一种检测沙眼衣原体的质控物的制作方法

专利名称：：一种检测沙眼衣原体的质控物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测沙眼衣原体的质控物，属于临床检验学和生物
技术领域：
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背景技术：
：沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)是重要的性传播疾病的病原体之一，它不仅会导致阴道、尿道感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，也能导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。此外，此种病原体还与人乳头瘤病毒(HPV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染有关。衣原体为革兰氏阴性病原体，是一种专性细胞内寄生的微生物，没有合成高能化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。沙眼衣原体是一种比病毒大、比细菌小的原核微生物，呈球形，直径只有沙眼衣原体O.30.5mm。Ct的基因组为1.5kb左右的双链DNA，属于基因组最小的原核生物之一，仅为大肠杆菌的1/3。其RNA的主要成分是21、16、4srRNA。所有的Ct都含有7.5kb的隐蔽性质粒，并且发现这种质粒与其它生物间没有同源序列。传统检测方法包括(一)细胞培养方法由于Ct的专性细胞寄生性，一般培养法不能使其生长，只有在活的细胞内才能增殖、复制。组织细胞培养法分离Ct多采用McCoy细胞或Hela细胞。细胞培养方法被认为是评价其他方法的"金标准"，也是WHO推荐的主要法之一。但是由于各个实验室操作步骤有所不同，没有标准化，且培养法对样品的预处理要求高，敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大、但敏感性一般较低；而分离培养操作复杂，技术及设备要求高,所需时间长，加上国内很多医院不具备细胞培养条件，因而不适于临床应用大规模检查多用于科研和疑难病例的终鉴定。(二)非培养的诊断方法1.直接荧光抗体测定(DFA):将针对Ct的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的Ct结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体(Ebs)。DFA不象培养法必须存在有活力的Ct,但其敏感性受人群感染率的影响，且有判定结果带有主观性，荧光易淬灭，不适于检测大量标本等缺点。其与细胞培养方法相比其敏感度和特异性相似，敏感度可达到75%85%，特异性也高于98-99%，但是与核酸扩增方法相比敏感度要低。2.酶免检测(EIAs):有多种应有EIAs检测临床样本中衣原体抗原的商品试剂盒应用单克隆或多克隆抗体检测衣原体的脂多糖(LPS)，其可溶性比外膜主蛋白(MOMP)好。酶免疫试剂法的主要优点是结果准确、快速易行,但与其他常见微生物产生交叉反应,如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌。3.核酸杂交技术(NAH):应用特异性探针与模板中的特定序列进行杂交，大大增加了检测的敏感性。4.核酸扩增(NAA):目前，可以用于沙眼衣原体检测的NAA方法一共有5种，分别是PCR扩增法、LCR法、转换介导的扩增AMP-CT、APTIMACombo2、链置换扩增的探针技术(stranddisplacementamplificationProbeTec)。其中最常用的是聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增法，该技术具有耗时少、扩增效率高、特异性强的特点，显示出了其在CT感染临床诊断中的优越性。传统的样本采集方法为"直接采集分泌物标本"细胞标本应在患处采用拭子或刮片的方法获取。(1)由于沙眼衣原体易感染柱状上皮细胞，所以宫颈标本的采集应在宫颈口或移行处进行，操作时，应先用1个拭子将宫颈口揩干净，然后再用一个拭子伸到宫颈管内转动或用一个刮勺(Pap刮勺取细胞)。(2)由于此种病原体还可以感染尿道，男性尿道炎患者，拭子应深入尿道2-4cm，并转动，以获取细胞。(3)阴道标本不适用于此项检査。(4)对于女性的输卵管炎的样本采集，需要在输卵管处进行针剌吸取。(5)此外，子宫内膜标本也可用于衣原体的检测。(6)脓性排除物由于其缺少感染的上皮细胞而不适用于此项检测，应该在对患处进行清洗后采取标本。病原体检测的质量保证机制有两点(1)需要室内质控样本对检测的可靠性；(2)实验室参加室间质评。Verkooyen等人，应用冻干的尿液标本进行了22个国家的96个实验室的CT的临床实验室室间质评工作，其中包括3个阴性，2个强阳性和5个弱阳性标本。结果显示检测弱阳性出错的情况为强阳性的三倍，突现了检测敏感性的问题。Chalker的研究详述了用检测相同宫颈内拭子标本沙眼衣原体的分子生物学和EIA方法的结果。发现只有在检测低浓度的沙眼衣原体时各种特异方法之间存在差异。在Sally的研究中评价了NAA方法在低浓度样本的检测效率。曾有学者应用冻干的尿液标本做为核酸扩增技术检测沙眼衣原体的质控物。还有研究曾将不同浓度的尿液以在干冰上运送的方式开展了澳大利亚57家应用roche或abbott检测沙眼衣原体的实验室的室间质量评价工作。不论以上哪种方法均需要对样本进行特殊处理、增加了操作复杂性和制作成本并具有一定的生物传染危险性，不适于大规模临床检测质量控制工作的开展，从而无形中限制了病原体检测的质量保证体制的完善。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性强、适用于各种实验室的沙眼衣原体的质控物。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案-一种检测沙眼衣原体的质控物，含有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的核苷酸序列或其互补序列。所述质控物为pTARGETTM-CT重组载体，采用以下方法构建(1)重组载体pTARGETTM-123的构建将片段123克隆入pTARGETTM载体，形成重组pTARGETTM-123载体；(2)重组载体pGEM⑧-TEasy-45的构建将片段45克隆入pGEM⑧-TEasy，形成重组载体pGEM-TEasy-45;(3)重组载体pTARGETTM-CT的构建以限制性内切酶NotI和SalI对重组载体pTARGETM-123和pGEM⑧-TEasy-45进行双酶切；T4DNA连接酶，4'C连接过夜，构建pTARGETTM-CT重组载体；(4)应用脂质体转染试剂盒LipofectamionTM2000，转染真核细胞。所述重组载体pTARGET-123从T7方向测序，为序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。所述重组载体pGEM-TEasy-45载体从T7方向测序，为序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。所述真核细胞为宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)。本发明的最终目的是将构建入真核细胞、含有所有常见检测目的基因的聚合酶链反应的质控物应用于临床实验室的室内质量控制和室间质量评价工作中。在第一部分中，我们针对沙眼衣原体隐蔽性质粒的历年常用检测序列分片段(表l)进行引物设计，并联合应用OverlapPCR和双酶切等分子生物学手段，构建一个包含了所有常见目的基因的重组载体、能够涵盖所有针对隐蔽性质粒进行检测的商品试剂和实验室自己建立的检测方法；并将此载体转染入宫颈上皮细胞中模拟临床样本的核酸提取过程，实现了质控物全程监控的要求。在第二部分的研究中，我们对该质控品进行稳定性研究，并在证实其稳定性的前提下进行了全国临床诊断实验室沙眼衣原体PCR项目的室间质量评价工作。针对通常实验室对于病毒基因含量高的样本检测符合率比较高，而对于低含量样本会出现漏检、甚至产生假阴性的情况。在本次室间质评研究中，着重考察各临床实验室对弱阳性样本的检测能力、发现临床工作中存在的问题，提高全国各实验室的诊断水平。同时证明此质控物具有较好的实用性，完全满足临床诊断实验室该项目室间质量评价的需求。表1:常见检测目的区域<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5，-TAATTGATCCA-AACTCTGGCTTTCCTC-3，5788-57625，-AGAGTACATCGGTCAACGA-3'358-3765，-TCACAGCGGTTGCTCGAAGCA-3，242-2225，-GTTTAAGTGTTCCCATCATAAAAACATATTC-3'1298-13285，-ATCCTTGTATCCTGTTGGAAGCCATCAAAG-3，1799-1769SetI:5，-GGACAAATCGTATCTCGG-3，1418-14355，-GAAACCAACTCTACGCTG-3'1935-1917SetII:5，-CAAGCTTAGATCCGTTTCTC-3，1466-14855，-CCTATAGATGGTCTAGCTGC-3'1867-1848SetI:5，--GGACAAATCGTATCTCGG-3，1418-14355，--GAAACCAACTCTACGCTG-3，1935-19175，--TTCCCCTTGTAATTCGTTGC-3'2720-27395，.-TAGTAACTGCCACTTCATCA-3，2558-25395，--CGTTGTAGAGCCATGTCCTATC-3'3118-31395，--GATGCATTTGGGAAGCGCAT-3，3222-32035，--CTTTTTCTATTCTAGGGTTACAAAA-3，5308-53345，--GACTCTGATAAAAATAATTGATCCA-3'5802-57785，--CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'204-2245，--TCCTCAGCCGTTTATGCACT-3，403-384SetI:5，--CGGCGTCGTATCAAAGATATCC-3'1398-14195，.-CAATTTGACCTGCGCTCATTTC-3，1965-1944SetII:5，'-CAAGCTTAGATCCGTTTCTC-3'1466-14855,.-CCCTATAGATGGCTTAGC-3，SetIII:5，--TGATTTGAGCGTGTGAGCG-3，1502-15215，-ATTCTCAGAGAACGCTGCTC-3，5，-GTTTAAGTGTTCCCATCATAAAAACATATTC-3'1298-13285，-ATCCTTGTATCCTGTTGGGAAGCCATCAAAG-3，1799-17685，-CAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGA-3，270-2935，-CAAGAGTACATCGGTCAACGAAGA-3'378-3555，-FAM-CCCCACCATTTTTCCGGAGCGA-TAM-3，5'-AATAGAAAATCGCATGCAAGATAT-3'1196-12195，-CGAGCCAGCACTCCAATTTA-3'1723-17055，-ACAGCGGTTGCTCGAAGCAC-3，224-2445，-GCATTGGACCGCATCACTCA-3，943-9245'-CGCATGCAAGATATCGAGTATGCGTTGTTCGG-3'1206-12375，-GACCGGCCTCTAGCGCTGCG-3'1678-1659注表示未找到与GeneBankX07547匹配的序列本发明不仅将历年来所有针对沙眼衣原体隐蔽性质粒为耙序列进行诊断的目的基因应用各种分子生物学手段进行连接、构建入一载体，并将此真核表达载体转染入宫颈上皮细胞(HTB-siha)中，实现了真正的全程监控。经商品试剂鉴定转染后的真核细胞中能够检测到目的基因。本发明的优点是(1)利用重叠PCR与双酶切的方法，建立了一种将多间隔片段连接并构建入同一载体的简便有效的方法通过OverlapPCR将多个间隔片断成功重组为一个长目的基因，与以往的在每个片段两端均增加酶切位点、经双酶切后连接将目的片段构建入载体的方法相比，减少了酶切位点的生成，为多片段插入同一重组载体提供了便利条件，方法切实可行。定向克隆避免了长距离PCR效率较低的可能，二者联用可取长补短。(2)成功地得到了无生物传染危险性可模拟临床标本、可以大量生产、稳定保存的沙眼衣原体聚合酶链反应检测质控物，且具有较好的适用性含检测目的基因的转染细胞无病原体活性、可以模拟临床标本的核酸提取过程、所有检测常见序列使此样本具有较广泛的适用性，因此此样本与曾出现的几种类型的质控物相比，更适于临床实验室CTPCR检测质控工作。下面结合具体附图和实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为pTARGETTM载体多克隆位点示意图、本研究所选限制性内切酶为NotI和SalI。图2为五段目的基因电泳示意图Sl、S2、S3、S4、S5分别为片段l、片段2、片段3、片段4、片段5扩增后的电泳图。图3为长片段目的基因电泳示意图Sl为重叠扩增后的片段12条带、S2为重叠扩增后的片段45条带、S3为重叠扩增后的片段123条带。图4为pTARGETTM-123重组载体电泳示意图其中Sl为自连的真核表达载体pTARGET;S2为pTARGETTM-123。图5为pGEM-TEasy-45重组载体电泳示意图其中S1、S2、S3、S4为pGEM-TEasy-45重组载体。图6为Sl为pTARGETTM-123经酶切后电泳示意图S2为pGEM-TEasy-45双酶切后示意电泳图。图7为Sl为pTARGETTM-CT重组载体双酶切后的电泳图S2为未经双酶切的重组pTARGETTM-CT载体。图8为PCR验证重组pTARGETTM-CT载体电泳示意图Sl为阴性对照；S2、S3、S4、S5为片断45的扩增产物。图9为传代培养的HTB-siha细胞。图IO为转染细胞荧光PCR扩增曲线图IOA为深圳匹基商品试剂对样本原液进行荧光PCR检测曲线图；图IOB为广州达安公司商品试剂对样本原液进行荧光PCR检测曲线图。图中黄色曲线为样本原液检测曲线，红色曲线为试剂盒中附带阴性对照，棕色、蓝色、粉色、绿色扩增曲线分别代表试剂盒中附带标准品l-标准品4，浓度分别为107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml以及104拷贝/ml。图11为转染细胞荧光PCR扩增曲线图各颜色曲线对应表5中不同成分样本。图12为百倍稀释样本扩增曲线图。图13为样本稳定性示意图*为4"保存样本稳定性曲线；B为37'C保存样本稳定性曲线；A为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环阈值表示。图14为千倍稀释样本扩增曲线图。图15为样本稳定性示意图*为4°0保存样本稳定性曲线；固为37'C保存样本稳定性曲线；A为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环阈值表示。图16为万倍稀释样本扩增曲线图。图17为样本稳定性示意图*为4t:保存样本稳定性曲线；國为37'C保存样本稳定性曲线；A为室温保存样本稳定性曲线。所有结果均用循环闺值表示。具体实施例方式实施例1:含CT隐蔽性质粒片段的重组载体的构建一.实验材料1.标本来源沙眼衣原体细胞培养物为本室保存、宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)购自中科院上海细胞库。2.主要试剂细菌DNA提取试剂盒天根生化中国离心柱型普通凝胶DNA回收Kit天根生化中国Taq聚合酶Promega公司美国DNA电泳Marker:DL2000Takara日本DNA电泳Marker:DL15000Takara日本TA克隆试剂盒(T-Easy载体)Promega公司美国质粒(小量)抽提试剂盒Promega公司美国限制性内切酶SalINewEnglandBiology美国限制性内切酶NotINewEnglandBiology美国T4DNA连接酶Promega公司美国菌株DH5aE.Coli.BL21-DE3E.Coli.本室保存(均为常规菌株)pTARGET真核表达载体Promega公司美国真核细胞转染试剂Lipofectamion2000Invitrogen公司美国细胞培养基DMEM(高糖)Hyclone公司美国0.25。/Q胰酶Hyclone公司美国沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂广州达安公司中国沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂深圳匹基公司中国3.实验仪器梯度PCR仪(PTC-200PeltierthermalCycler)MJReasearch美国梯度PCR仪(MastercyclerepPCR仪)Eppendorf公司德国PCR仪(GeneAmpPCRSystem2400)美国生物应用系统美国实时荧光PCR仪(7500RealTimePCRSystem)美国生物应用系统美国实时荧光PCR仪(Lightcycler)Roche公司美国实时荧光PCR仪(Line-genePCR仪)杭州博日科技有限公司中国琼脂糖水平电泳槽(DYCP34A型)北京六一仪器厂中国双稳定时电泳仪(DYY-6C型)北京六一仪器厂中国凝胶成像分析系统(ChemiDocXRS)Bio-Rad公司美国恒温摇床(C24INCUBATOESHAKER)NewBranswickScientific公司美国台式高速离心机Heraeus公司德国高速低温离心机(BECKMANMicrofuge)BECKMAN公司美国超速低温离心机(SIGMA3K30LaboratoryMicrofuge)SIGMA公司德国D-型超纯水机USFELGARESERVOIR75L美国恒温水浴箱武汉WZ-I型智能无级温控仪中国微量恒温器(CHB-202)杭州博日科技有限公司中国AE160电子天平Mettler公司美国恒温磁力搅拌器IKA公司德国MS2型旋涡混悬器IKA公司德国深低温冰箱SANYO曰本荧光倒置显微镜OLYMPUS美国C02孵箱SANYO日本Eppendorf系列微量加样器Eppendorf公司德国4.主要耗材一次性培养皿卯mm中国AXYGEN螺口离心管0.5ml美国Eppendorf离心管1.5ml德国AXYGEN带虑芯加样器吸头0.5-101,10-100P1,20-200P1,100-1000P1美国Corning公司离心管15ml，50ml美国AXYGEN扩增管0.2ml美国Corning公司移液管5ml美国Coming公司细胞培养瓶25cm2、75cm2美国Corning公司细胞培养板6孔、24孔美国二.实验方法1.引物设计由于对沙眼衣原体质粒进行扩增后检测敏感性最高，因此本发明对以CT隐蔽性质粒为靶序列的文献进行统计后发现，对其进行扩增检测的序列较为分散，在文献中出现过的检测引物范围大致分为5个区域，分别是设计引物178-610、1219-1993、2471-3260、5239-5864、6722-7499以上位点均以NCBI/BLAST中C.trachomatisplasmidDNAforgrowthwithinmammaliancells(GeneBankX07547)位点为准进行证实。表2:扩增CT隐蔽性质粒各片段的五对引物<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注P4.1下划线含Sail位点，P5.2下划线含Notl位点本发明根据表l所示检测基因设计五对引物(见表2)，对CT隐蔽性质粒的常用检测区域进行扩增,所述位点均以NCBI/BLAST中C.trachomatisplasmidDNAforgrowthwithinmammaliancells位点为准进行证实,GeneBankX07547。2.病原体核酸提取应用天为时代细菌提取试剂盒进行CT核酸提取，操作步骤如下取细菌培养液l-5ml，lO，OOOrpm离心1分钟，尽量吸净上清。向菌体沉淀中加入20(￥1缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。向管中加入20l4蛋白酶K溶液，混匀。加入220W缓冲液GB，振荡15秒，7(TC放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加220Ml无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500W去蛋白液GD，12,000离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700W漂洗液PW(确定已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500W漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或5(TC温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200W经65-70'C水浴预热的洗脱缓冲液TE,室温放置2-5分钟，12，000rpm离心30秒。离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12，OOOrpm离心2分钟。(洗脱缓冲液体积最好不少于50W，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存-20°C，以防DNA降解)。3.五段模板的制备应用5对引物分别进行扩增。反应体系50^1反应体系中含10mmol/LTris2HCl(pH8.3)，5Ommol/LKC1，1.5mmo1/LMgCl2，每种dNTP20(Himo1/L，两条引物浓度各为0.2pmol/L，1.5UTaqDNA聚合酶。50pl反应体系PlP21.0u1dNTP1.0ulMg2+3.0ul模板5.0"buffer5.0ulDEPC水33.6PlTaq酶0.4U1循环参数94°C94°C58°C72°Cl.Oy15min30s30sl:30min一3572°C7min4.PCR产物的回收纯化将PCR产物进行电泳，用干净的刀片切取含目的条带的胶块，胶块要尽量小并尽量多含目的片段，放入1.5ml离心管中。称量该胶的重量，尽量不超过150mg。不足100mg的加入ddH2O补至100mg。按lmg相当于1iU换算，以溶胶液胶重量比为3:1的比例加入溶胶液。置50'C水浴10min，每隔2min振摇一次，使胶完全溶化。将混合液转移至套在干净接液管上的离心柱内，12,000g，离心lmin。弃去接液管中的液体，重新插入离心柱。在离心柱上加洗柱液750ul，12，000g，离心30s。加洗柱液250ul，重复步骤4。将离心柱转移到干净的接液管上，空柱离心12,000g，2min。将离心柱转移到干净的接液管上，加入6(TC-70。C预热的d犯2030u1室温放置lmin，离心lmin。所得溶液为回收的DNA溶液。5.T-A克隆(O采用pGEM⑧-TEasy载体以及2X快速连接缓冲液进行连接反应短暂离心pGEM-TEasy载体及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底；按表3方法建立连接反应。注意使用低DNA结合力的0.5ml离心管；每次使用2X快速连接缓冲液时要充分混匀；用移液器吹打连接反应使之混匀后，4'C孵育过夜。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*PCR产物载体的摩尔比可能需要进行优化(2)优化插入片段和载体的摩尔比:pGEM-TEasy载体系统优化的插入DNA对照片段和载体的摩尔比为1:1，采用8:1到1:8的连接比例也可成功进行连接。如果PCR产物连接的不理想，则有必要优化连接比例。一般开始采用3:1到1:3的连接比例。PCR产物的浓度可通过凝胶电泳上的DNA分子量标准进行估计或采用荧光定量。pGEM-TEasy载体大概3kb大小，系统提供的载体浓度为50ng4U。计算连接反应中需要的PCR产物的量可采用以下公式加入载体的量(ng)X插入片段大小(kb)X插入片段和载体的摩尔比二插入片段的量载体大小(kb)6.转化使用高效率的感受态细胞进行转化，在LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板筛选转化子。LB平板(含有氨苄/IPTG/X-Gal);每个连接反应准备1个LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板，涂板前将平板平衡至室温。离心使连接反应内容物汇集到管底，取2ul连接反应产物加到置于冰上的1.5ml离心管中。将冻存的JM109高效率感受态细胞从一70'C冰箱中取出，放置在冰浴直至融化(大概5分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。向前述步骤准备好的每个转化管中加入50ul感受态细胞。轻轻振动小管混匀，冰浴20分钟。在精确的42'C水浴中热击45_50秒。迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950tULB培养基。在37'C振荡培养(150rpm)1.5小时。将每个转化培养基100y1涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。将平板于37'C过夜培养(16—24小时)。长时间孵育或将平板37'C过夜培养后贮存在4'C，有助于蓝白斑筛选。白色克隆菌一般包括插入子。7.质粒提取O)获得澄清裂解液将l-5ml(高拷贝的质粒)或10ml(低拷贝的质粒)的细菌培养物用台式离心机10,000xg离心5分钟。弃去上清并将试管倒置于纸巾上吸去剩余的培养液。加入250^1细胞悬浮液并旋涡震荡或吹打以充分悬浮细胞。加入25(^1细胞裂解液并颠倒离心管4次以充分混合。孵育至细胞悬浮液澄清，大约需要l-5分钟。加入1(Hil碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混合。于室温孵育5分钟。碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。加入350^1WizardPlusSV中和溶液并迅速颠倒离心管4次以充分混合。于室温将细胞裂解液以最大速度离心IO分钟。(2)质粒DNA的分离及纯化将澄清裂解液(大约85(HU)转移至准备好的离心柱中。不要搅动或将任何白色沉淀与上清液一同转移。于室温用离心机以最大速度离心上清液1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。加入75(Hd先前用95%酒精稀释过的柱清洗液。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。从收集管中取出离心管并弃去收集管中的液体。将离心柱重新插入收集管中。用250^1柱清洗液重复清洗步骤。于室温用离心机以最大速度离心2分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中，操作时需小心，不要将任何柱清洗液与离心柱一同转移。如果离心柱上粘有柱清洗液，则重新以最大速度离心1分钟。将离心柱转移至一个新的1.5ml消毒离心管中。将IOOW无核酸酶的水加入离心柱以洗脱质粒DNA。于室温用离心机以最大速度离心1分钟。洗脱质粒DNA后，将离心柱从1.5ml消毒离心管中取出并弃去离心柱。不加缓冲液的DNA水溶液在-2(TC及以下是稳定的。TE缓冲液中的DNA在4'C是稳定的。如果需要将DNA存放于TE缓冲液中，将IOXTE缓冲液加入lOOpl洗脱的DNA中。将离心管盖好并将纯化后的质粒DNA存放于-2(TC或以下。8.重叠(Overlap)PCR获得长片段目的基因在进行重叠(Overlap)扩增时，将各段纯化后产物进行OD260测定，按照摩尔比l:l的关系加样，使扩增能够平衡进行。此步骤在片段大小相差悬殊时尤为重要。(1)合成片段12、片段45:反应体系50反应体系中含10mmol/LTris2HCl(pH8.3),50mmol/LKC1，3.0mmo1/LMgC12,每种dNTP200nmo1/L,两条外端引物浓度各为0.2pmol/L,1.5UTaqDNA聚合酶。50^11反应体系Pl.1/4.11.0ulP2.2/5.21.0lUdNTP2.0ulMg2+6.0ul片段"1'7片段"4"2.5ul片段"2"/片段"5"2.5ulbuffer5.0UlDEPC7jC29.6u1Taq酶0.4u1循环参数94°C5min94°C30s60°C30s一1072。Cl:00min94°C5:00min—加(pi.i和p2.2)或(p4.l和p5.2)94°C30s，58°C30s卜3072°Cl:OOmin72°C7:00min(2)合成片段"123":反应体系50Ul反应体系中含10mmol/LTris2HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl,3.0mmol/LMgC12,每种dNTP200umol/L，两条引物浓度各为0.2wmol/L,1.5UTaqDNA聚合酶。由实验结果得知片段"12"回收纯化OD260=0.020ng/ml约1200bp片段"3"回收纯化OD260-0.029pg/ml约800bp若使"l+2"与"3"的摩尔比为1:1，则(0.02/1200)承x1(0.023/800)*y1x"3.5u1,产1.5u15(V1反应体系PUP3.21H1dNTP2ulMg2+6.0U1片段"l+2"3.5iU片段"3"L5ixlbuffer5.0ulDEPC水29.6y1Taq酶0.4u1循环参数94°C94°C61。C72°C94°C94。Clul5min30s1:OOmin2:00min5:00min30s11加pi.1和'p3.2和酶(2U/50u1)58°C30s加72。C2:00min72°C7:00min9.构建重组载体pTARGETTM-123:由实验结果得知片段"123"回收纯化OD260=0.132^ig/pl约2000bp巳知pTARGETTM全长5670bp以插入片段与载体摩尔比=1:8设计实验vector1(60/5.67)"insert8(132/2)*yy=1.40连接反应体系T4DNA连接酶的2X快速连接缓冲液5^1pTARGET载体lulPCR产物1.4|ilT4DNA连接酶lpl补加去离子水至终体积l(Vl4'C连接过夜。10.构建重组载体pGEM-TEasy-45:连接反应体系T4DNA连接酶的2X快速连接缓冲液5plpTARGET载体1^1PCR产物3^1T4DNA连接酶lpl4'C连接过夜。11.限制性内切酶消化质粒DNA图1为pTARGETTM载体多克隆位点示意图、本研究所选限制性内切酶为NotI和Sall。限制性内切酶反应体系(50nl):10*NEB缓冲液5)xlDNAS2|ig100*BSA0.5til内切酶(进行双酶切时各加"l)pTARGETTM-12310*NEB缓冲液灭菌双蒸水至50^1(1)获得开环重组载体pTARGETTM—123:由实验结果得知反应体系DNA9^1IOO承BSA0.5|_ilNotIlplSail灭菌双蒸水33.5pl37。C过夜。(2)获得具有粘性末端的片段"45":由实验结果得知pGEM-TEasy-452吗/0.135^14.8pl10*NEB缓冲液5|xlOD260=0.219|ag/pl5plOD260=0.135pg4il反应体系DNA1，100*BSA0.5nlNotIlplSaillpl灭菌双蒸水28.5^137。C过夜。12.构建重组载体pTARGETTM-CT:依《分子克隆》连接反应体系载体400ng,片段-10ng,按摩尔比1:3—3:l的关系进行实验。由实验结果得知pTARGET-123OD260-0.0260吗/pl片段"45"OD260=0.018pg4il连接反应T4DNA连接酶lul10*bufferlulpTARGETTM-1234yl片段"45"4ul4r连接过夜。13.细胞培养(1)胰酶消化，传代取出冻存的液态0.25%胰酶置于冷水中溶化；待溶化后置于超净台中，以75%酒精消毒；取出培养瓶，置于超净台中75%酒精消毒；将旧培养基倒入废液缸，尽量倒净；吸取少量胰酶于培养瓶中，迅速、轻轻转动培养瓶，将其倒入废液缸；加入约3ml胰酶消化4分钟；加入含血清培养基终止消化；反复吹打细胞，使其从壁上脱离；将吹打后的培养液倒入离心管中，以800转/分钟离心IO分钟；倒出上清，加8ml培养基于管中重悬细胞；将培养基分装于两个新的细胞培养瓶中、拧紧盖子；置于37"C、02细胞培养箱中，拧松瓶盖、进行培养。(2)细胞换液取出培养瓶，置于超净台中，以75%酒精消毒；将旧培养液倒入废液缸中；取3ml含10%小牛血清的新鲜细胞培养液于培养瓶中，拧紧盖子；置于37'C、5。/。C02细胞培养箱中，拧松瓶盖、进行培养。14.转染真核细胞应用脂质体转染试剂盒LipofectamionTM2000进行实验(1)质粒DNA的转染按照下述步骤将质粒DNA转染入24孔培养板生长的哺乳动物细胞中。不同型号培养板每孔所需细胞数量及溶液体积见表4。大部分细胞系需要DNAOg)与Lipofectamine2000(ul)混合物的比值在1:2至1:3之间。转染前—天，在无抗生素的培养液中以0.5-2x107500yl的细胞浓度进行铺板，使其在转染时细胞密度达到90-95%。每孔转染样本均按照下列说明准备将DNA加至50ul无血清的Opti-MEMI培养基中进行稀释，轻柔混匀。用之前，先将MixLipofectamine2000轻柔混匀，加适当的量于50ul0pti-MEMI培养基中、混匀。室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将稀释后的DNA与稀释后的LipofectamineTM2000进行混合(总体积100ul)。轻柔混匀并在室温下孵育20分钟；力[U00ul混合液于孔中，前后晃动轻柔混匀。转染后于37'C、5%C02孵箱温育18-48小时，孵育至4-6小时需要更换培养基。(2)转染的优化为了得到高转染效率和低细胞毒性，通过改变DNA与Lipofectamine2000浓度来优化转染条件。确保细胞融合大于90%，并改变DNA(yg):Lipofectamine2000(yl)在1:0.5至1:5之间。_表4:各类型培养板所需样本量一览表_培养板每孔表面积铺板培养基体积DNALipofectamineTM2000<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>15.转染细胞的鉴定将转染后细胞进行增殖、收获，应用深圳匹基和中山达安沙眼衣原体PCR检测试剂盒进行鉴定、研究其适用性。(1)应用深圳匹基商品试剂盒进行鉴定A.样本处理充分振荡混匀样本取出10(mi，加入100M1DNA提取液1，振荡混匀；13，000rpm离心15min，吸弃上清；加入50WDNA提取液2，振荡混匀；10(TC沸水浴/干浴10min，13,OOOrpm离心lOmin，保留上清待用。B.扩增试剂准备从试剂盒中取出CT&NG反应液、CTPCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec;设所需要的PCR反应管管数为n(n=样本数+l管阴性对照+l管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下试剂CT&NG反应CTPCR反应液Taq酶UNG用量18.18.0.4^10.06W计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR反应管中分别加入38W，转移至样本处理区。C.加样若样本裂解产物保存在-2(TC，置室温解冻，13,000rpra离心5min;在所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤l中处理过的样本上清及试剂盒中的阴性对照和阳性对照各2W，盖紧管盖，转移至检测区。将PCR反应管排放好放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。D.PCR扩增循环条件设置37°C5min;94°Clmin;95°C5sec，60°C30sec,40个循环。反应体系设为40W。仪器检测通道的选择荧光信号收集时设定为Fam荧光素；荧光信号收集设在6(TC。(2)应用中山达安公司商品试剂盒进行鉴定A.DNA提取取出阴性质控品，8，000rpm离心数秒，吸50W至0.5ml灭菌离心管中，加入50WDNA提取液充分混匀，IOCTC恒温处理IO分钟；12，000rpm离心5分钟，备用。B.标本处理充分振荡混匀样本取出10Cmi，12,000离心5分钟；去上清，沉淀中加入50M1DNA提取液充分混匀，IO(TC恒温处理IO分钟；12，000rpm离心5分钟，备用。CT临界阳性质控品处理、CT强阳性质控品处理同阴性质控品。CT阳性定量参考处理8,000rpm离心数秒，备用。C.PCR扩增①试剂准备按比例(CT-PCR反应液40W/人份+Taq酶3W/人份)取相应量的PCR反应液及T叫酶，充分混匀后按43Ml/0.2ml加样于离心管中，备用。②加样向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2W，或直接加入阳性定量参考品2W，8，000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。③循环条件设置93°C2分钟93。C45秒——55。C60秒IO个循环93。C30秒——55。C45秒30个循环保存文件，运行。16.质控物检测下限的研究(1)获得系列稀释浓度样本将阳性质控物原液进行倍比稀释，稀释浓度分别为1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000、1:10000000。(2)应用商品检测试剂进行检测应用沙眼衣原体商品检测试剂盒(深圳匹基生物技术公司)在同一人员操作、同一仪器、耗材、同时进行检测，对比结果、探讨质控物的检测下限。三.实验结果1.获得五段目的基因-分别应用上述5对引物对沙眼衣原体核酸提取物进行扩增，获得目的片段长度分别为433+25bp(图2A)、775+45bp(图2B)、790+24bp(图2C)、626+32bp(图2D)、778+41bp(图2E)，如图1所示、所有结果均与预期一致。2.获得长片段目的基因将片段l与片段2进行0verlapPCR得到片段12，产物长度为1231bp，比片段l与片段2实际大小相加小46bp，结果见图3A;将片段4与片段5进行0verl即PCR得到片段45，产物长度为1432bp，比片段4与片段5实际大小相加小45bp，结果见图3B;图3C所示为片段123的条带，产物长度为1998bp，比片段12与片段3实际大小相加小48bp。上述结果均与预期一致。(1)构建pGEMS-TEasy-45载体，测序结果如下T7方向(序列表SEQIDNo.3):AGAATTTGGATAGACATTAGCTACAGAATCTTCTTAAGAAGAGAACCGGCTGAAAASP6反向互补(序列表SEQIDNo.4):TCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCG(2)构建pTARGET111-123,测序结果如下T7方向(序列表SEQIDNo.1):SP6方向(序列表SEQIDNo.2):3.重组载体的构建(1)重组载体pTARGETT"-123的构建将片段123首先克隆入pTARGET""载体，形成重组pTARGET"1-123载体，如图4-S2所示、已知pTARGETTM的大小为5670bp、重组pTARGET"1-123载体的大小约为7670bp，但是超螺旋结构的质粒在琼脂糖凝胶电泳上的泳动速度快于其线性结构，所以电泳位置要小于实际载体大小。(2)重组载体pGEM-TEasy-45的构建将片段45克隆入pGE^^-TEasy，形成重组载体pGEM-TEasy-45，大小应在4400bp左右，但由于质粒的超螺旋结构造成泳动速度较快、条带位置更接近于2500bp，如图5所示。(3)重组载体pTARGETTM-CT的构建以限制性内切酶NotI和SalI对上述重组载体进行双酶切，图6为其电泳示意图。图6-Sl所示为线性重组载体pTARGETTM-123经酶切后电泳条带，位于Marker7500左右，与预期结果一致。图6-S2所示为pGEM-TEasy-45经双酶切后电泳条带，其中泳动速度较快的是具有粘性末端的片段45、约1400bp，与预期结果一致。以限制性内切酶NotI和SalI对己构建的pTARGETTM-CT重组载体进行酶切验证，见图7。图7-Sl为经双酶切验证的pTARGETTM-CT重组载体电泳示意图，其中泳动速度较快的为片段45、约1400bp，泳动速度较慢的为线性pTARGETTM-123重组载体、位于Marker7500左右。由此我们判定重组载体pTARGETTM-CT构建成功。图7-S2为未经酶切的重组pTARGETT"-CT载体、约9000bp，由于载体本身的超螺旋结构造成其泳动速度较快。以引物P4.1/P5.2对重组载体pTARGETT"-CT进行PCR验证，结果见图8。扩增产物约1400bp、大小与片段45相同，而阴性对照无扩增产物，排除了产物污染引起的假阳性可能，认为重组pTARGETTM-CT载体中确含有片段45。将该样本送菌测序，回报结果为测序反应信号弱。经咨询，高度怀疑此重组载体形成空间结构影响其测序反应的正常进行。由于该载体大小己经高达9000bp，其形成空间结构的几率明显大于长度相对较小的载体。本实验中，PCR验证可得到目的条带，且阴性对照无任何特异性条带产生，因此判定此重组载体中存在目的基因，即pTARGETTM-CT重组载体构建成功。且双酶切验证显示两条产物位置均与理论位置一致，再次验证此载体构建成功。4.细胞培养图9所示为传代培养的HTB-siha细胞。5.转染细胞的鉴定将转染后细胞进行增殖、收获后，应用不同沙眼衣原体PCR检测试剂在相同荧光定量PCR仪(杭州博日公司Line-gene)上对样本原液进行鉴定。深圳匹基生物技术公司商品试剂盒检测结果见图10A;图IOB显示结果为中山达安生物技术公司所产商品试剂的检测结果。样本原液在不同商品试剂检测过程中曲线均呈S型扩增，检测结果呈强阳性。6.质控物检测下限的研究应用深圳匹基商品试剂对倍比稀释后的样本在荧光定量PCR仪(杭州博日公司Line-gene)上进行检测，具体结果见表5;图ll为检测曲线图。由此可见，倍比稀释后的高浓度样本检测结果变化呈梯度下降趋势，即每稀释10倍其循环阈值增加3.3左右，符合PCR指数扩增规律；倍比稀释后的低浓度样本不遵循此规律。表5:各样本检测结果、以CT值表示，各样本所对应的颜色与图10所示颜色一致<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>本质控品检测下限值为104-105左右，为临床诊断试剂盒检测下限，已能满足临床检测需要。OverlapPCR方法在过去的研究中是一种构建定点突变体常见的技术方法，在本次研究中，我们应用这一技术进行多间隔片段的连接，并取得了良好的效果。此外，以OverlapPCR技术进行片段的连接与以往的在每个片段两端均增加酶切位点、经双酶切后连接将多个目的片段构建入同一载体的方法相比，减少了酶切点的生成，为重组载体的构建提供了便利条件。实施例2:质控物的稳定性研究及应用于临床实验室的CTPCR检测室间质量评价一.实验材料1.标本来源实施例1构建的沙眼衣原体PCR检测质量控制物2.主要试剂细胞培养基DMEM(高糖)Hyclone公司美国沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂广州达安公司中国沙眼衣原体荧光定量RT-PCR检测试剂深圳匹基公司中国3.主要仪器实时荧光PCR仪(7500RealTimePCRSystem)美国生物应用系统美国实时荧光PCR仪(Lightcycler)Roche公司美国实时荧光PCR仪(Line-genePCR仪)杭州博日科技有限公司中国台式高速离心机Heraeus公司德国高速低温离心机(BECKMANMicrofuge)BECKMAN公司美国超速低温离心机(SIGMA3K30LaboratoryMicrofuge)SIGMA公司德国C02孵箱SANYO日本Eppendorf系列微量加样器Eppendorf公司德国4.主要耗材ABI扩增板96孔美国E卯endorf离心管1.5ml德国AXYGEN带虑芯加样器吸头0.5-10ul，10-100ul，20-200u1，100-1000y1美国Corning公司离心管15ml，50ml美国Corning公司移液管5ml美国Corning公司细胞培养瓶25cm2、75cm2美国Corning公司细胞培养板6孔、24孔美国二.实验方法1.样品稳定性研究将阳性样本原液进行1:100、1:1000、1:10000、1:10000稀释、放置于各条件下、保存不同时间后应用沙眼衣原体商品检测试剂盒(深圳匹基生物技术公司)进行检测，具体条件见表9。(1)倍比稀释原液稀释液成分含20%小牛血清的稀释液(含防腐剂)倍比稀释以阳性样本原液进行1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释1:IOO稀释取2ml至200ml稀释液中；1:1000稀释从l:100稀释的200ml中充分震荡混匀、取出20ml加入180ml的2(^小牛血清稀释液中进行稀释；1:10000稀释从l:1000稀释的200ml中充分震荡混匀取20ml，加入180ral的20yo小牛血清稀释液中进行稀释；1:IOOOOO稀释从l:10000稀释的200ml中充分震荡混匀取20ml，加入180ml的20M小牛血清稀释液中进行稀释。(2)具体条件本实验将研究样本在37。C、室温、4'C、-2(TC以及-7CTC至室温反复冻融3次的样本稳定性。具体条件见表6。表6:稳定性研究放置条件放置时间37°C，相对湿度60-80%l天3天7天2周3周4周室温(20-25。C20—25%)2—8°C相对湿度1天3天1周2周3周4周6周_8周1周2周3周4周6周8周12周16周24周32周64周-20。C4周8周16周<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(3)样本分装分装前将生物安全柜清洁消毒，紫外照射30分钟；选用DNAse的螺口离心管(盖子有密封圈)，在生物安全柜内分装液体制备物，分装量为每支0.5ml。2.鉴定应用深圳匹基商品试剂对各浓度、不同温度保存样本进行荧光PCR检测，观察其稳定性。实验中使用同一批次试剂，同一仪器、相同耗材并经同一人员操作、严格按操作说明进行。(1)样本处理充分振荡混匀样本取出100W，加入100WDNA提取液1，振荡混匀；13,000rpm离心15min，吸弃上清；加入50WDNA提取液2，振荡混匀；100。C沸水浴/干浴10min，13，000rpm离心10min，保留上清待用。(2)扩增试剂准备从试剂盒中取出CT&NG反应液、CTPCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec;设所需要的PCR反应管管数为n"=样本数+l管阴性对照+l管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下试剂CT緒G反应液CTPCR反应液Taq酶UNG用量18.18.8f40.糾0.(3)加样若样本裂解产物保存在-20'C，置室温解冻，13，000rpra离心5min。在所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤l中处理过的样本上清及试剂盒中的阴性对照和阳性对照各2W，盖紧管盖，转移至检测区。将PCR反应管排放好放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。(4)PCR扩增循环条件设置37°C5min;94°Clmin;95°C5sec，60°C30sec，40个循环。反应体系设为40W;仪器检测通道的选择荧光信号收集时设定为Fam荧光素。荧光信号收集设在6(TC。3.统计学分析应用SPSS11.5统计分析软件对所得数据进行分析。本实验应用随机区组的多因素方差分析对实验数据进行统计学检验。检验显著性取。=0.05,P〈0.05有显著性差异。4.临床实验室室间质量评价(1)样本组成将质控物按照原液l:100、1:1000、1:10000倍稀释，样本组成为1:1001:10001:10000阴性质控l个1个2个1个(2)全国室间质量评价每个实验室发放5份样本同时附带相同的操作说明及结果报表，由于临床检测一般为定性检测，因此回报表中填报项目为检测日期，检测结果(填写阴性或阳性)，所用仪器及试剂，操作者等重要项目。三.实验结果1.稳定性研究本实验对保存4周内的样本稳定性进行阶段性研究，为下一步的室间质量评价做前期准备工作。经同一批次沙眼衣原体检测试剂盒(深圳匹基公司)检测，具体数据如下(1)倍稀释样本稳定性研究见图12、图13和表7。表7:百倍稀释样本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注所有结果均用循环阈值表示。上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将百倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37'C、室温以及4XM呆存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析P〉0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明百倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。(2)千倍稀释样本稳定性研究见图14、图15和表8。表8:千倍稀释样本检测结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>注所有结果均用循环阈值表示。上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将千倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37'C、室温以及4'C保存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析P〉0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明千倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。(3)倍稀释样本稳定性研究见图16、图17和表9。表9:万倍稀释样本检测结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>注所有结果均用循环阈值表示。上述三个图表分别用不同的方式直观地反映出将万倍稀释样本的稳定性。我们认为该样本在37'C、室温以及4'C保存情况下其性能并无明显改变、应用商品试剂盒检测结果比较稳定。应用SPSS统计分析软件对检测结果进行统计学分析P〉0.05证明不同温度之间的检测结果无统计学意义，说明万倍稀释样本在不同温度条件下至少可以稳定保存一个月。2.室间质量评价结果将各种浓度分装编号后发往全国160余家PCR实验室，对已回报88家实验室检测结果进行整理，见表10。对l:100倍稀释的样本的检测符合率平均为100%，对1:1000和l:10000的样本的检测符合率为98.9%。阴性样本的符合率为100%。表10:全国各家实验室测定结果统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>对各家实验室所用试剂进行统计，结果见表11。表11:各种试剂测定结果统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>深圳匹基生物技术有限公司阳性2610071286上海市传染病医院诊断试剂研制中心阴性1100广东中山生物工程公司阴性1100达安基因诊断中心阴性53100阴性上海复星医学科技发展有限公司(PCR)阴性3100厦门安普利生物工程公司阴性2100深圳匹基生物技术有限公司阴性2610071387上海市传染病医院诊断试剂研制中心阳性1100广东中山生物工程公司阳性1100达安基因诊断中心阳性541001/10000上海复星医学科技发展有限公司(PCR)阴性阳性1233.366.7厦门安普利生物工程公司阳性2100深圳匹基生物技术有限公司阳性261001/1000071487上海市传染病医院诊断试剂研制中心阳性1100广东中山生物工程公司阳性1100达安基因诊断中心阳性54100上海复星医学科技发展有限公司(PCR)阴性阳性1233.366.7厦门安普利生物工程公司阳性2100<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>ABI7700荧光定量PCR仪阳性2100ABI7000荧光定量PCR仪阳性11100ABI7300荧光定量PCR仪阳性6100RotorGene阳性1画Line-gene阳性4100MJResearch0pticonII阳性8100FTC2000阳性2100DA7600核酸扩增实时荧光检测阳性3100SLAN荧光定量PCR仪阴性150阳性150其它PCR仪(请详述)阳性31001/1000071482ABI9700PCR仪阳性1100ABI5700荧光定量PCR仪阳性19100ROCHELightcycler(毛细管)阳性16100Bi0-R3diCycle阳性4100ABI7700荧光定量PCR仪阳性2100ABI7000荧光定量PCR仪阳性11100ABI7300荧光定量PCR仪阳性6100RotorGene阳性1100Line-gene阳性4100MJResearch0pticonII阳性8100FTC2000阳性2100<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>本之间的结果变异无统计学意义，可以认为该样本在各个条件下均可稳定保存。本研究由同一人应用同一批次检测试剂、在同一时间、应用ABI7500荧光定量PCR仪对所有样本进行统一检测。排除了由于不同批次商品试剂或仪器稳定性能以及人为操作因素对检测结果产生的影响，公正客观地反映出各样本的变化趋势、更具说服力。全国各医院临床PCR实验室室间质评结果显示此质控物具有较好的适用性。且各实验室的检测准确性较高，对l:100倍稀释的样本的检测符合率平均为100%，对l:1000和1:10000的样本的检测符合率为98.9%。在回报表中无假阳性结果的出现，说明临床工作中在CTPCR检测方面准确性较好。同时也证明本质控品完全满足临床实验室室间质量评价要求。序列表<110>卫生部北京医院〈120>—种检测沙眼衣原体的质控物〈130>〈160〉4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211>1200<212>腿<213〉人工合成<400>1arkkwkkkwasttcwctgctctggccgycrtggcggccgcgggaattcgattccctgtaa60tcacccagtcgat已已atgtgt犯gcatactttgatgcatttggg鄉tgcatttttattt120cttggtatacatttgcaggcttgattacaaagtaggattctatttgatct已cca^geita^g180gacatggctctacaacgaaccctttatgtttccgtgtakatggtg33tt3aaaggtgtta240agtctatatctatattttcttcgtc已gttaaaccttcccatccttcgtaa300tcgg卿犯g3gtttggt36Lcggtctactatttgtgttccattagtccatcgagttctag360ttgccactattasELaa^cggttgatgtcctaggcttct犯agcagtttcag420cttcttttccactaaactcatacttatttctggatgttttataccgcttaactccataag480cctctaag犯ttcagtttttgt33a^cggattcttggtatccatccttcaaattgaaaac540tatttgattctctggeit3a^acaaccccttttgtgttccccttgtaattcgttgcagtca600gcaatctttggatagctgct犯tgC3tggtag已cctat犯660cttctaccatcccattttgagcc已atttgggagatatctt犯tagattg3ccaggtcttc720ttcc犯acttctgattttca3ggtgg￡Lt8ggacttttgatg32lgtggC3gttactataat780ttaccatacttttttaatagactaatttttgg3Cg犯3tg840gagyctgtta犯ttagcaataatccgctca已caatttgacctgcgctcatttctagagat900agg犯8ccaactctacgctgttgagtaacc已c3Eigatttatcgccatgtcteitagct^a960gcagttttccctatagatgggcct已gctgctataatcacgtagct犯g3t1020gactcctttatcatcaatatccttgtatcctgttgggaaggcatcaakaa3g^ttttg31080atctcagagaacgttgctcgtctttttttawacgagccagcactccaatttctgactgyg1140ggcctctagcgcctgcgaataga犯agtcwtgctagcact1200〈210〉2〈211〉1200<212〉腿〈213〉人工合成〈400〉2ggrrctwgmtcaygcgttgggsgctctccykgtggtcgscctgcaggcggccgcgaattc60actagtgattccgctcgagcttcattatgtcggsgtctgagC3CCCt3ggcgtttgtact120ccgtcacagcggttgctcgaagcacgtgcggggttatcttaa犯gggattgc已gcttgta180gtcctgcttgag卿acgtgcgggcgatttgccttaaccccaccatttttccggagcgag240ttacgaagacaaaacctcttcgttgaccgatgtactcttgt3g已^gtgCaCB￡L￡LCttCt300gggg3t犯gtt3t^t33tCctcttttctgtctgacggttcttaagctggg已g3a^gaa3360tggtagcttgttgg犯ac犯atctgactaatctccaagctta^g3cttc3gaggagcgtt420tacctccttggagcattgtctgggcgatcaaccaatcccgggcattgatttttttteigct480cttttagaaaggacgctgtttgcaaactgttcgagtatgcgttgttaggtaaagctctga540tatttgaagactctactgagtatattctgaggcagcttgct犯tt3tg3gttt犯gtgtt600ctcatcataaaaacatattcatagtatttaaatactta犯agacaatggattacctataa660ctgt卿ctcggcttgggaagagcttttgcggcgtcgtatgsca^tcgt720atctcgggttaatgttgcatgstgctttatc犯atgac犯gcttagatccgtttctcata780cggttttcctcgatgatttgagcgtgtgtagcgctga卿^已tttgagtaatttcattt840tccgctcgtttaatgagtacaatgaa犯tccattgcgtagatctccgtttctattgcttg900agcgteit犯3ggg犯aggcttgacagtgctatagcaeLagactttttctattcgcagcgct960agaggccggtctatttatgatatattctcacagtcagaaattggagtgctggctcgtata1020犯犯agacgagcacgttctctgagatc3犯gtctttctttgatgccttcy1080aag3t3tg3tgata^gsgtcatcttagctaagtattcgtg已tta^agcagctagcatcta1140t已ggaaactgcttagct已gaaatcttgtgttactcaccaggcgtaaaagc1200〈210〉3〈211>1192〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3tgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattaaggccgctcttc60ccc3g犯ca3ta^ga^cacacactttgtctcgatgaaag已C3gg^8t3Cgcatgatttc120ctcatcttttgCttt333tgcttgcacg^gt3CtCt3gg180agt犯ctttttttcatagcactataga已ctctgcaagcctgcaacctgac240ttgttgttacaggaatccctattttaga已acaaatactctcccatttctccc已caagtgt300atttttgcaactcctccattMgCtg3t已gg犯atgtgattagaattttggtttctttat360tctgtctttttttaatgcgaaagg已已已tctgattggatgctcgtctgtgc420gcaa3gacaaaatttcgtcta^ctta^gg3tcccttgtacaatcaat11accgatt已已at480agtctctataattcactatccggagcgcttcaaaaaaactgtccattcctgcttagaaat540cgattctgttttgattttgtctcggatttta^aa^tgt3gtgtttccaa^tctttca^600tggaatagcgggtttaatatatcccttggtcaatctatacMa^actttgtga^gata^t660gtagcatgccgctctagcctgttt柳ggcctctgaaacgacttttccattaaaaacatc720tagagacttgat111aaacaa8gattcgctgtggtca柳ga^t已gcctttatcaaggt780ttccgataa^tccagaatctcta^ga^catcccagacgccagtaagca840gttttaccgctaggatgtcttcttgataaaattcttcatccgaatagttttggaactctg900ataaaaataattgatcc犯actctgactttcctcagaattca犯gttgctgaig犯tELgtt960aagcgtcttcttaaaatctasgtttgattttttt^a^g1020acattcgcttcttttttagtttgtcacgttgtcctctgagagtaatctcgttcatattcg1080tatttgctatttcatgcgttaacttcagaatatcttctgcggccct已gsa1140tttggatagscattagctacagaatcttctt33g犯gsgei3ccggctg33犯1192<210>4〈211〉1193〈212〉腿〈213〉人工合成〈400〉4tgcaactcctccatsgctgatagg犯tgtgattag已atttgctccttatccgtccttttt60tatgcg3^gtaatctgaattagatcgtctgtgcgcaaagacaaatttcg120tctactacgatgtgt已caatcaatttacgataaat已gtctctata已tca^ctatcgagcgc180tcaaaaaaactgtccatctgctagaatcgatctgtttgattttgtctcggattttaaaaa240atgtagtgtttccc3a^tctttc犯tgga已tagcgggtttaatatatccctttggtcaa300tctatacaaaaactttgtga33gatatgtagcatgccgctctagcctgtttagaggcctc360tgaaacgacttttccattaaagacttgatttt3a^C3犯gattcgctgtg420gtxa3gaga^atagcctttatcaaggtttccgataaatccag3atctcta480^3gtta^tcccagaicgccagtaagcagttttaccgctaggatgtcttcttgataaaatt540cttcatccga3tagttttgg已3ctctgataa^at犯ttg3tcca^a已ctctgactttcct600c已g已attcaa已gttgctg已ga^t3gttca^tgg犯gg卿cgtcttctta8犯tctaaag660卿cggcagtttgattttttcattcgcttctttttttagtttgttcacgt720tgtcctctgagagtaatctcgttcatattcatatttgctatttcatgcgt780taacttcagaatatcttctgcggccctaga3"tttggat3gcagaatcttc840tttaag犯gag犯cggctgagag犯atatctcgacg犯tttttgttg已aaaaagcttgtt900tttgtaaatag8ctcg3ta^tgtctatatacatttggttagtcgagttacgatcatccca960gctattccaagaatgtgttcttcttcaggttttccgaccg1020ttcacgtatcttttgtaaccct3g犯tagaM3aggttctgg3gtt犯3Caagcaattaa1080tttgtctcctcttctttcgttaaccctcctaggcgtcgacgcgtaatcac1140tagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcg119权利要求1.一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于含有序列表SEQIDNo.1至SEQIDN0.4所示的核苷酸序列或其互补序列。2.根据权利要求l所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于所述质控物为pTARGETTM-CT重组载体，采用以下方法构建(1)重组载体pTARGETTM-123的构建将片段123克隆入pTARGETTM载体，形成重组pTARGETTM-123载体；(2)重组载体pGEM⑧-TEasy-45的构建将片段45克隆入pGEM⑧-TEasy，形成重组载体pGEM逸-TEasy-45;(3)重组载体pTARGETTM-CT的构建以限制性内切酶NotI和SalI对重组载体pTARGETTM-123和pGEM⑧-TEasy-45进行双酶切；T4DNA连接酶，4。C连接过夜，构建pTARGETTM-CT重组载体；(4)应用脂质体转染试剂盒LipofectamionTM2000，转染真核细胞。3.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于所述重组载体pTARGETTM-123从T7方向测序，为序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；从SP6方向测序，为序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于所述重组载体pGEM-TEasy-45载体从T7方向测序，为序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序歹廿；从SP6方向测序，为序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。5.根据权利要求2所述的一种检测沙眼衣原体的质控物，其特征在于所述真核细胞为宫颈上皮细胞(HTB-Siha细胞)。全文摘要本发明公开了一种检测沙眼衣原体的质控物，属于临床检验学和生物
技术领域：
。一种检测沙眼衣原体的质控物，含有序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的核苷酸序列或其互补序列。本发明的优点是(1)利用重叠PCR与双酶切的方法，建立了一种将多间隔片段连接并构建入同一载体的简便有效的方法，定向克隆避免了长距离PCR效率较低的可能，二者联用可取长补短。(2)成功地得到了无生物传染危险性可模拟临床标本、可以大量生产、稳定保存的沙眼衣原体聚合酶链反应检测质控物，且具有较好的适用性。文档编号C12N15/85GK101363041SQ20081010585公开日2009年2月11日申请日期2008年5月4日优先权日2008年5月4日发明者括张,瑞张,李金明,王露楠,虹霍申请人:卫生部北京医院