一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法及其引物、试剂盒的制作方法

专利名称：：一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法及其引物、试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体地说，涉及一种利用微卫星及线粒体遗传标记技术对中国水牛进行亲权鉴定的方法及专用引物与试剂盒。
背景技术：
：在现代动物生产和育种中，要利用各种亲属的表型信息确定准确的遗传系谱并通过正确的系谱了解种公畜的育种价值，以此来确定个体选留及避免个体近亲繁殖。大规模联合育种工作的开展以及BLUP技术的广泛应用，使得系谱信息在育种中的影响越来越大。因系谱信息错误产生的误差会在整个选育过程中被逐级的放大，并极有可能造成群体的大规模近交，导致种群退化，从而导致育种过程中不可挽回的重大损失。因此，在家畜育种中应用亲权鉴定技术鉴别个体身份，修正错误系谱信息有着极为重要的意义。亲权鉴定是明确个体间亲缘关系、建立正确谱系的重要辅助手段，亲权鉴定主要包括以下几个方面个体生父的确定，个体生母的确定，个体生父生母的确定，生父、生母后代的确定，爷孙关系的确认(即隔代鉴定)等。亲权鉴定方法按材料不同可以分为很多种，如利用表型标记、系谱记录、血型、蛋白质多态、同工酶、在DNA分子水平进行鉴定等。在DNA水平上大致可以分为以下几种DNA指纹技术、MVR-PCR技术、STR分型技术(微卫星标记技术)、mtDNA分型(线粒体DNA技术)、MHC分型、性染色体鉴定。在众多DNA分子标记中，微卫星标记是目前应用最为广泛的一种。微卫星是指一类由1-6个核苷酸组成的短序列首尾相连重复多次构成的一段DNA，广泛分布于真核生物基因组中；微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成。与其他DNA分子标记相比，微卫星标记具有以下优点数量巨大、分布广泛、均匀，可以代表整个基因组提供大量信息；高度多态、信息含量丰富、鉴定准确率高，微卫星多态信息含量(PIC)可高达0.7以上(当PIC值大于0.5时该座位即被认为是高度多态座位，而血液蛋白标记则在O.l左右，RFLP在O.2左右)，多个微卫星基因座联合检测时，个体识别机率和非父排除率很高；突变率低、具有保守性，微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共显性，使微卫星引物具有一定的通用性，可在一定程度上降低研究成本；检测需要的DNA数量较少、纯度要求不高，检测样品来源广泛，可通过PCR迅速扩增，重复性好，灵敏度高；遵循孟德尔遗传法则，呈共显性遗传，能很好地区分纯合子与杂合子。由于具有上述优点，微卫星标记被广泛地应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域，已经成为国际上主流的标记技术之一。然而目前还未有用微卫星标记进行中国水牛单亲亲权关系鉴定方法的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种利用微卫星标记技术对中国水牛进行单亲亲权鉴定的方法。本发明的进一步目的是提供一种利用微卫星及线粒体遗传标记技术对中国水牛进行亲权鉴定的方法。本发明还提供了上述亲权鉴定方法的专用引物与试剂盒。本发明实现上述发明目的采用以下技术方案一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法，包括以下步骤(1)从普通牛种微卫星标记中，筛选出多态性丰富的微卫星引物；(2)以待检水牛基因组DNA为模板，在筛选出的微卫星引物的引导下进行25pL反应体系的PCR扩增；(3)对微卫星PCR扩增片段进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(4)根据电泳检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数PI值、并根据PI值计算出亲子相对概率值W值，当W值大于或等于99.73%时，则认定假设亲代与子代个体有亲生关系，当W值小于99.73。/。时，则可以认为假设亲代与子代个体不具有亲生关系。上述微卫星引物包括以下引物-由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的微卫星引物ETH225;由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的微卫星引物BM1818;由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的微卫星引物INRA035;由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的微卫星引物BM2113;由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的微卫星引物TGLA227;由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的微卫星引物CSRM60;由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的微卫星引物丽2934;由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的微卫星引物丽1862。所述PCR扩增的25yL反应体系包括DNA模板1.25ng，10XPCR扩增缓冲液2.50uL，25腿ol/L的MgClJ.50uL，2.5隨1/L的dNTPs1.00uL，5U/pL的^yra^DNA聚合酶0.50pL，20pmo1/uL的上游引物0.50pL，20pmol/uL的下游引物0.50iiL，加灭菌蒸馏水，使反应体系补足25.00uL。所述25"L反应体系PCR扩增反应条件为9fC预变性5min;94。C变性30s，50-65。C退火30s，72。C延伸30s，共35个循环；72。C延伸10min。当基因组DNA的提取、引物的合成、&r邵DNA聚合酶、dNTPs试剂来自不同的批次时，反应条件，包括退火温度等都会发生一定的变化。所以在每次进行大批量PCR前，都要选择少量样本进行温度梯度、引物浓度梯度PCR，进行2%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果，以确定最佳的PCR反应条件。为了提高鉴定的稳定性、准确性和灵敏度，本发明的鉴定方法还可以包括以下步骤由序列表中序列17、序列18及序列19、序列20组成线粒体D-Loop区引物，以待检水牛基因组DNA为模板，对线粒体基因片段进行50uL反应体系的PCR扩增，对线粒体PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶纯化，利用双脱氧终止法对纯化后的PCR产物进行测序，用DNAman软件分析待检样品的DNA序列一致率，若线粒体DNA序列完全一致，则说明待检样品间存在亲缘关系。所述PCR扩增的50uL反应体系包括DNA模板2.5ng，10XPCR缓冲液5UL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5腿ol/L的dNTPs4uL，5U/uL的j^ra《DNA聚合酶O.50uL，20pmol/pL的上游引物luL,20pmo1/uL的下游引物1uL，加灭菌蒸馏水，使反应体系补足50.00iiL。所述50pL反应体系PCR扩增反应条件为94'C预变性5min;94'C变性lmin，55。C退火lmin，72"C延伸lmin，共35个循环；72。C延伸10min。本发明还根据上述设计的微卫星引物和线粒体D-Loop区引物制备了对中国水牛进行亲权关系鉴定的快速检测试剂盒，除了所含的上述引物外，本发明的进行亲权关系鉴定的快速检测试剂盒还包括以下试剂fz&。DNA聚合酶、10XPCR扩增缓冲液、dNTPs、无菌水、IOX凝胶上样缓冲液、0.5ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)、2mg/ml蛋白酶K、10%的SDS、饱和酚、氯仿、异戊醇、70%乙醇、无水乙醇、TE溶液、30%聚丙烯酰胺溶液、5XTBE电泳缓冲液、10%过硫酸铵溶液、NWNN-四甲基乙二胺、含10%乙醇、0.5%冰乙酸的固定液、1%硝酸溶液、0.2%硝酸银溶液、含1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛的显色液、0.75%碳酸钠溶液、分子量标准物pUC18DNA/MspI、DNA分子量标准DL2000，核酸染料、6X凝胶上样缓冲液；所述各种溶液的溶剂均为水。本发明提供了一种利用微卫星标记技术对中国水牛的单亲亲权关系进行鉴定的方法，本发明的鉴定单亲水牛亲权关系的方法包括从普通牛种微卫星标记中筛选出多态性丰富的微卫星引物；以待检水牛基因组DNA为模板，在筛选出的微卫星引物的引导下进行25ixL反应体系的PCR扩增；对微卫星PCR扩增片段进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；根据电泳检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数PI值、亲子相对概率值W值，根据W值判断亲权关系是否存在。上述微卫星引物是参照GenBank，经过反复筛选试验，从英国罗斯林研究所推荐的普通牛种微卫星标记中筛选出的多态性丰富的微卫星引物。本发明的鉴定方法简单、快捷、准确度高。采用微卫星标记进行亲权关系鉴定虽然具有明显的优点，但由于在减数分裂过程中可能发生连锁互换、染色体重组，从而使得微卫星位点在群体中基因频率和基因型频率发生改变，导致用微卫星标记进行亲权鉴定的精确度受到影响；同时微卫星标记在亲子鉴定中对假设亲本的排除率还会受到被测标记等位基因数目的影响，所用等位基因位点越多，具有同一性状的两个个体相同的概率越小，其检出率也越大。选用多个微卫星位点可以提高微卫星进行亲子鉴定的精确度，但同时也会增加鉴定成本，加大工作量。为了进一步提高鉴定的精确度、降低鉴定成本，本发明在微卫星标记的基础上进一步提供了利用线粒体遗传标记对中国水牛进行亲权鉴定的方法。粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)存在于细胞质中，是唯一的核外基因组DNA。mtDNA呈闭环双链结构，由16569bp组成，包括编码区和非编码区。mtDNA的编码区含有37个编码基因，非编码区由1125bp组成，包括一个复制起点、两个转录起点及置换环(dispiacementloopregion,D-环区)，其中D-环区及复制起点附近的16024-16365nt及73-340nt两个区域为多态性高发区，也是mtDNA应用于亲权鉴定的理想位点。由于线粒体是以母系遗传方式遗传，不会受到染色体重组的影响，可弥补微卫星因发生重组影响基因频率、基因型频率，最终导致鉴定率降低的不足。本发明将微卫星与线粒体遗传标记两种方法相结合，从不同的角度进行鉴定，且鉴定结果一致，提高了亲权鉴定的稳定性、准确性、灵敏度，使鉴定范围更广、样品要求更低。线粒体DNA拷贝数多，每个细胞平均含有10-1000个线粒体，多数线粒体内含有多拷贝的mtDNA，是其他核基因拷贝数的10倍左右，因此对mtDNA的检测比nDNA具有更高的检出率。mtDNA序列的高度多态性使得检测的灵敏度高，对样本需求量低，仅需pg水平的量。本发明提供的鉴定方法简单、快捷、费用低廉，准确度高(可达99.96%)，并可实现自动化的直接检测。此外，根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于中国水牛的亲权鉴定，该试剂盒使用简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要，且检测结果可靠、稳定、准确，为牛的育种工作提供了便利。本发明将在中国水牛亲权鉴定及优良牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。本发明的中国水牛亲权关系鉴定快速检测试剂盒能够在24小时之内完成中国水牛的亲权关系鉴定，精确度达99.96%。同时，本发明也将对其他亲权关系的鉴定起到积极的作用。图1为微卫星位点ETH225PC財广增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图2为微卫星位点BM2113PCR扩增产物的8Q/^聚丙烯酰胺电泳检测结果。图3为微卫星位点CSRM60PCR扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图4为微卫星位点BM1862PCR扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图5为微卫星位点BM1818PC財广增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图6为微卫星位点INRA035PCR扩增产物的8。^聚丙烯酰胺电泳检测结果。图7为微卫星位点TGLA227PC財广增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图8为微卫星位点BM2934PCR扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图9为微卫星位点ETH225等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图10为微卫星位点BM2113等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图11为微卫星位点CS脂60等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图12为微卫星位点丽1862等位基因标记扩增产物的8%聚丙烯酰胺电泳检测结果。图13为微卫星位点BM1818等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图14为微卫星位点頂RA035等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图15为微卫星位点TGLA227等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图16为微卫星位点BM2934等位基因标记扩增产物的8X聚丙烯酰胺电泳检测结果。图17为线粒体的D-Loop区PC財广增产物的l^琼脂糖凝胶电泳检测结果。图18为中国水牛m、cl和c2的线粒体D-Loop区序列比较结果。图中标记图1-8中，阿拉伯数字19表示不同的泳道，各个泳道为不同个体；M表示pUC18DNA/MspI分子量标记；英文小写字母ag表示不同的等位基因型。图9_17中，m表示母亲；cl表示后代；c2表示嫌疑后代；M和Marker表示pUC18DNA/MspI分子量标记；英文小写字母ag表示不同的等位基因型。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。所用引物合成由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司完成。实施例l、用于对中国水牛进行亲权鉴定的微卫星标记及线粒体弓l物的筛选一、引物设计参照GenBank，经过反复筛选试验，从英国罗斯林研究所推荐的普通牛种微卫星标记中筛选出的多态性丰富的微卫星引物，筛选出的微卫星引物序列见表1。根据普通牛mtDNA的D-Loop区设计引物，为方便测序并设计了内引物，引物序列见表2，引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成，预计扩增片段长度为900bp左右。表l选取的STR基因座8个微卫星基因座及其引物序列表2选取的mtDNA的D-Lo叩区引物序列基因座序列名称引物类型引物序列_碱基数量(bp)序列17正链引物5，-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3'20mtDNA序列18反链引物5，-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'17D-Loop区序列19正链内引物5，-AGGCATCTGGTTCTTTCTTC-3，20_序列20反链内引物5，-ATTAGCCATTAGTCCATC-3，_18二、微卫星标记的基因型检测用步骤一获得的8个微卫星标记对在中国四川西昌农户家采集1头母牛、1头已知为该母牛后代和另1头嫌疑为该母牛后代的中国水牛的血液样本及另外随机采集32头中国水牛共计35头中国水牛进行微卫星基因型检测。10基因座ETH225BM1818IN訓35證113TGLA227CSRM60BM2934BM1862引物序列碱基数量(bp)5'-GATCACCTTGCCACTATTTCCT-3'225'-ACATGACAGCCAGCTGCTACT-3'215'-AGCTGGGAATATAACCAAAGG-3z215'-AGTGCTTTCAAGGTCCATGC-3'205'-ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG-3'225,—TTGTGCTTTATGACACTATCCG_3'225'-GCTGCCTTCTACCAAATACCC-3'215'-CTTCCTGAGAGAAGCAACACC-3'215'-CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT-3'255'-ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA-3'245'-AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA-3'245'-AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG-3'245'-CCAATGTCTTCCTAGCTCTTC-3'215'-CTGTTAGTTCTGCCAAAATCCC-3'225'-AAGCAAAAAGGCTGATGGC-3'195'-TTGCAGATACTGGCAAGTGG-3'20口ln123456789o2356,列列列列列列列列列列列列列列列列，序序序序序序序序序序序序序序序序1、PCR扩增根据文献(萨姆布鲁克丄弗时奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京科学出版社，1998，465-467.)中描述的DNA提取方法，提取上述水牛血液的基因组DNA，(基因组DNA还可以从组织样品、如耳组织，或含有毛囊的牛毛样品中提取)，以此基因组DNA为模板，分别在筛选出的8对微卫星引物的引导下利用梯度PCR仪进行25"L反应体系的PCR扩增。所述25yL反应体系包括DNA模板1.25ng，10XPCR缓冲液2.50uL，25咖ol/L的MgCl21.50uL，2.5腿ol/L的dNTPs1.00uL，5U/uL的ExTaqDNA聚合酶0.50pL，20pmo1/uL的上游引物0.50uL，20pmo1/uL的下游引物0.50PL，加灭菌蒸馏水，使反应体系补足25.00uL。所述上游引物指的是序列表中序列1、3、5、7、9、11、13、15的核苷酸序列组成的引物，下游因物指的是序列表中序列2、4、6、8、10、12、14、16的核苷酸序列组成的引物。所述25uL反应体系PCR扩增反应条件为94""C预变性5min;94。C变性30s，50-65。C退火30s，72。C延伸30s，共35个循环；72。C延伸10min。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染PCR反应结束后，对各引物对的PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体过程包括以下步骤-①充分清洗电泳玻片和间隔片，烘干后密封安装，按照表3给定的配胶比例配制凝胶，混匀后立即灌装胶板，灌满胶板后插入梳子，均需注意避免产生气泡；②室温凝胶聚合30min后，将梳子拔除，用移液器吸取电泳缓冲液冲洗加样孔。将聚合完毕的胶放回电泳槽，用配胶同批次的5XTBE配制1XTBE电泳缓冲液注满电泳槽，并将电泳槽底部气泡排除；③取PCR产物3uL，按照2:1的比例混合IOX凝胶上样缓冲液(PCR产物10X凝胶上样缓冲液二2:1，体积比)，冰浴5分钟，在80v的电压下电泳100分钟，此时IOX凝胶上样缓冲液中的蓝色二甲苯氰刚好移动到胶板底部；④从电泳槽中取出胶板，取下凝胶放入固定液(10%乙醇，0.5°/。冰乙酸)，振荡仪上固定6分钟/次，重复一次；取出凝胶放入1%硝酸溶液中硝化2分钟后转入0.2%硝酸银溶液中闭光染色12分钟；染色完毕后用蒸馏水充分漂洗3次，每次2分钟；漂洗后放入预冷的显色液(1.5%氢氧化钠，0.4%甲醛)中显色15分钟；显色后放入0.75。/。的碳酸钠溶液中终止显色；⑤在GELD0C2000凝胶成像系统下采用白光扫描图象，储存分析；⑥电泳数据经QuantityOne软件处理后得到检测片段大小。表38。/。PAGE凝胶的配方5102040ddH202.635.2510.521.0Acrylamide(30%)1.332.655.310.65XTBE1.02.04.08.0APS(uL)70707070TEMED(uL)101010108个微卫星基因标记ETH225、BM1818、INRA035、BM2113、TGLA227、CSRM60、BM2934、BM1862的8。/。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1-8所示，图中M为pUC18DNA/MspI、其余泳道为PCR扩增产物，微卫星扩增产物在67-400bp之间，本发明专利申请筛选的8个位点中最多的等位基因为7个，最少的为4个。三、微卫星标记的遗传多态性分析1、等位基因、等位基因数和有效等位基因数统计向PCR扩增产物中加入适量的上样缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶上80V、35min电泳，然后在凝胶成像系统中观察，如有所需的条带呈现多态现象，可以用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，经银染后用凝胶成像系统拍照保存。由于微卫星呈共显性遗传，其表现型可以直接反映基因型。因此，根据电泳结果可以直接判断出每一个个体的基因型，经过简单计算可以得出各微卫星位点上的等位基因频率。有效等位基因数反映等位基因间的相互影响，是衡量基因纯合度的另一指标。它表明等位基因在群体中分布的均匀程度，等位基因分布越均匀，有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数。7Ve=1/1户'其中i为第i个等位基因，Pi为等位基因频率，n为等位基因数。将各微卫星基因座PCR产物与pUC18DNA/MspI的各条带大小进行比较、判定全部个体各个微卫星位点等位基因的大小，按由大到小的顺序分别依次命名为a、b、c等，具体扩增结果见表4。中国水牛在8个微卫星位点上的等位基因频率见表5。由表4可知，8个微卫星位点上共扩增出47个等位基因，平均每个位点上的等位基因数为5.875个，其中，BM1818、INRA035、BM1862位点等位基因最多，有7个，ETH225位点等位基因最少，有4个。由表5可知，ETH225位点按序列由大到小有a、b、c、d四个等位基因，其中d的出现频率最大，为0.4915，c的出现频率最小，为0.1186。BM2113位点按序列由大到小有a、b、c、d、e、f六个等位基因，其中c的出现频率最大，为0.2462，a的出现频率最小，为0.0769。CS脂60位点按序列由大到小有a、b、c、d、e、f六个等位基因，其中d的出现频率最大，为0.2698，f的出现频率最小，为0.0794。BM1862位点按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七个等位基因，其中a的出现频率最大，为0.2449，g的出现频率最小，为0.0612。BM1818位点按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七个等位基因，其中b的出现频率最大，为0.1846，g的出现频率最小，为0.0923。INRA035位点按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七个等位基因，其中c的出现频率最大，为0.2344，g的出现频率最小，为0.0781。TGLA227位点按序列由大到小有a、b、c、d、e五个等位基因，其中c的出现频率最大，为0.3333，a的出现频率最小，为0.1228。BM2934位点按序列由大到小有a、b、c、d、e五个等位基因，其中d的出现频率最大，为0.3167，c的出现频率最小，为0.1333。8个微卫星位点的有效等位基因数见表6。有效等位基因数是基因一致度的倒数，反映了等位基因间的相互影响。它与平均杂合度和多态信息含量一样，可用来测度群体的遗传多态性。由表6可以得出8个微卫星位点上的有效等位基因数为27个。平均有效等位基因数为5.15。在BM1818位点上的有效等位基因数最多为6.76个。在ETH225位点上的有效等位基因数最少为2.98个。表4各微卫星位点扩增的多态情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>_表58个微卫星位点在中国水牛中的等位基因频率_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>_表68个微卫星位点在中国水牛的有效等位基因数_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2、群体杂合度合多态信息含量群体杂合度(Heterozygosity)表示群体某一特定基因位点上杂合子的比例，反映群体遗传变异程度的大小。//e=1-它尸,2,=1其中i为第i个等位基因，Pi为等位基因频率，n某一位点的为等位基因数。选择做亲权鉴定的微卫星遗传标记应满足以下条件①具有较高的多态信息含量(PI〉0.7)和杂合度(He〉0.9)等位基因数丰富，由10-12各等位基因最佳；②扩增长度在400bp—下；③微卫星标记位于不同的染色体上，或各标记之间没有连锁，标记之间的距离大于40cM;④没有"哑等位基因"，标记具有种属特异性；⑤重复性好，PCR扩增结果稳定。8个微卫星位点的群体杂合度见表7。群体杂合度表示被检测位点在该群体中的杂合子频率，它是遗传标记多态性和被检测群体杂合度的度量单位。在本研究8个微卫星位点中，BM1818位点的杂合度最大为0.8521，ETH225位点最小为0.6648。该群体的平均杂合度为0.7943。表78个微卫星位点在中国水牛的杂合度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>多态信息含量(Polymorphisminformationcontent,PIC)用于对丰示i己基因多态性的估计。PIO0.5为高度多态；0.25<PIC<0.5为中度多态；PIC<0.25为低度多态。P/C=1—《尸,2)—(2X2户，/)I=〗/=Z+1其中i，j为第i，j个等位基因；h和P,分别为第i和第j个等位基因的频率；n为等位基因数。8个微卫星位点的多态信息含量见表8。多态信息含量是衡量微卫星位点多态性的指标，当PIC〉0.5时，该位点为高度多态位点；当0.25〈PIC〈0.5时，为中度多态位点；当PIC〈0.25时，为低度多态位点。在8个微卫星位点上，BM1818的多态信息含量最大，为0.8462，而ETH225的多态信息含量最小，为0.6574，8个微卫星位点的平均多态信息含量为0.7841，表现出较高的多态性。由表8可知，PIC隱25二0.6547>0.5，PIC腕咖二O.8462〉0.5，PIC丽腦二O.8344〉0.5,PIC證u^0.8006〉0.5，PICTGLA227=0.7515〉0.5，PIQ;SK,=0.7995〉0.5，PICBM2934=0.7666>0.5，PICBM1862=0.8191>0.5。因此，每个微卫星位点的PIO0.5，都具有高度多态性。所以选用这8个微卫星位点进行单亲亲权鉴定的鉴别力较高。表88个微卫星位点在中国水牛的多态信息含量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例2、用微卫星标记对中国水牛进行亲权鉴定本实施例鉴定单亲水牛亲权关系的方法，包括以下歩骤从普通牛种微卫星标记中筛选出多态性丰富的微卫星引物；以待检测水牛基因组DNA为模板，在筛选出的8个微卫星引物的引导下，对在中国四川西昌农户家采集1头母牛(m)、1头已知为该母牛后代cl和另1头嫌疑为该母牛后代c2的中国水牛的血液样本进行PCR扩增;对微卫星PCR扩增片段进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；根据电泳检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数PI值、亲子相对概率值W值，根据W值判断亲权关系是否存在。PCR扩增方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法同实施例1。单亲亲权指数(PI)和亲子关系相对概率(W)的计算根据中国水牛等位基因频率分布(如表5)和亲权指数计算公式(如表9)，计算出后代cl和该母牛(m)的PI值(表IO)和W值。CPI二PIETH225XPIbM18L8乂PIlNRA035乂PIbM2113xpicsrm60XPIbM2934乂PIbM1862乂PItGLA227=2537.2227W=[累计PI值/(累计PI值+l)]X100%=99.9606%_表9单亲亲子鉴定各种遗传组合亲权指数计算公式__§^_嫌疑子代_^_1AAAA1/P2AAAiAj(i^j)1/2Pi3A人(W)AA1/2Pi4AiAj(i半j)AiAj(i^j)1/4Pi+l/4Pj5AiAj(i^j)AiAk(k共i'j)1/4Pi注:Pi是第i个等位基因频率；Pj是第j个等位基因频率在3份待判定亲权关系的中国水牛中，在BM2934位点上m、cl和c2均有相同的等位基因a和d;在丽1862位点上m和cl均有相同的等位基因b和f，而c2则有等位基因a和e;ETH225位点上m、cl和c2均有相同的等位基因a和d;在BM1818位点上m和cl均有相同的等位基因a和e，而c2则有等位基因b和f;在INRA035位点上m有等位基因a和c，cl有等位基因c和e，而c2有等位基因b和d;在BM2113位点上m、cl和c2均有相同的等位基因c和f;在CSRM60位点上m、cl和c2均有相同的等位基因b和d;在TGLA227位点上m和cl均有相同的等位基因d，而c2则有等位基因c和d(见图9图16)。基因分型见表11。从表11可以得出子代与亲本等位基因比较结果(表12)。由此可见嫌疑后代c2与该母牛(m)有3个STR基因座遗传违背孟德尔遗传规律，所以该嫌疑后代c2与该母牛(m)排除亲生关系。而后代cl与该母牛(m)的8个STR基因座遗传都遵循孟德尔遗传规律。表IO8个STR基因座的PI值基因座mclPI计算公式PIETH225a/da/dl/4Pa+l/4Pd1.5622BM1818a/ea/el/4Pa+l/4Pe3.2500顶RA035a7cc/e1Z4PC1.0667國113c/fc/fl/4Pc+l/4Pf3.3370CSRM60bZdb/dl/4Pb+l/4Pd2.3583BM2934a/da/dl/4Pa+l/4Pd3.1667BM1862b/fb/fl/4Pb+l/4Pf4.2875TGLA227dd1/Pd4.3846注:m为来自于母亲的等位基因；cl为来自于孩子的等位基因。表118个STR基因座的基因分型基因座mclc2ETH225a/da/da/d隨818a/ea/eb/fINRA035a/cc/eb/dBM2113c/fc/fc/fCSRM60b/db/db/dBM2934a/da/da/dBM1862b/fb/fa/eTGLA227ddc/d注m为来自于母亲的等位基因；cl、c2为来自于孩子的等位基因表12子代与亲本等位基因结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注:m为来自于母亲的等位基因；cl、c2为来自于孩子的等位基因；"+"表示具有该等位基因；"-"表示不具有该等位基因。实施例3用微卫星标记及线粒体遗传标记对中国水牛进行亲权鉴定微卫星标记亲权鉴定方法同实施例2。线粒体遗传标记对中国水牛进行亲权鉴定包括以下歩骤根据普通牛mtDNA的D-Loop区设计引物，引物序列见表2;以待检测水牛基因组DNA为模板，在线粒体引物的引导下，对在中国四川西昌农户家采集l头母牛、l头已知为该母牛后代和另1头嫌疑为该母牛后代的水牛的血液样本进行50PL反应体系的PCR扩增，对线粒体PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶纯化，利用双脱氧终止法对纯化后的PCR产物进行测序，用DNAman软件分析测序结果并对结果进行判断。1、PCR扩增根据文献(萨姆布鲁克J，弗时奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京科学出版社，1998，465-467.)中描述的DNA提取方法，提取上述水牛血液的基因组DNA，(基因组DNA还可以从组织样品、如耳组织，或含有毛囊的牛毛样品中提取)，而后以此基因为模板，进行50PL反应体系的PCR扩增。PCR扩增后的产物，取3ul进样，经1%琼脂糖凝胶，在65V电压下电泳60min后经凝胶成像系统成像(见图17)。对照分子量标准物DL2000，所扩增的特异性带出现在约900bp处，扩增的目的条带单一，没有非特异性扩增条带，效果理想。所述PCR扩增的50uL反应体系包括DNA模板2.5ng，10XPCR缓冲液5uL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5mmol/L的dNTPMix4uL，5U/uL的7ag0.50tiL，20pmol/yL的上游引物luL，20pmo1/uL的下游引物1uL，加灭菌蒸馏水，使反应体系补足50.00ixL。所述上游引物指的是序列表中序列17、19的核苷酸序列组成的引物，下游因物指的是序列表中序列18、20的核苷酸序列组成的引物。所述50iiL反应体系PCR扩增反应条件为94°C预变性5min;94"C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，共35个循环；72。C延伸10min。2、PCR产物纯化及序列测定将PCR扩增产物交金杰生物公司，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化产物，利用双脱氧终止法进行测序，测序结果见序列表21-23，序列表21为中国水牛12号(母本)的D-Loop序列，序列表22为中国水牛13号(后代cl)的D-Loop序列，序列表23为中国水牛25号(后代c2)的D-Lo叩序列，表明12号(即m)和13号(即cl)为890bp，25号(即c2)为892bp，与NCBI上的序列比较分析发现测序结果与预计结果一致。3、线粒体DNA的D-Loop区序列分析线粒体DNA在人类和动物的线粒体序列中都有一个区域叫D-Loop区，具有很高的多态性，且成单倍型母系遗传。据报道在对人类线粒体DNA的D-Loop区的测序后，发现了400多个变异。与DNA指纹技术、STR分型相比，对线粒体DNA的D-Loop进行测序可有更高的灵敏度，产生等位基因更多，因此更容易对个体进行分析。但由于线粒体DNA是母系遗传，所以可以通过对线粒体DNA的D-Loop区测序来区分母系的单亲亲权鉴定。由序列表21-23及图18可知后代13号(即cl)与该母牛12号(即m)序列一致。嫌疑后代25号(即c2)与该母牛12号(即m)在212、314、416上分别有3次T/C转换，在275、285上分别有2次G/A和在795上有1次A/G转换。嫌疑后代25号(即c2)分别在178和744位插入A和C碱基。所以，后代13号(即cl)与该母牛12号(即m)是来源于同一个母系的个体而嫌疑后代25号(即c2)与该母牛12号(即m)是来源于不同母系的个体。本发明结果表明m(即12)和cl(即13)的线粒体DNA的D-Lo叩区的碱基数为890bp，c2(即25)的线粒体DNA的D-环的碱基数为892bp。由此结果可知，具有亲缘关系的m和cl测序的结果碱基数完全相同，而嫌疑后代c2比母牛m多出了2个碱基。4、待检样本亲权关系认证本发明结果表明后代cl(即13)与该母牛m(即12)序列一致。嫌疑后代c2(即25)与该母牛m(即12)在212、314、416上分别有3次T/C转换，在275、285上分别有2次G/A和在795上有1次A/G转换。嫌疑后代c2分别在178和744位插入A和C碱基。所以，印证了后代cl与该母牛m是来源于同一个母系的个体，嫌疑后代c2与该母牛m是来源于不同母系的个体。实施例4、制备中国水牛亲权鉴定试剂盒本发明用于中国水牛亲权鉴定的十几个主要包括一下试剂(1)10XPCR扩增缓冲液；(2)MgCl2(25腿ol/L);(3)dNTPs(2.5画1/L);(4)fxTa。DNA聚合酶(5U/uL);(5)实例l、2中所述的10对用于中国水牛亲权鉴定的专用引物(20pmol/uL);(6)ddH20。本发明提供的试剂盒为利用微卫星遗传标记和线粒体遗传标记两种技术对中国水牛进行亲权鉴定的通用试剂盒，如单独用于微卫星标记检测，每盒可供检测50次，如单独用于线粒体标记检测，每盒可供检测500次。每盒中各组分的量为10XPCR扩增缓冲液1瓶(1250uL/瓶)，25腿ol/LMgCl2l瓶(750uL/瓶)，2.5腿ol/LdNTPs1瓶(500pL/瓶)，5U/pLr邵DNA聚合酶1瓶(250pL/瓶)，每对引物的上下游引物各一瓶(50uL/瓶)，ddH201瓶(10mL/瓶)，按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到中国水牛亲权鉴定试剂盒。序列表〈110〉西南民族大学〈120〉一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法及其引物、试剂盒<160>23<210>1〈211〉22<212〉腿〈213>人工序列〈220><223〉人工序列的描述引物〈400>1gatcaccttgccactatttcct22<210〉2<211>21〈212〉薩〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述引物〈400〉2acatgacagccagctgctact21〈210〉3〈211〉21〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈■〉3agctgggaatataaccaaagg21〈210〉4<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223>人工序列的描述引物〈400>4agtgctttcaaggtccatgc20<210>5<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈223>人工序列的描述引物〈400〉5atcctttgcagcctccacattg22〈210>6<211>22〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉6ttgtgctttatgacactatceg22〈210>7<211〉21〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉7gctgccttctaccaaataccc21〈210〉8<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述引物〈400〉8cttcctgagagaagcaacacc21<210〉9〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉9cgaattccaaatctgttaatttgct25〈210〉10〈211〉24〈212〉薩〈213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物<■〉10acagacagaaactcaatgaaagca24〈210〉11<211>24<212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述引物〈400〉11aagatgtgatccaagagagaggca24〈210〉12〈211〉24<212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述引物〈400〉12aggaccagatcgtgaaaggcatag24<210>13〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的描述引物〈400〉13ccaatgtcttcctagctcttc21〈210〉14<211〉22〈212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉14ctgttagttctgccaaaatccc22〈210>15〈211〉19〈212〉瞧〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物〈400〉15aagcaaaaaggctgatggc19〈210〉16<211〉20〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述引物<400〉16ttgcagatactggcaagtgg20<210>17〈211〉20<212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221〉D-Loop<223〉人工序列的描述引物〈400〉17ctgcagtctcaccatcaacc20<210〉18〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉D-Loop<223〉人工序列的描述引物<400>18ggggtgt卿tgcttgc17〈210〉19<211>20〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈221〉D-Loop<223>人工序列的描述引物<400〉19aggcatctggttctttcttc20〈210〉20〈211〉18<212>■<213>人工序列<220〉<221>D-Loop〈223〉人工序列的描述引物<400>20attagccattagtccatc18〈210〉21<image>imageseeoriginaldocumentpage28</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>权利要求1、一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于包括以下步骤(1)从普通牛种微卫星标记中，筛选出多态性丰富的微卫星引物；(2)以待检水牛基因组DNA为模板，在筛选出的微卫星引物的引导下进行25μL反应体系的PCR扩增；(3)对微卫星PCR扩增片段进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(4)根据电泳检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数PI值、并根据PI值计算出亲子相对概率值W值，当W值大于或等于99.73％时，则认定假设亲代与子代个体有亲生关系，当W值小于99.73％时，则可以认为假设亲代与子代个体不具有亲生关系；上述微卫星引物包括以下引物由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的微卫星引物ETH225；由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的微卫星引物BM1818；由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的微卫星引物INRA035；由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的微卫星引物BM2113；由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的微卫星引物TGLA227；由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的微卫星引物CSRM60；由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的微卫星引物BM2934；由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的微卫星引物BM1862。2、根据权利要求1所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于所述PCR扩增的25yL反应体系包括DNA模板1.25ng，10XPCR缓冲液2.50wL，25mmol/L的MgCl21.50uL，2.5腿ol/L的dNTPs1.00uL，5U/uL的ExTaqDNA聚合酶0.50uL，20pmol/nL的上游引物O.50nL，20pmol/iiL的下游引物0.50uL，余量为灭菌蒸馏水。3、根据权利要求1所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于所述25uL反应体系PCR扩增反应条件为94。C预变性5min;94'C变性30s，50-65°C退火30s，72。C延伸30s，共35个循环；72。C延伸10min。4、根据权利要求1所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于还包括以下步骤由序列表中序列17、序列18及序列19、序列20组成线粒体D-Loop区引物，以待检水牛基因组DNA为模板，对线粒体基因片段进行50iiL反应体系的PCR扩增，对线粒体PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶纯化，利用双脱氧终止法对纯化后的PCR产物进行测序，用DNAman软件分析待检样品的DNA序列一致率，若线粒体DNA序列完全一致，则说明待检样品间存在亲缘关系。5、根据权利要求4所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于所述PCR扩增的50pL反应体系包括DNA模板2.5ng，10XPCR缓冲液5uL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5mmol/L的dNTPs4uL，5U/PL的ExTaqDNA聚合酶O.50uL，20pmol/uL的上游引物1pL，20pmo1/uL的下游引物1uL，余量为灭菌蒸馏水。6、根据权利要求4所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法，其特征在于所述50uL反应体系PCR扩增反应条件为94。C预变性5min;94。C变性lmin，55°C退火lmin，72"延伸lmin，共35个循环；72。C延伸10min。7、一种用于鉴定单亲水牛亲权关系的试剂盒，其特征在于试剂盒中包含序列表中序列1-20的引物，以及以下试剂TsgDNA聚合酶，10XPCR扩增缓冲液，dNTPs，无菌水，10X凝胶上样缓冲液，0.5mL磷酸缓冲盐溶液，2mg/mL蛋白酶K，1C)q/。SDS液，饱和酚，氯仿，异戊醇，70%乙醇，无水乙醇，TE溶液，30%聚丙烯酰胺溶液，5XTBE电泳缓冲液，10%过硫酸铵溶液，NNNN-四甲基乙二胺，含10%乙醇、0.5%冰乙酸的固定液，1%硝酸溶液，0.2%硝酸银溶液，含1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛的显色液，0.75%碳酸钠溶液，分子量标准物pUC18DNA/MspI，DNA分子量标准DL2000，核酸染料，6X凝胶上样缓冲液；所述各种溶液的溶剂均为水。全文摘要本发明公开了一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法及其引物、试剂盒，属于基因工程
技术领域：
。本发明筛选出多态性丰富的8个微卫星引物，以待检水牛基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据检测结果判断每个个体的基因型，根据基因型计算单亲亲权指数PI值、亲子相对概率值W值，根据W值判断亲权关系是否存在。为进一步提高鉴定的稳定性、准确性和灵敏度，本发明还根据普通牛mtDNA的D-Loop区设计引物进行线粒体遗传鉴定。本发明将微卫星与线粒体遗传标记两种方法相结合，从不同的角度进行鉴定，且鉴定结果一致，提高了亲权鉴定的稳定性、准确性、灵敏度，使鉴定范围更广、样品要求更低。文档编号C12Q1/68GK101509033SQ20081014809公开日2009年8月19日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者蕊孙,徐亚欧,亮毛申请人:西南民族大学