专利名称：：一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒，更具体地说涉及SLC22A6基因多态位点在高血压病中预测双氢克尿噻降压疗效方面的用途，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
：高血压是冠心病、脑中风等众多心血管疾病的最大的独立危险因素，近年来，高血压的患病率逐年上升，在世界范围内，2000年全世界有9.72亿高血压患者，到2025年有可能达到15.6亿。在中国，高血压患病率18.8%，约有1.6亿高血压患者，并以每年350万新病例的速度递增。积极干预血压，通过治疗控制高血压可以有效降低脑中风与心脏病的发病与死亡，这已是非常肯定而且被广泛接受的事实。研究证实收縮压降低10_12誦Hg和舒张压降低5—6mmHg可使脑中风发病危险减少40%，冠心病发病危险减少16%，总死亡率减少20%。血压越高，降低血压带来的益处越大。单药治疗在非选择高血压人群的有效率为50%左右，六大类抗高血压药物已被临床试验证实均可作为一线治疗药物。噻嗪类利尿药无论单用或与其它药物联用，都是一类应用非常广泛且有很好疗效的药物。双氢克尿噻是心血管疾病中应用非常广泛的噻嗪类利尿药，是治疗原发性高血压的一线用药。近年来国内外大规模随机、双盲临床试验证明，双氢克尿噻(hydrochlorothiazide,HCTZ)不但使患者血压下降，而且减少脑卒中、冠心病的发病率和由心血管疾病引起的死亡率。我国现阶段仍然为发展中国家，而目前市场上常用降压药物大多数为每片2-8元，对于占人口绝大多数的工薪阶层和农民过于昂贵，直接导致80%—90%的低收入高血压病患者因负担不起药费而放弃长期治疗，造成高血压控制率低下，而脑中风、冠心病等心脑血管疾病高发。利尿剂，尤其是噻嗪类利尿剂双氢克尿噻每年仅需人民币11元，是目前市场上最为便宜的降压药物，也是最适合中国国情的降压药。虽然双氢克尿噻降压疗效显著，但也有研究发现，无论是在降低血压，减少临床事件，还是在出现不良反应方面，不同个体之间存在着显著差异。这种差异是由多种因素，如环境因素、年龄、性别、体重和治疗前血压等造成，越来越多的研究发现基因变异可以导致不同的病人对药物有不同的治疗反应，相关通路上的基因变异可解释20%-95%的药物反应个体差异，找出这些差异，不但可以指导安全有效的用药，而且具有极大的经济学价值。作为本次研究的候选基因，SLC22A6基因(solutecarrierfamily22member6)编码有机阴离子转运蛋白1(organicaniontransporter1，0AT1)蛋白。有机阴离子转运蛋白属于溶质载体超家族，是动物及人体内重要的膜转运蛋白，广泛分布于胃肠道、肝脏、肾脏、血脑屏障等处，介导内、外源物质的跨细胞转运。OATl主要分布于肾脏近端小管上皮细胞基底膜，负责将血液中的底物主动转运至细胞内，再通过定位于刷状缘的转运蛋白将底物运送至管腔。其转运底物很广泛，内源性物质包括细胞核苷酸、a-酮戊二酸和尿酸等；外源性物质包括e-内酰胺类抗生素、非甾体类抗炎药、碳磷酸盐核苷、袢利尿剂、噻嗪类利尿剂和抗病毒药等。双氢克尿噻是一种弱酸类物质，约95%的双氢克尿噻是以原型通过0AT1由血液中主动分泌到肾小管中，到达远曲小管，通过抑制噻嗪类敏感性钠-氯同向转运体(thiazide-sensitiveNa,Cl-cotransporter,TSC,由SLC12A3基因编码)而起利尿降压作用。假如0AT1功能降低将减少双氢克尿噻由血液分泌到肾小管中，从而导致其利尿及降压作用降低。目前未有关于SLC22A6基因多态位点在高血压病药效预测中的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案5Z6^^堪因多态位点在高血压病中预测双氢克尿噻降压疗效方面的用途。一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法，通过检测5ZC2W堪因多态位点基因型，进行预测。预测双氢克尿噻降压疗效的引物序列，具有序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。一种预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒，由下列试剂组成，成分和含量如下(50人份)，于一20。C保存50uL10XPCR缓冲液，50pLlO鹏ol/LdNTP混合液，12uL(5U/uL)TaqDNA聚合酶，各20pL(10umo1/L)引物，引物是序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列；5ml去离子双蒸水(ddH20)，lOOwL10XSacI限制性内切酶反应缓冲液；35uL(10U/uL)限制性内切酶SacI。本发明采用的技术方案以5Z^^6基因为功能候选基因，在河南省信阳市农村社区原发性高血压人群中研究了5ZC么M6的基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)对双氢克尿噻降压疗效的影响。发现一个位于6ZCiW6基因5，端的标签SNP(tagSNP)rs10792367在高血压病人群中与双氢克尿噻的降压疗效紧密相关。据此制备了预测试剂盒，并在山东日照的高血压人群进行检测，发现该试剂盒确能有效预测双氢克尿噻的降压疗效。本发明的重要意义高血压病是所有心脑血管疾病发生的最重要的独立危险因素，也是一个可以控制的因素。在高血压病中5ZCil^舶基因多态性对双氢克尿噻降压疗效方面有良好的预测性，这一基因型分析将会成为指导应用双氢克尿噻治疗的主要指标，为高血压病患者实现真正意义上的个体化用药提供了指导。本发明的优点和创新性在于1.本发明是世界上首次在高血压病人群中将5ZC^24堪因多态和双氢克尿噻的降压疗效紧密关联，确认了在高血压病人群中5ZCi2J堪因多态对双氢克尿噻降压疗效具有预测作用；2.本发明发现的5ZC2^堪因多态位点在高血压病中对双氢克尿噻降压疗效的预测效果非常显著；3.本发明以中国高血压病患者的社区人群为研究对象，数目较大，代表性高，是真正适合国人的个体化诊疗方案；4.预测在高血压病中对双氢克尿噻降压疗效的引物序列(SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)为我实验室自主设计，检测的敏感性和特异性好，成本低。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡是依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为SNPrsl0792367(-6328C/G)位点的分型图谱，M为核酸标准品。具体实施例方式实施例l:SNP位点与双氢克尿噻降压疗效的相关性研究一.临床试验从河南信阳农村入选了无相关的从未接受过任何高血压药物治疗或者在最近8周内没有接受过药物治疗的40-75岁高血压病人。高血压诊断标准为2月内三次不同时间检査收縮压》140mmHg和/或舒张压>90mmHg。调查流程包括①问巻调査基本情况和病史、吸烟和饮酒等传统危险因素情况，②测量双上肢坐位血压，③抽空腹静脉血样，留取尿样，⑤测量身高、体重、腰围、臀围，⑥内科听诊和物理检査，⑦12导心电图检查，⑧超声心动图检查，⑨根据随机号发药，并注明下次随访时间和注意事项。每一名调査对象都由经过培训并考核合格的调查者应用标准水银柱血压计根据美国心脏协会推荐的方案测量3次血压，并根据调查对象的右上臂围选择适当的袖带(成人号、大号、特大号)。血压测量前30min，调査对象不能饮酒、吸烟、饮咖啡/茶或进行较为剧烈的活动，休息至少5min后坐位测量血压。取3次血压平均值作为基线血压值。入选者的收缩压《180mmHg和舒张压《110mmHg,—般情况良好，排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病、糖尿病、痛风、对双氢克尿噻过敏及肝肾功能不全者，所有参与者均不能服用其它降压药及与双氢克尿噻有相互作用的药物，所有入选患者给予双氢克尿噻12.5mg/次，一天一次口服。在2周后测量血压及血钾，如血压不达标，则将双氢克尿噻剂量加倍，如血钾〈3.5mmol/L，则给予口服氯化钾20-40mmol/天。入选患者可以无条件退出试验，4周后共545例符合条件的患者进行分析。生化指标取尿和空腹12小时静脉血，检测相关的生化指标。糖尿病为空腹血糖》7.0mmol/L，或有糖尿病病史者。体重指数(BMI):体重(kg)/身高(m)2。〃曾经吸烟"定义为有生以来吸烟多于20包，或者持续一年每天吸烟至少一支；〃曾经饮酒"定义为饮酒持续一年，平均每周至少一次。二.基因分型l.SNP入选本研究采取标签SNP(tagSNP)结合功能候选SNP策略来挑选SNP。依据国际人类基因组单体型图计划(HapMap计划)2006年1月释放的中国汉族人基因SNP资料和NCBISNP数据库，本研究共挑选了SLC22A6基因的两个SNP，分别为rs4149170和rs10792367，选择rs4149170位点是因为他们位于外显子上并且是非同义突变，选择rsl0792367位点是因为其位于基因5'区并且根据HapMap中国汉族人基因SNP资料其次等位基因(minorallele)大于3%。2.基因分型2.l试剂(1)人血基因组DNA纯化试剂盒DP318-02(天根生化科技，北京，中国)。(2)10%SDS:10.OgSDS溶于90ml水中，调pH7.2，加水定容至100ml。(3)TE:lOmMTris-HCl(pH8.0)，lmMEDTA-Na2(pH8.0)(4)50XTAE电泳缓冲液:242.OgTris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml0.5raMEDTA-Na2，终体积1升。限制性内切酶均购自美国NewEnglandBiolabs公司。所有引物均购自北京奥科生物公司。2.2仪器及设备(1)PCR仪DNAengine美国Bio-Rad公司(2)冷冻离心机RC-5C美国SORVALL公司(3)天平JA5003上海天平仪器厂(4)凝胶电泳槽北京六一仪器厂2.3实验步骤(1)使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组DNA，所有步骤均按照说明书进行。(2)聚合酶链式反应一限制性内切酶长度多态性(PCR-PFLP)法对二个SNP进行基因分型，具体如下A.PCR扩增目的片段2个SNP进行PCR扩增的引物、退火温度(Tm)及产物长度见表l。表l:基因多态位点PCR具体信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>所有SNP位点使用PCR反应系统(KT221-01，北京天根生化科技)进行扩增，T叫Mix(2X)gDNA(100ng/uL)PF(5pmol/uL)PR(5pmol/uUd孤05.OuL1.OuL0.5uL0.5uL3.5uLtotal10.OuLPCR反应条件(退火温度具体见表l):st印1=94.0°C5分钟st印2=94.0°C30秒st印3=退火30秒step4=72.0°C30秒step5=72.0°C7分钟step6=4.0°C-重复35个循环B.酶切将PCR产物酶切6-12小时，其反应体系如下(内切酶具体见表l)PCR产物10.0uL10XBuffer1.5uL内切酶2.0unitddH20_补齐到15uL总体积15.0uLC.电泳鉴定(参见图l)①rsl0792367:PCR产物长334bp，Sacl酶切后，3%琼脂糖胶电泳检测，CC基因型者产生232bp和102bp两条片段，CG基因型者产生334、232bp和102bp三条片段，GG基因型者只有一条334bp片段；②rs4149170:PCR产物长335bp，Mspl酶切后，4%琼脂糖胶电泳检测，GG基因型者产生259bp和76bp两条片段，CG基因型者产生335、25恥p和76bp三条片段，CC基因型者只有一条335bp片段；注BMI，体重指数；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；TC，总胆固醇；TG，甘油三脂；FBG，空腹血糖；Cr，肌酐；年龄、体重指数、腰围、腰臀比、收縮压、舒张压、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、甘油三脂、空腹血糖、肌酐以均数士标准差表示；其它指标是以百分数表示。*表示P〈0.05。三.统计学分析计量资料符合正态分布以均数土标准差表示。计量资料组间比较采用t检验或单因素方差分析(ANOVA)。计数资料、基因型和等位基因频率比较、以及Hardy-Weinberg平衡检验均采用卡方检验(义2)。采用线型回归模型分析基因型与药物降压疗效的相关性，并调整年龄、性别、体重指数、腰围、腰臀比和治疗前血压。以P〈0.05为有统计学显著性差异。比较都进行了Bonferronicorrection校正。采用SPSS11.0软件包进行统计处理。四.结果1.研究人群的临床特点本研究入选高血压人群的临床特点如表2所示。表2:信阳高血压病人群的基础临床资料临床指征545187/35857.99±8.6725.81±3.4385.53±9.500.87±0.06153.52±12.1893.60±8.611.56±0.353.13±0.935.54±1.161.73±1.405.59±1.7663,23±16.7916.017.2HmmHm女/m男岁gc，，，，k，比压压数别龄I，围臀縮张人性年g腰腰收舒A几ocDH:om1o，mcmLLL/L//1/oommLD，GGCDTFft/C3^-烟酒2.在高血压病患者中SLC22A6基因多态位点与双氢克尿噻降压疗效的相关性所选5ZCi^^基因SNP的等位基因频率均符合Hardy-Weinberg,并且相互之间没有连锁不平衡。在高血压病患者中，我们没有发现5Za，W6基因rs4149170位点与双氢克尿噻的降压疗效存在显著相关性，而rsl0792367位点与双氢克尿噻降低患者平均压和收缩压存在显著相关性(表3)。0477基因rsl0792367C等位基因携带者在应用双氢克尿噻后收缩压和平均压降低程度明显低于GG基因型者，C等位基因与双氢克尿噻降压疗效呈显性遗传模式，因此我们用显性遗传模式来分析两者之间的关系。采用线型回归模型，在校正了性别、年龄、体重指数、腰围、腰臀比及相应的基础血压值后发现^77基因rsl0792367与双氢克尿噻降低平均压(ZM).OIO)和收縮压(/M).014)存在显著相关性，C等位基因携带者比GG基因型者平均压和收缩压各少降2.59mmHg禾口4.06,Hg。在经过Bonferronicorrection校正后，这一位点与双氢克尿噻降低平均压(/M).010，0.05/2)和收縮压(/M).014，0.05/2)仍存在显著相关性。表3:在高血压病患者中5ZC2i^堪因多态性与双氢克尿噻降压疗效的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>M:主要的等位基因，m:次要的等位基因；SNP:单个核苷酸多态性；P值是釆用线型回归模型，在校正了相应的基础血压值后的结果；校正的P值采用线型回归模型，在校正了性别、年龄、体重指数、腰围、腰臀比及相应的基础血压值后的结果。五.结论立6^Z^基因rsl0792367GG基因型者对双氢克尿噻降低收縮压和平均压程度明显高于C等位基因携带者。这是世界上首次将5ZC2^的基因多态性与双氢克尿噻降压疗效联系起来，为实现真正意义上的个体化用药提供科学依据。实施例2:预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒一.组成成分和含量如下(50人份)，于一20。C保存50uL10XPCR缓冲液(TaKaRa)，50"lO腿ol/LdNTP混合液(TaKaRa)，12uL(5U/uL)TaqDNA聚合酶(TaKaRa)，各20uL(10umo1/L)SEQIDNO.1和SEQIDN0.2引物(北京奥科生物公司)5ml去离子双蒸水(ddH20)，100uL10XSacI限制性内切酶反应缓冲液(美国NewEnglandBiolabs公司)35uL(10U/uL)限制性内切酶SacI(美国NewEnglandBiolabs公司)二.使用方法1.常规方法提取受试者基因组DNA;2.PCR反应表4:PCR反应体系反应组分贮存液浓度体积(uL)终浓度基因组DNA100ng/uL1.010ng上游引物(SEQIDNO.1)10画1/L0.250.25咖ol/L下游引物(SEQIDNO.2)10umol/L0.250.25umol/LPCR反应缓冲液10X1.0IXdNTPslOmmol/L0.40.4mmol/LDNA聚合酶(Taq)5U/uL0.2lU/uL去离子双蒸水(ddH20)6.9总体禾只(totalvolume)10.0反应条件st印1=94.0°C5分钟重复35个循环step2=94.0°C30秒st印3=63.0°C30秒st印4=72.0°C30秒step5=72.0°C10分钟step6=4.0°C3.酶切将PCR产物酶切12小时，其反应体系如下PCR产物10.0uL10XBuffer1.5uL内切酶SacI(5U/uL)0.6uLddH20_2.9uL总体积15.0uL4.电泳鉴定PCR产物长334bp，SacI酶切后，3%琼脂糖胶电泳检测，CC基因型者产生232bp和102bp两条片段，CG基因型者产生334、232bp和102bp三条片段，GG基因型者只有一条334bp片段。实施例3:试剂盒对双氢克尿噻降压疗效的预测作用研究一.为了进一步验证该试剂盒对双氢克尿噻降压疗效的预测作用，在山东日照按实施例1完全相同的检査及标准入选245例患者，给予双氢克尿噻12.5mg/次，一天一次，2周后测量血压如不达标则剂量加倍，共治疗8周。二.基因分型1.所用试剂及仪器设备与实施例1完全一致。2.实验步骤(1)使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组DNA，所有步骤均按照说明书进行。(2)使用预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒对rsl0792367进行基因分型，具体按试剂盒说明书操作。二结果1.研究人群的临床特点本研究入选高血压人群的临床特点如表5所示。2.在高血压病患者中5ZC2i^^基因多态位点与双氢克尿噻降压疗效的相关性所选5Z(^i^6基因SNP的等位基因频率符合Hardy-Weinberg。在高血压病患者中，我们发现rsl0792367位点与双氢克尿噻降低患者平均压和收縮压存在显著相关性(表6)，校正了性别、年龄、体重指数、腰围、腰臀比及相表5:山东日照高血压病人群的基础临床资料临床指征人数245性别，男/女87/158年龄，岁56.62±10.15BMI，kg/m224.37±3.41腰围，cm87.10±10.87腰臀比0.92±0.07收縮压，mmHg150.86±10.96舒张压，鹏Hg91.69±8.44亂-C，mmol几1.41±0.29LDL-C，mmol/L2.75±0.75TC，mmol/L4.91±0.96TG,醒ol/L1.49±1.23FBG，mmol/L5.40±1.46Cr，mmol/L52.76±10.96吸烟，％20.8饮酒，％28.2注BMI，体重指数；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；TC，总胆固醇；TG，甘油三脂；FBG，空腹血糖；Cr，肌酐；年龄、体重指数、腰围、腰臀比、收縮压、舒张压、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、甘油三脂、空腹血糖、肌酐以均数士标准差表示；其它指标是以百分数表示。《表示P〈0.05。应的基础血压值后发仍与双氢克尿噻降低平均压(/M).010)和收縮压(/M).003)存在显著相关性，C等位基因携带者比GG基因型者平均压和收縮压各少降3.53mmHg和5.88mmHg。表6:在高血压病患者中5ZCi，i^堪因多态性与双氢克尿噻降压疗效的相关性15降压疗效(mmHg)Mm+mmeMMiiP值校正后P值rsl0792367^^平均压13.39±9,168,76±9.569.95±9.790.0050.010收縮压20.08±13.5313.03±13,9413.58±16.270.0020.003舒张压10,04±9.656,62±9.848,13±9.120.0660.100注M:主要的等位基因，m:次要的等位基因；SNP:单个核苷酸多态性；P值是采用线型回归模型，在校正了相应的基础血压值后的结果；校正的P值采用线型回归模型，在校正了性别、年龄、体重指数、腰围、腰臀比及相应的基础血压值后的结果。五.结论-试剂盒对双氢克尿噻降压疗效具有显著预测作用。序列表〈110〉中国医学科学院阜外心血管病医院〈120>—种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒〈130〉〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉19<212〉醒<213〉人工合成〈400〉1cagtgctggggaetgaatgt19〈210>2<211〉23<212〉DNA〈213〉人工合成<400〉2aagag犯t犯ggc3gacac3CEig2权利要求1.一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法，通过测定SLC22A6基因多态位点，进行预测。2.预测双氢克尿噻降压疗效的引物序列，其特征在于具有序列表SEQIDNO.1和SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。3.—种预测双氢克尿噻降压疗效的试剂盒，其特征在于由下列试剂组成，成分和含量如下(50人份)，于一2(TC保存50yL10XPCR缓冲液，50uLlOmmol/LdNTP混合液，12ixL(5U/uL)TaqDNA聚合酶，各20uL(10umo1/L)引物，引物是序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列；5ml去离子双蒸水(ddH20)，IOO"L10XSacI限制性内切酶反应缓冲液；35uL(10U/uL)限制性内切酶SacI。全文摘要本发明公开了一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法及试剂盒，属于医学分子生物学领域。一种预测双氢克尿噻降压疗效的方法，通过测定SLC22A6基因多态位点，进行预测。本发明的优点是为高血压病患者实现真正意义上的个体化用药提供了科学依据。文档编号C12Q1/68GK101328502SQ20081010631公开日2008年12月24日申请日期2008年5月12日优先权日2008年5月12日发明者凯孙,惠汝太,樊晓寒,王晓建,陈敬洲,韩运峰申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院