质控标志物及其在中草药鉴定中的应用的制作方法

质控标志物及其在中草药鉴定中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及质控标志物，以及这种标志物在定性和定量鉴定兰科石斛属铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo (即广为人知的名为铁皮石斛的名贵中药)的使用方法。
【专利说明】质控标志物及其在中草药鉴定中的应用
[0001] 本申请要求2013年7月12日提交的美国专利申请号13/940944的优先权益，其 内容通过引用合并进入本申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及质控标志物，以及应用这类标志物定性和定量鉴定中草药材(特别适 用，但不限于石斛物种的方法。更具体地，本发明涉及化学标志物，以及其在快速、高效、低 成本鉴定铁皮石斛ei 即广为人知的名贵中药铁皮 石斛中的应用。 技术背景
[0003] 由于中草药材中包含的碳水化合物(特别是多糖和寡糖）结构复杂、分子量大，因 此对于这些碳水化合物的质控依旧充满了挑战。通常而言，将中草药中多糖和寡糖进行分 离和纯化后进行完整的结构表征是这两种糖的质量评价最可靠的方法。上述表征包括物 质均一性和分子量的测定、组成单糖的分析、葡萄糖苷键类型的确认、重复结构单元的推断 等。然而，这些方法极其繁琐、复杂和耗时，因此它们不适合发展为常规的质控方法。此外， 糖含量测定和糖组成分析这两种分析方法也被广泛应用于中草药材中碳水化合物的质控。 然而这两种方法依然存在缺陷。比色法测定全糖含量的特异性非常差，因而无法运用于以 定性为目的的分析。糖组成成分分析需要复杂的操作，例如酸解、衍生化、后续的利用HPLC (高效液相色谱）或GC (气相色谱）对糖的衍生物进行定性和定量测定（图1A)。因此，其试 验结果往往会受到冗长的操作步骤中诸多因素的影响，例如，温度、反应时间、酸解中酸的 浓度；因此结果重复性差。此外，该方法还具有片面性，无法显示水解前多糖和寡糖的原始 存在。因此，发展更加简便、合理的中草药材中碳水化合物的质控方法是很有必要的。
[0004] 石斛属是兰科植物中最大的属之一。已有1100多种石斛属的植物被确认，广泛分 布于亚洲、欧洲和澳洲。其中大约30种石斛属植物新鲜或晒干的茎被公认为是一种名贵的 滋补中药，中文名为石斛。在中国中药材古籍《神农本草经》中，石斛被记载为一种上品中药 材，因其具有传统的滋补功效，例如健胃、活血、增强免疫力，现已被使用数千年之久。其中， 取自石斛属铁皮石斛ei 的干莖，传统上被认为是石 斛中的极品，以铁皮石斛（Dendrobii Officinalis Caulis)著名，具有例如养胃、护喉和明 目的功效。在道教经籍《道藏》中，铁皮石斛名列中国九大名药之首。如今，由于其野生来源 的极端稀缺和其突出的滋补效果，铁皮石斛已成为最出名、最稀缺的石斛中药材，同时也是 世界中药市场上，尤其是东南亚市场上，最名贵的中药之一。铁皮石斛议的 茎通在加热后被折叠成螺旋状或弹簧状，并在干燥后在中药市场上出售，名为铁皮枫斗（图 2)。和其他石斛加工品相比，铁皮枫斗不具备特征性的形貌，且价格高昂，导致掺假、种类混 淆、仿冒品的发生。因此，铁皮枫斗的鉴定和质量评估以确保药材的安全和功效就显得至关 重要。
[0005] 已有的方法不能有效地对铁皮石斛的质量进行定性和/或定量的分析，因为这种 中草药具有独特的化学特点。除一些小分子(诸如联苄、菲等)外，其包含的碳水化合物含量 可达70%。针对小分子的质量评价方法无法将铁皮石斛和其它石斛属物种有效区分开，而 且被检测的成分往往只占到整个中草药材总成分的〇. 21%。换句话说，这些样品中多于99% 的成分无法被这些方法检测。另一方面，碳水化合物含量最高并已被证明具有较好的生物 活性，自然应该是铁皮石斛质控的主要目标。但是，如上所述，和其它以糖类为主的中药材 一样，对铁皮石斛中碳水化合物的质控面临着方法瓶颈。
[0006] 中国专利CN102370891A公开了一种针对小分子和使用GPC柱和UV检测器的方 法。然而此方法复杂且繁琐，并不适于快速、高效、低成本的应用。因此，上述公开的发明很 难推广至商业规模的应用。在另外一篇中国专利CN101716283A和一篇由Xu J等所著刊 登于期干丨J Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 上题为 Comparison of polysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping 的文章中，都 将目标指向了大分子多糖，与本发明中的目标分子一致。但是，他们所使用的化学标志物并 非原始的石斛多糖，而是其酶解得到的产物。两片文献中公布了由石斛多糖酶解所产生的 寡糖的指纹图谱。此过程须经复杂且耗时的流程，包括水提取、乙醇沉淀、去蛋白质、酶解、 电泳或HPLC分析。
[0007] 因此，发展可对铁皮石斛进行质控和鉴定且具有以下特点的方法依然存在需 求：1)快速、低成本；2)原理易懂；3)简单；4)具有满意的可重复性和再现性；5)同时适 用于定性分析和定量分析；6)对于大批量样品具有可靠性；7)适用于商业应用。
[0008] 本章节或本申请的其它章节对于任何文献的引用和鉴别，不应被理解为承认该文 献可作为本申请的现有技术。
[0009] 发明概述 本发明第一方面提供了鉴定含有碳水化合物的中草药材样品的方法，包括：基于分子 量分布，提供样品中碳水化合物化学指纹图谱；鉴定样品中碳水化合物一种或多种主要多 糖成分；分离该一种或多种主要的多糖成分；和发展化学标志物以鉴定中草药材。
[0010] 在第一方面的实施方案中，提供化学指纹图谱的步骤通过包括尺寸排阻色谱进 行。
[0011] 在第一方面的实施方案中，尺寸排阻色谱为高效凝胶渗透色谱。
[0012] 在第一方面的实施方案中，在提供化学指纹图谱的步骤前样品被溶剂提取。
[0013] 在第一方面的实施方案中，分离步骤通过包括过滤和沉淀的方法进行。
[0014] 在第一方面的实施方案中，过滤为离心超滤。
[0015] 在第一方面的实施方案中，沉淀通过使用10-90% v/v的乙醇进行。
[0016] 在第一方面的实施方案中，发展化学标志物的步骤是高效凝胶渗透色谱分离步骤 后，通过分析一种或多种主要多糖成分进行。
[0017] 在第一方面的实施方案中，所述中草药材包含石斛属物种。
[0018] 在第一方面的实施方案中，所述石斛属物种包含铁皮石斛。
[0019] 本发明第二方面提供了用以定性或定量鉴定含碳水化合物的中草药材样品的化 学标志物的制备方法，包括基于分子量分布，提供样品中碳水化合物的化学指纹图谱；鉴定 样品中碳水化合物的一种或多种主要多糖成分；分离该一种或多种主要多糖成分以形成一 种或多种已分离的主要多糖成分；和分析已分离的主要多糖成分。
[0020] 在第二方面的实施方案中，提供化学指纹图谱的步骤包括使用尺寸排阻色谱。
[0021] 在第二方面的实施方案中，尺寸排阻色谱为高效凝胶渗透色谱。
[0022] 在第二方面的实施方案中，在提供化学指纹图谱的步骤前样品被溶剂提取。
[0023] 在第二方面的实施方案中，分离步骤通过包括过滤和沉淀的方法进行。
[0024] 在第二方面的实施方案中，过滤为离心超滤。
[0025] 在第二方面的实施方案中，沉淀通过使用10-90% v/v的乙醇进行。
[0026] 在第二方面的实施方案中，所述中草药材包含石斛属物种。
[0027] 在第二方面的实施方案中，所述石斛属物种包含铁皮石斛。
[0028] 附图简述 本发明的上述及其它目标和特征，将通过结合以下对本发明的描述与所配附图而显而 易见： 图1为流程图，显示传统的糖组成分析方法(A);根据本发明的高效凝胶渗透色谱 (HPGPC )的方法（B )，用于中草药材中碳水化合物的质控。
[0029] 图2为下列原始植物的图片铁皮石斛(A)，流苏石斛 Dendrobium fimbriatum 〇，金Dendrobium nobile (功，歲m% Dendrobium 球花石斛iAjrsi/yortt? (F)和铁皮枫斗（B)，其是铁皮石 斛的商用产物。
[0030] 图3显示来自铁皮枫斗真品（A);其它石斛属物种（B);和商品铁皮枫斗样品（C) 的水提取提物的HPGPC色谱图。
[0031] 图4显示多糖标志物的制备(峰I)。
[0032] 图5显示下列样品的组成单糖分析的HPLC色谱图：混合的单糖标品（A)、铁皮枫 斗真品和商品样品，以及其它石斛属物种样品（B)。
[0033] 图6显示铁皮枫斗真品和商品样品，以及其它石斛属物种样品基于指纹谱图分析 的鉴定结果。
[0034] 图7显示通过HPGPC定量分析得到被测石斛属物种样品中多糖标志物的含量。
[0035] 优选实施方案详述 高效凝胶渗透色谱法（HPGPC)是一种基于分子大小分离分析物的尺寸排阻色谱法。此 方法被设计用来分析和制备性分离水溶性聚合物、寡聚物和生物物质，诸如多糖、核酸、蛋 白质、肽等。该方法通过应用HPGPC对色谱峰的定性鉴定和借助已建立的保留时间-分子 量关系标准曲线计算所得结果，测定经纯化的多糖和寡糖的物质均一性和分子量。但据我 们所知，此方法从未被应用于中草药材中碳水化合物的质控和定量测定。
[0036] 本发明的一个实施方案中，以铁皮石斛为例，发展了一种新颖快速的基于HPGPC 的方法，用于中草药材中碳水化合物的质控。首先，确立了基于碳水化合物成分的分子量分 布的HPGPC指纹图谱，以对铁皮石斛进行定性鉴定。其次，HPGPC谱图中主要多糖的峰被分 离，其被视为独特的化学标志物，通过对其定量测定进行铁皮石斛的碳水化合物质量评价。 (参见图1中路线B)。除此之外，也实施和比较了传统的糖组成分析方法(示于图1路线 A)，结果不于表1。 实施例
[0037] 材料和化学药品：铁皮枫斗商品样品购自中国不同地方。铁皮枫斗真品样品和 其它石斛属物种样品，包括流苏石斛ft 金钗石斛β /?〇心7^鼓槌石斛β 和球花石斛D. ?及7_Γ5·Υ/7ο_/--(示于图2)，产自中国大陆数个经过认证的产 地，并且通过传统的糖组成分析和HPGPC定量分析的鉴定，其结果示于表1。凭证标本储存 于香港浸会大学中医药学院。
[0038] HPGPC定量分析 用于高效液相色谱（HPLC)分析的乙腈和醋酸氨购买自Merck (Darmstadt,Germany)。 去离子水通过 Millipore Milli Q-Plus 系统（Millipore, Bedford, MA, USA)制备得到。 用于酸解碳水化合物的三氟醋酸（TFA)得自Riedel-de HaSn (Honeywell International Inc.，Germany)。用于单糖衍生化的1_苯基-3-甲基-5-批唑酮（PMP)购自Sigma (St. Louis，M0，USA)。参比物D -半乳糖醛酸一水合物（GalA)、D-葡萄糖醛酸（GlcA)、L -阿 拉伯糖（Ara)、D-甘露糖（Man)、D -半乳糖（Gal)、D -葡萄糖（Glc)、L-鼠李糖一水合 物（Rha)、D-岩藻糖（Fuc)、D-核糖（Rib)和一系列具有不同分子量的葡聚糖（lkDa、5kDa、 12kDa、25kDa、501^^、801^^、1501^^、2701^^、4101^^和 6701^^)购自5丨811^^1^1118， MO, USA) 〇
[0039] 水提取：在100 °C下，将干燥的样品粉末（0 . 10 g)用水提取（5mLXlhX2次)。 将提取液在3500 rpm下离心10分钟，合并上清液做进一步分析。
[0040] HPGPC条件：制备得到的石斛样品水提物可直接在连接着蒸发光散射检测器 (ELSD)的 Agilent 1100 series HPLC-DAD 系统上（Agilent Technologies, Palo Alto, CA)通过HPGPC分析法分析。该分离在4 0 °C下，通过两个串联的TSK GMPWXL柱（300 mmX7.8 mm，内径10 μπι)系统实现。以醋酸氨水溶液（20 mM)为流动相，流速为0.6 mL/ min。通过Agilent 35900E界面，ELSD产生的信号传输至Agilent Chemstation进行处 理。ELSD的参数设置如下：漂移管的温度为1 2 0 °C，喷雾器氮气流速为3. 2L/min，不分流 模式。注入20 μ L溶液进行分析。UV检测波长设置为260 nm和280 nm。
[0041] 使用相同条件，将配制好的含有不同分子量的葡聚糖（2 mg/mL) (lkDa、5kDa、 12kDa、25kDa、50kDa、80kDa、150kDa、270kDa、410kDa 和 670kDa)和葡萄糖的水溶液分别注 入HPGPC，通过各分析物的峰面积对数值相对保留时间作图，以建立分子量-保留时间校正 曲线。
[0042] 化学标志物分离：铁皮枫斗HPGPC指纹图谱中的主峰为铁皮枫斗中含量最多的多 糖，可通过离心超滤或通过乙醇（10-90% v/v)沉淀分离得到(截留分子量（MWC0)为10 kDa, 其中分子量在至少10kDa和10kDa以上的被分离和收集）[Millipore，Billerica, ΜΑ]。 具体细节如下：将铁皮石斛的水提取液（15 mL)转移至离心超滤管中，然后在4000 Xg下离 心8次(每次1 5分钟)。最后，将所得物重新溶解于15 mL水中，经冷冻干燥后，做进一步 分析。沉淀步骤操作如下：首先将乙醇（>90% v/v)加入水提物中，充分混合至乙醇浓度达 到10-90% v/v。放置过夜，合并沉淀，经最后冷冻干燥后做进一步分析。
[0043] HPGPC定量分析方法验证：HPGPC法定量分析多糖标志物（HPGPC谱图中的主峰)从 线性关系、灵敏度、精确度、准确性和稳定性这几方面进行验证。
[0044] 化学标志物的水溶液被稀释至适当的浓度用以绘制校正曲线。6种浓度的溶液被 分三等分被测试。校准曲线通过峰面积的对数和标志物浓度的对数作图获得。
[0045] 存储溶液用水溶液稀释至一系列合适浓度，吸取稀释液注入HPLC进行分析。在本 实验条件下的检测限（LODs)和定量限（LOQs)分别以大约3和10的S/N (信噪比）确定。
[0046] 选择日内和日间变化以确定本检测方法的精确度。在日内变化测试中，铁皮枫斗 样品ATF-03 (不于表1中）在一日内被提取并分析了 6次。在日间变化测试中，同一样品 在连续的三天内分为两等分被测试。峰面积对数的变化以数据的RSDs形式表现。
[0047] 加样回收试验被用以评价此方法的准确度。称取大约0. 05g具有已知目标化学标 志物含量的石斛样品（ATF-03)。向样品加入不同量的标志物（高、中、低三个水平)，分三等 分提取后分析。加样回收率按照下述公式计算： 加样回收率（％)=(检出总量一原始量）/加标量X100% 稳定性测试通过在2h、4h、6h、8h、12h、24h时分析样品ATF-03的提取物，取标志物峰面 积对数的RSD值用以检测稳定性。
[0048] 糖组成分析 酸解水提物：将制备好的水提物溶液（〇. 50 mL)与2. 50 mL三氟醋酸（TFA)(终浓度 2 M)溶液在螺口小瓶中混合，并在120 °C下水解2h。冷却后，水解物在55 °C下用旋转蒸 发仪蒸干。加入1 mL水溶液溶解水解物，离心（15700Xg，5min)后去除沉淀，取上清进行 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP)衍生化。
[0049] 单糖的PMP衍生化：糖衍生化的方法通过由J. Xu等所著刊登于期刊Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 上名为 Comparison of polysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping 中的方法经修 改得来。简言之，将酸解物（100 μ L)与同体积的氨水，及200 μ L 0.5 M的PMP甲醇溶液 混合。此混合物在70 °C下反应30 min，然后冷却到室温。随后，相继加入100 μ L冰醋酸 和500 μ L氯仿，以分别中和反应液，并除去过量ΡΜΡ反应试剂。剧烈摇动后在15700 X g下 离心5分钟，丢弃有机相。重复上述操作5次，将最终的水相稀释10倍，并通过0. 22 μ m 的注射式过滤器（Agilent Technologies, USA)过滤后可进行液相色谱-二极管阵列检测 器（LC-DAD)分析。含有7种单糖（Rha, Ara, Fuc, Man, Glu, Gal和Rib)和2种糖醛酸 (GlcA and GalA)的标准溶液也通过上述操作处理。
[0050] HPLC分析：对石斛水提物经酸解后生成的单糖的PMP衍生物的分析在配备真 空除气器、二元泵、自动进样器和二极管阵列检测器的Agilent 1100 series HPLC-DAD (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)系统上进行。5 μ? 样品被注入在 30 ° C 下运 行的Grace AlltimaTM C18 column-W (250 mm X 4· 6 m，内径 5 μ m)。通过 100 mM 醋酸 铵水溶液（Α) (ρΗ=5·58)和乙腈⑶在1.0 mL/min的流速下：0?5 min, 17?20 % B; 5?30 min，20?28 % B; 30-35 min，28% B的梯度洗脱实现分离。UV检测器的波长设置在 245nm〇
[0051] HPLC法定量分析组成单糖也将从其线性关系、灵敏度、精确度、准确性和稳定性这 几方面进行校验。
[0052] 数据分析：使用 Simca_P+ 9 (Umetrics, AN MKS company, Sweden)进行三维图 形主成分分析（3D-PCA)，以评价被测的石斛样品质量的一致性，其包含了一系列"步骤"，诸 如画图、统计、报告、处理、制表，这些步骤保证了简单、迅速的数据评价。
[0053] 结果及讨论 糖组成分析：被测石斛样品水提物中的组成单糖通过已建立的HPLC法测定。所有石 斛样品水提物经酸解后释放出的单糖的典型色谱图和计算出的含量分别总结于图5和表1 中。分析表明所有石斛样品中糖的组成从定性上看显示出了高度的一致性。在石斛样品水 提物中主要有两种组成单糖Man和Glc。此外，某些样品中这两种组成单糖的定量结果也十 分相似。这很清楚地证明糖组成分析法的选择性较差，因此可能妨碍了其对铁皮石斛的鉴 定和质量评价。除此之外，试验步骤也过于繁琐，以致定量结果会受到诸多因素的影响。 [0054] 表1被测铁皮枫斗样品和石斛物种样品基于糖组成分析和HPGPC分析所得的碳 水化合物成分定量结果（mg/g)
【权利要求】
1. 一种鉴定含碳水化合物中草药材样品的方法，包括： a. 基于分子量分布，提供样品中碳水化合物的化学指纹图谱； b. 鉴定样品中碳水化合物的一种或多种主要的多糖成分； c. 分离该一种或多种主要的多糖成分；和 d. 发展化学标志物以鉴定中草药材。
2. 权利要求1的方法，其中提供化学指纹图谱的步骤通过包含尺寸排阻色谱的方法进 行。
3. 权利要求2的方法，其中尺寸排阻色谱是高效凝胶渗透色谱。
4. 权利要求1的方法，其中在提供化学指纹谱图步骤之前样品用溶剂提取。
5. 权利要求1的方法，其中分离步骤通过包含过滤或沉淀的方法进行。
6. 权利要求5的方法，其中过滤为离心超滤。
7. 权利要求5的方法，其中沉淀通过采用10-90% v/v的乙醇进行。
8. 权利要求1的方法，其中发展化学标志物的步骤在高效凝胶渗透色谱之后，通过分 析一种或多种主要多糖成分进行。
9. 权利要求1的方法，其中所述中草药材包含石斛物种。
10. 权利要求9的方法，其中所述石斛物种包括铁皮石斛。
11. 一种制备化学标志物用于定性和定量鉴定含碳水化合物中草药材样品的方法，包 括： a. 基于分子量分布，提供样品中碳水化合物的化学指纹图谱； b. 鉴定样品中碳水化合物的一种或多种主要的多糖成分； c. 分离该一种或多种主要的多糖成分以形成一种或多种分离的主要多糖成分；和 d. 分析分离的主要多糖成分。
12. 权利要求11的方法，其中提供化学指纹图谱的步骤通过包含尺寸排阻色谱的方 法进行。
13. 权利要求12的方法，其中尺寸排阻色谱是高效凝胶渗透色谱。
14. 权利要求11的方法，其中在提供化学指纹谱图步骤之前样品用溶剂提取。
15. 权利要求11的方法，其中分离步骤通过包含过滤或沉淀的方法进行。
16. 权利要求15的方法，其中过滤为离心超滤。
17. 权利要求15的方法，其中沉淀通过采用10-90% v/v的乙醇进行。
18. 权利要求11的方法，其中所述中草药材包含石斛物种。
19. 权利要求18的方法，其中所述石斛物种包括铁皮石斛。
【文档编号】G01N30/02GK104280469SQ201410330544
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】韩全斌, 陈虎彪, 许军 申请人:香港浸会大学