专利名称：一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法
技术领域：
本发明设及一种利用海洋微藻产氢的新方法。即高密度培养和产氢一体化的新 工艺。
背景技术：
随着近年来对绿藻制氢的深入研究，人们相继发现了很多种具有明显产氢 會g力的绿藻，如Scenedesmus obliquus， Chlamydomonas reinhardtii， Platymonas subcordiformis等。与此同时，产氢工艺的研究也取得了很多卓有成效的进展。如Zhang 等发现淡水莱茵衣藻在缺硫连续光照条件下，由于硫元素的缺乏，使半胱氨酸合成受阻，进 而导致PS II上的Dl蛋白无法及时修复，降低PS II的光化学活性及产氧量。当体系中的 产氧速率和呼吸耗氧速率相等时，就造成了一个厌氧的环境，使衣藻的氢酶得以表达，实现 连续产氢。管英富等利用解偶联剂CCCP对暗诱导后的海洋亚心形扁藻进行处理，发现CCCP 可以起到与淡水绿藻缺硫调控相同的效果，降低PS II的光化学活性及产氧量而不影响呼 吸耗氧速率，从而形成厌氧环境，使扁藻氢酶表达，实现连续光照产氢。同时CCCP能够打开 类囊体膜上的质子通道，从而使质子大量渗出，为氢酶提供充足的底物，进一步促进产氢。 这些从机理水平上提出的产氢新工艺，为绿藻产氢的工业化应用提供了可能。
目前的产氢工艺大都是将微藻培养于摇瓶中，然后于对数生长期收集后，再用于 光照产氢。由于摇瓶培养所获得的藻细胞密度低，无法达到产氢要求的最优密度，因此在产 氢前需要离心浓縮来达到产氢要求的生物量。该产氢工艺流程复杂，离心浓縮需要消耗额 外能量，并且对微藻细胞会产生一定的破坏作用进而降低产氢能力。而利用整合了燃料电 池的平板式光生物反应器，进行高密度培养和产氢过程相结合的工艺技术未见报道。
发明内容
本发明研究了一种将微藻高密度培养阶段和光照产氢阶段有机结合的新型产氢 工艺。目的是简化现有产氢工艺，为规模化产氢提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 以 一 种具有光解海水产氢功能的海洋绿藻_亚心形扁藻 (Platymonassubcordiformis)为产氢对象，在整合了碱性燃料电池的平板式光生物反应器 中，通过富加二氧化碳的方法，在短期内实现扁藻生物量大量积累，进而达到产氢所需的藻 密度，此阶段为高密度培养阶段。然后通过气阀调节，使反应器处于密闭状态，并通入氮气 使反应器内处于厌氧状态。此状态下的藻液经过4小时的暗诱导后，即可进行连续光照产 氢。此阶段即为光照产氢阶段。系统中产生的氢气可被碱性燃料电池所利用转化为电能， 同时，氢气的消耗使反应系统中的氢分压较低，可减轻氢气的反馈抑制作用。由于电路中电 子数量与氢原子数具有一一对应的关系，因此，通过测量电池外电路电流变化就可计算出 体系内氢浓度的变化，进而对整个产氢过程实现实时监控。本发明縮短了微藻培养时间，简 化了现有的产氢工艺，实现了微藻培养和光照产氢的一体化。
本实验所建立的一体化光生物反应器系统如图1所示，在微藻的培养阶段，转换
阀D为开放态，通过泵C向反应器中泵入空气、(A混合气，为藻提供碳源的同时还能够起到
搅动藻液的作用；在制氢阶段开放B，以^吹扫IO分钟，除去反应器中的氧，此时D仍为开
放态。接着，关闭B、D，使反应器处于密闭状态。并继续由泵C进行体系内气体的自循环。
系统产生的氢气被燃料电池E所消耗，E的电流变化可由监测系统G进行记录。 —种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法，以具有光解海水产氢功能
的单细胞海洋绿藻_亚心形扁藻为产氢材料，在平板光生物反应器上外接碱性氢氧燃料电
池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系
内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；进而实现将海洋微藻高密度培养、光解水产氢
相结合的实用化的平板光生物反应系统。 具体操作过程为， 1)扁藻接种于平板光生物反应器中投加康维方培养基，接种处于指数生长期的 扁藻，扁藻的接种密度为0. 5-1 X 106Cell/mL ; 2)扁藻培养接种后的扁藻先在培养温度为22-3(TC，光强为80-150 iiE/m2. s—、 光暗比为12-14 : 10-12的培养条件下适应一天，接着通入2-5% V/V浓度的二氧化碳和空 气的混合气，通气量为0. 2-1 vvm ; 3)当平板反应器中的藻密度达到6-10Xl(fcell/mL时，即进行产氢；产氢时，将 反应器密封，再通入氮气吹扫10-20分钟，以达到厌氧状态；接着使反应器避光4-12小时进 行暗诱导，使扁藻氢酶充分表达； 4)暗诱导后，加入终浓度为7. 5 15 ii M解偶联剂CCCP到藻液中，并利用NaOH和 HC1将藻液pH值调至7-8 ;注入解偶联剂20-30分钟后，再施加100-150 y E/m2. s—1的光照 于平板反应器之上，进行连续光照产氢； 产氢过程中，光反应器内藻液上方的气体循环由一台微型真空泵来完成，真空泵 将藻液上方的气体鼓入藻液内，以确保产氢时，系统的厌氧环境。 步骤2)培养阶段和步骤4)产氢阶段所需光强，由5-10只荧光灯提供，照光方式 为单侧光照；光强的具体数值由辐照计测量；通过调整光源与反应器的距离来达到所需的 光照强度。 5)光反应器内藻液产生的氢气通过管路导入碱性氢氧燃料电池的氢电极，通过燃 料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；系统产 生的氢气被燃料电池所消耗，电流变化可由监测系统进行记录。6)体外氢酶活性的测定在厌氧环境中进行。以50mmol磷酸缓冲液(pH6. 8)作为
缓冲液，以被连二亚硫酸钠(Na2S204)还原的甲基紫精(Methylviologen， MV)作为电子供
体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和lOOmM的连二亚硫酸钠及500 y 1藻液。在37°C
水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气组分含量。按下式计算体外氢酶活性
",..," n，，-i,-i， 9x40x(^腳/7/， 1
Zfy<irogewas￡<3cm^(v[〃wo//f2.wgC7// ] = ~t;^-^-^~二，'，…， 7)由光照反应器中取10 iiL藻液，注入Water PAM叶绿素荧光仪的测量杯中，再加 入3mL无菌海水培养基，混合后进行测量。通过A F/Fm'及Yeild等叶绿素荧光参数的变 化，反映藻细胞PS II的光化学活性变化。
8)由燃料电池监测的所有数据点以时间为横坐标作图，得到电流、氢酶活性和PS
n活性随时间变化的关系曲线。由电流变化曲线依据电子数和消耗的氢原子数的一一对应 关系积分计算产氢量，并参照氢酶活性和PS n活性随时间变化的关系曲线研究产氢机理。 本发明与现有技术相比具有如下优点 1.大大简化了现有的微藻产氢工艺，将高密度培养阶段和光照产氢阶段相结合， 省去了以往的制氢前离心浓縮步骤。节省了产氢运行成本，降低产氢过程中人力的投入。
2.可真正实现循环产氢。在一次接种后，经培养阶段和产氢阶段后，可将反应器中 的藻液放出，只留少量的藻液作为接种物。然后添加新鲜培养基，进入下一个培养阶段，待 藻密度达到产氢要求后，即可进行光照产氢。如此即可实现产氢过程的循环。
3.在每个产氢循环当中放出的藻液，可被进一步的深入利用。如提取油脂，发酵 生产乙醇等。如能规模化生产，每个循环中会积累数量可观的藻类生物质。从而实现培养 藻类生物质和生产氢气的双重目的。 4.由于培养、产氢一体化反应器采用平板式设计，比起现有的圆柱形搅拌反应器，
可大大提高光能利用效率。理论上讲，可在更高的藻密度条件下，光照产氢。 5.采用气体鼓泡式搅拌方式，在搅动藻液的同时，还能促进气体的交换。省去了实
验室中常用的磁力搅拌方式。另外，在产氢阶段通过卫星循环泵，可实现密闭反应器中气体
的自循环，使产生的氢气能够迅速的实现液相到气相的转换，有利于燃料电池消耗氢气产
生电流。并能够进一步减轻氢气对产氢过程的反馈抑制作用。 总之，本发明大大简化了扁藻光解水产氢过程，减少产氢过程中的人力投入，为循 环式微藻产氢提供了技术支持。
图1为本发明中使用的高密度培养和光照产氢一体化反应器简图； 其中A :二氧化碳气瓶；B :氮气瓶；C :微型真空循环泵；D :气路转换阀；E :碱性
燃料电池；F :辐照计；G :燃料电池在线监测系统；H :板式光生物反应器；1 :气体分散装
置； 图2为不同二氧化碳培养条件下扁藻生长动力学曲线(藻密度变化)； 图3为不同二氧化碳培养条件下扁藻生长动力学曲线(干重变化)； 图4不同二氧化碳培养条件下叶绿素荧光产率； 图5不同二氧化碳培养条件下叶绿素荧光诱导曲线； 图6产氢阶段叶绿素荧光诱导曲线； 图7产氢阶段藻细胞叶绿素荧光产率变化； 图8产氢阶段中偶联燃料电池的产氢动力学曲线； 图9产氢阶段中氢酶活性及氧浓度的变化。
具体实施例方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步说明本发明使用解偶联剂CCCP胁迫调 控扁藻产氢，使用碱性燃料电池外接30欧姆电阻持续耗氢发电，监测并记录电阻两端电压 计算得到电流，对电流曲线积分计算获得通过电路的电量值，由电子数与耗氢原子的一一对应关系计算总产氢量，该方法已由申请人申报专利(申请号200510136770. x，一种燃料 电池耗氢技术用于扁藻光解海水产氢的方法)。解偶联剂CCCP胁迫产氢采用申请人已申报 的专利技术(申请号03110981. O，发明名称一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法)， 所用燃料电池及数据采集系统为实验室自行组装研制，其他试剂均为商业化试剂。
按照常规方法配制1000倍康维方营养盐母液NaN03 100g/L， NaH2P04 *H20 20g/L， EDTA-Na 45g/L， H3B03 33. 6g/L， FeCl3 6H20 1. 3g/L， MnCl2 4H20 0. 36g/L， ZnCl2 0. 021g/ L， CoCl2 6H20 0. 02g/L， CuS04 5H200. 02g/L， (NH4)6M07024 4H20 0. 009g/L ;
用经砂滤的天然海水ll(TC高压蒸汽灭菌15min，冷却后添加1000倍康维方营养 盐母液，配制成康维方培养基(NaN03 100mg/L， NaH2P04 H2020mg/L， EDTA-Na 45mg/L， H3B03 33. 6mg/L， FeCl3 6H20 1. 3mg/L， MnCl2 4H20 0. 36mg/L， ZnCl2 0. 021mg/L， CoCl2 6H20 0. 02mg/L， CuS04 5H20 0. 02mg/L， (NH4)6M07024 4H20 0. 009mg/L);
实施例1 所用反应器如图l所示，采用3mm平板玻璃制作，规格为20cn^20ci^3cm，实际使用 体积为1. 5L。实验所需的亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)经实验室纯化后，以康 维方营养盐为培养基，培养于2升三角瓶中，接种初始密度为5X10、ell/mL，藻液体积为1 升；培养温度为25t:;光强为50i!E/m2.8—、光暗比为14 : 10。当摇瓶中的藻处于指数生 长期时，稀释至106cell/mL，接种于平板反应器中，藻液体积为1. 5L。培养过程中，采用不同 浓度的C02对藻液进行通气培养，以考察不同浓度的C02对扁藻生长的影响，并找出适合高 密度培养扁藻的(A浓度。实验结果如图2，图3所示。结果表明培养阶段通入2%和5% 的(A，可明显促进藻的增殖，9天内即可使藻密度达到8. 5X106cell/mL左右，近乎空气处 理组的两倍。同时，该两组处理对扁藻干物质的积累有明显的促进作用；而10%和15% C02 处理组对藻密度和干重的影响不很明显，几乎与空气处理组相同；20% C(^处理组对藻的生 长有着明显的抑制作用，可能的原因是由于高浓度的(A使藻液pH值持续下降，进而造成 酸碱胁迫所致。 图4的结果显示2% C02处理组的这两项指标均为最高，PS II活性最好，具有较强 的光合能力；而5%0)2处理虽有较强的潜在光合能力，但其实际光合量子产率并不高。另 外，通过快速光诱导曲线(图5)实验结果，各处理组中，2%0)2处理组具有最强的电子传 递能力(电子传递能力是高效产氢的物质保障)。可见2%0)2处理组培养的扁藻具有最 高的光合能力及较强的光合电子传递能力。可以省去目前产氢方法中的离心浓縮步骤。这 些结果说明，本发明在扁藻培养阶段能够促进生物质的快速积累，并能够在短时间内达到 产氢所需的生物量，可以省去目前产氢方法中的离心浓縮步骤。
实施例2 在图1所示的反应器中，当扁藻密度达8 X 106cell/mL时，关闭C02气瓶，并使反应 器避光。然后将气路转化阀转至^气阀，并打开氮气瓶，利用氮气将反应器中的氧气吹扫干 净，10分钟后反应器内即达厌氧状态。最后将气路转换阀关闭，使反应器处于暗处进行4小 时的暗诱导。此期间微型真空循环泵要始终处于开放状态，以起到对藻液的搅拌作用。在 光照前，向反应器内注入15ii L的CCCP，20分钟后进行连续光照产氢，光照强度为100 ii E/ m2. s 、 图6的结果表明，随着产氢时间的推移，快速光诱导曲线不断下降，说明光合电子
6传递的能力(相对电子传递速率rETR)随着时间的推移而逐渐减弱，进而影响氢酶的电子 和质子供给，使产氢能力下降。造成这一现象的可能原因是产氢时的高光强造成光抑制；储 藏物质的大量消耗，造成维系自身生存的能量供给不足；产氢过程中的副产物如甲酸、乙 酸等对藻体产生毒害作用。图7显示产氢体系中Fv/Fm和AF/Fm'都随着时间的推移不断 的下降，说明一旦光照产氢开始，PS II即处于一个逐渐失活的状态。其原因可能是自身D1 蛋白无法得到及时修复，进而造成还原侧电子积累，使活性下降。Dl蛋白的修复较为缓慢， 而电子积累造成的活性下降相对较快，二者相互竞争使得光照10小时内PS II活性下降明 显，此后达到一个相对稳定的状态；产氢20小时后，PS II活性继续下降，电子供给能力进 一步减弱。 图8为碱性燃料电池耗氢速率与扁藻产氢速率的关系比较。经计算，产氢的总体 积为26. 77mL，燃料电池耗氢总体积为26. 35mL，最大产氢速率为1. 65mL/h，最大耗氢速率 为1. 23mL/h。该产氢动力学过程大致分为三个阶段第一阶段，产氢速率迅速上升阶段。这 一阶段光合电子传递能力强，氢酶活性高，产氢速率大于耗氢速率，反应器中氢气浓度不断 加大，产氢系统处于"供大于求"状态；第二阶段，产氢速率下降阶段。此阶段产氢速率持续 下降，至a点处与耗氢速率相等，此后便始终低于燃料电池的耗氢速率，并一直延续到光照 后的60小时左右，这一阶段系统处于"供不应求"的状态；第三阶段，产氢稳定状态。这一 阶段，系统的产氢速率基本恒定，但较低。扁藻所产氢气全部被燃料电池消耗，反应器中氢 气浓度接近为零。图9显示了产氢过程中氢酶活性及反应器中氧含量的变化情况。随着时 间的推移氢酶活性越来越低，而随着氧含量的进一步升高，使氢酶的活性受很大抑制，进而 使藻细胞的产氢能力持续下降。 动力学曲线与前述PS II活性、光合电子传递能力(rETR)及氢酶活性在变化趋势 上能够很好的吻合，说明这些指标是影响产氢的最关键因素。也印证了本发明可以作为研 究产氢机理的技术平台。
权利要求
一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法，其特征在于以具有光解海水产氢功能的单细胞海洋绿藻-亚心形扁藻为产氢材料，在平板光生物反应器上外接碱性氢氧燃料电池持续耗氢系统来维持体系内较低氢分压，通过燃料电池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；进而实现将海洋微藻高密度培养、光解水产氢相结合的实用化的平板光生物反应系统。
2. 按照权利要求1所述的的制氢方法，其特征在于具体操作过程为，1) 扁藻接种于平板光生物反应器中投加康维方培养基，接种处于指数生长期的扁 藻，扁藻的接种密度为0. 5-1 X 106Cell/mL ;2) 扁藻培养接种后的扁藻先在培养温度为22-3(TC，光强为80-150 iiE/m2. s—、光暗 比为12-14 : 10-12的培养条件下适应一天，接着通入2-5% V/V浓度的二氧化碳和空气的 混合气，通气量为0. 2-1 vvm ;3) 当平板反应器中的藻密度达到6-10X106cell/mL时，即进行产氢；产氢时，将反应 器密封，再通入氮气吹扫10-20分钟，以达到厌氧状态；接着使反应器避光4-12小时进行暗 诱导，使扁藻氢酶充分表达；4) 暗诱导后，加入终浓度为7. 5 15 ii M解偶联剂CCCP到藻液中，并利用NaOH和HC1 将藻液pH值调至7-8 ;注入解偶联剂20-30分钟后，再施加100-150 y E/m2. s—1的光照于平 板反应器之上，进行连续光照产氢；5) 光反应器内藻液产生的氢气通过管路导入碱性氢氧燃料电池的氢电极，通过燃料电 池的持续耗氢以保持光反应器体系内较低氢分压，消除产物抑制，提高产氢量；系统产生的 氢气被燃料电池所消耗，电流变化可由监测系统进行记录。
3. 按照权利要求2所述的的制氢方法，其特征在于在步骤4)产氢过程中，光反应器 内藻液上方的气体循环由一台微型真空泵来完成，真空泵将藻液上方的气体鼓入藻液内， 以确保产氢时，系统的厌氧环境。
4. 按照权利要求2所述的的制氢方法，其特征在于步骤2)培养阶段和步骤4)产氢阶 段所需光强，由5-10只荧光灯提供，照光方式为单侧光照；光强的具体数值由辐照计测量；通过调整光源与反应器的距离来达到所需的光照强度。
全文摘要
本发明利用整合了燃料电池的平板光生物反应器，将微藻高密度培养和光照产氢进行了整合，形成一体化产氢体系。通常微藻培养和光合产氢两段工艺在时空上是分开的，培养的低密度藻细胞需经浓缩再光照产氢，因此要分别在两个光生物反应器中进行。本发明微藻产氢是将低密度微藻接种于反应器中，利用富加二氧化碳的培养方式，经短期培养即可达到产氢所需的生物量，然后再经暗诱导，即可进入连续光照产氢阶段。所产生的氢气可被整合于反应器之上的燃料电池转化为电能，并可通过电流的变化，对产氢状况进行实时监测。本发明首次将微藻培养和产氢两段工艺相结合，并利用燃料电池将氢转化为电能，为规模化微藻产氢提供了可靠的技术支持。
文档编号C12R1/89GK101748154SQ20081022997
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者傅赟彬, 张卫, 彦飞, 郑阳, 陆洪斌, 陈兆安 申请人:中国科学院大连化学物理研究所