼托斯, 罗伯特·弗伯格 申请人:伊利诺伊大学评仪会