专利名称：膀胱癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属生物技术领域，具体涉及一种膀胱癌遗传风险基因位点检测试剂盒，是通过利用荧光定 量PCR，检测基因组DNA样本中的三个膀胱癌遗传风险基因SNP位点基因型的试剂盒。
背景技术：
膀胱癌是指来源于膀胱壁上皮组织和间质组织的恶性肿瘤。膀胱为锥体形囊状肌性器官，位于小骨盆 腔的前部，贮存由肾脏产生的尿液。当它受刺激时，外层的细胞过度增生，就可能转化为肿瘤。该肿瘤发 病之初表现为膀胱的内壁有很小的、浅的肿块，但当肿瘤恶化之后，癌细胞的快速繁殖并扩散至膀胱肌， 浸润周围的脂肪和组织，最终将侵入血液和淋巴系统。膀胱癌患者若不进行治疗，从出现症状到死亡平均 只有16个月，其中约42%的患者生存仅1年，16%的患者生存2年，生存5年的只占5%。
国内外大量关联研究及流行病学研究表明，膀胱癌与遗传因素关系密切，该疾病的遗传易感性研究主 要集中于药物代谢相关基因。通过基因检测可以确定遗传高风险人群，并可相应制定有针对性的预防和治 疗策略，对降低膀胱癌的发病和死亡都具有重要作用。
研究表明，膀胱癌的发病与N-乙酰基转移酶2基因(NAT2)上的T342C位点、G590A位点和G857A位 点这三个SNP位点基因型有很密切的关系。
N-乙酰基转移酶(NAT)是含氨基药物和外源化合物代谢过程中的重要酶系，涉及到许多药物、色素、 香精、工业化合物的体内转化，在多数情况下起降解作用。NAT共有三种类型^NAT1、NAT2和假基因NATP。 NATP是一个无效基因，没有表达产物。NAT1和NAT2在核苷酸组成、催化底物和分布部位等方面存在不同， 但是也有部分重叠。NAT1和NAT2都具有催化芳香胺和杂环胺N-乙酰化(一般为灭活反应)和0-乙酰化(一 般为激活反应)的作用，且这些作用在肝脏、胃肠道和膀胱部位尤为活跃。NAT1主要分布在红细胞和淋巴 细胞中；NAT2主要分布在肝组织中。对膀胱癌的致癌物，如4-氨基联苯(4-柳inobiphenyl， ABP)和13-萘 胺(J3-naphthylamine， BNA), NAT2的亲和性比NAT1要高出3到4倍，因此NAT2对于膀胱癌致癌物的灭活 和激活具有重要作用。香烟烟雾中就含有大量的ABP和BNA。
NAT2基因位点突变可导致与底物亲和力下降和热不稳定性增加，酶促反应活性降低。截止2008年2 月29日止，共发现了NAT2的等位基因有52种，其中在亚洲人群中，最常见的突变(NAT2*5、 *6和*7) 分别包含13、 12和2种。
NAT2*5、 *6及*7是造成NAT2代谢能力降低的主要等位基因。其中*5造成该基因第341位碱基T突变 为C，导致NAT2蛋白第114位异亮氨酸变为苏氨酸，使酶活性降低92-99%。该位点有三种基因型，分别 为TT(Ile/Ile)、 TC(Ile/Thr)、 CC(Thr/Thr)，其中CC被确定为风险基因型，与膀胱癌患病风险增加有关。 承6造成该基因第590位碱基G突变为A，引起NAT2蛋白第197位精氨酸变为谷氨酰胺，使酶活性降低58-81%。 该位点有三种基因型，分别为GG(Arg/Arg)、 GA(Arg/Gln)、 M(Gln/Gln)，其中M被确定为风险基因型， 与膀胱癌患病风险增加有关。*7造成该基因第857位碱基G突变为A，导致NAT2蛋白第286位甘氨酸变 为谷氨酸，使得NAT2活性降低50-60%。该位点有三种基因型，分别为GG(Gly/Gly)、 GA(Gly/Glu)、 M(Glu/Glu)，其中M被确定为风险基因型，与膀胱癌患病风险增加有关。
根据NAT2乙酰化代谢速率与其突变等位基因之间的关系，可以建立等位基因的各种组合与乙酰化代 谢快慢的对应关系。快速乙酰化基因型为野生基因型(3个位点中不发生任何突变)；中速乙酰化基因型包 括341TC、 590GA或857GA三个杂合基因型中的任意1到3个点突变；慢速乙酰化基因型包括这三个位点 的剩余组合形式，即341CC、590M或857AA三个突变纯合基因型中的任意1到3个点突变。当携带NAT2*5、 *6或*7风险基因型(慢代谢型)时，NAT2酶热不稳定性增加，与底物亲和力下降，酶活性下降，膀胱癌 相关的致癌物更多地被细胞色素P450氧化产生羟胺，然后经NAT2使羟胺的氧原子发生乙酰化生成化学性 质不稳定的醋酸酯。醋酸酯上的N-O键裂开产生具有亲电子能力的基团。该基团能结合到DNA碱基或蛋白 质等胞内大分子上，从而导致遗传毒性或细胞毒性增加，膀胱癌发生风险上升。
3荧光定量PCR是近几年来兴起的生物学技术，具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达 研究、SNP位点分析等诸多领域，该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染， 结果判断有计算机完成，简化了操作步骤，并增加了结果的可靠性。是一种简便快速检测SNP位点基因型 的方法。
发明内容
本实用新型针的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术同时检测三个膀胱癌遗传风险基因SNP位点的 试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测三个SNP位点的荧光定量PCR反应液的三个试管、装有阳 性对照品的一个试管、装有阴性对照品的一个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置三管荧光定量PCR 反应液、阳性对照品和阴性对照品。
其中荧光定量PCR反应液的成分主要包含PCR缓冲液、MgCh、 dNTPs、 SNP位点检测用上游引物、SNP 位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。
其中，
T342C位点检测引物和探针为
上游引物序列5， - AGGGTGAGATTCCMGATAA -3'
下游引物序列5' - CAAGCAAATGACTMAGAGAA -3'
基因型一荧光探针序列5' -FAM - GGATTTAAAGCcTTT - TAMRA -3'
基因型二荧光探针序列5' -VIC - AGGATTTAMGCtTT - TAMRA -3'
G590A位点检测引物和探针为
上游引物序列5' - TCTATGTCCMGCTGTG -3'
下游引物序列5' — GGGTTTTGGTGTCATC -3'
基因型一荧光探针序列5' - FAM - ATCCAaAAAGTCCA - TAMRA -3' 基因型二荧光探针序列5' — VIC - TCCAgAAAGTCCA - T細A -3' G857A位点检测引物和探针为 上游引物序列5' - AACTCTGGGAGATTCTC -3' 下游引物序列5， - TATCAGTGAAGGAATCG -3' 基因型一荧光探针序列5' - FAM - GACaCAGMAG -TAMRA -3' 基因型二荧光探针序列5， - VIC - GACgCAGMAG -TAMRA -3'
对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为口腔粘膜细胞DNA 样品。
本试剂盒保存于-2(TC，尽量减少反复冻融。
本实用新型试剂盒使用方法
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为9个反应管，每一个SNP位点检测使用3个反应管，其中1 个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用1个反应管，每管中总体积10ul，其中8ulPCR反 应液，2wl检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为5(TC、 2分钟，95°C、 10分钟， 再进行60个循环的95'C、 30秒，60'C、 1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取，根 据得到的二维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。
本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测被检测者对于膀胱癌的遗传得病风险和患病机理，从而指导 被检测者选择正确的生活饮食习惯避免疾病的发生，对于已患病者可指导医师针对其患病机理选择正确的 临床治疗方案，有利于患者进行个体化治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCK技术实现了同时检测三个膀胱癌遗传风险基因SNP 位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一 疾病相关的三个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对膀胱癌遗传风险的结果 分析也更便捷。
图1为本实用新型的结构示意图。 图2为T342C位点被检测样品的二维荧光图。 图3为G590A位点被检测样品的二维荧光图。 图4为G857A位点被检测样品的二维荧光图。 图5为所有位点被检测样品的实时扩增曲线。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于 限制本实用新型范围。
实施例l
参见图l，本实用新型试剂盒由包装盒体1、衬垫2、装有检测三个SNP位点的荧光定量PCR反应液的 三个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分 别放置三管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。
其中荧光定量PCR反应液的成分主要包含PCR缓冲液、MgCh、 dNTPs、 SNP位点检测用上游引物、SNP 位点检测用下游引物、SNP位点基因型一荧光探针、SNP位点基因型二荧光探针、Taq DNA聚合酶。
本试剂盒保存于-2(TC ，尽量减少反复冻融。
实施例2荧光定量PCR法同时检测三个膀胱癌遗传风险基因SNP位点基因型
1. 材料
血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCK相关试剂购于美国Promega 公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
2. 引物及探针设计与合成
分别针对三个SNP位点设计荧光定量PCR引物和探针，根据引物和探针的设计原则以及基因组DNA序 列情况，从中选择最佳组合。引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。 T342C位点检测引物和探针为 上游引物序列5' - AGGGTGAGATTCCAAGATM -3' 下游引物序列5' - CMGCAAATGACTAAAGAGAA -3' 基因型一荧光探针序列5， -FAM - GGATTTAAAGCcTTT - TAMRA -3' 基因型二荧光探针序列5' -VIC - AGGATTTAAAGCtTT - TAMRA -3' G590A位点检测引物和探针为 上游引物序列5' - TCTATGTCCAAGCTGTG -3' 下游引物序列5' - GGGTTTTGGTGTCATC -3'
基因型一荧光探针序列5' - FAM - ATCCAaAMGTCCA - TAMKA -3' 基因型二荧光探针序列5' - VIC - TCCAgAAAGTCCA - TAMRA -3'G857A位点检测引物和探针为 上游引物序列5' - AACTCTGGGAGATTCTC _3， 下游引物序列5， - TATCAGTGAAGGAATCG -3' 基因型一荧光探针序列5' - FAM - GACaCAGMAG - TAMRA -3， 基因型二荧光探针序列5' - VIC - GACgCAGMAG - TAMRA -3'
3. 样本检测
选取30例血液样本，其中已确诊患上膀胱癌的为22例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。 每一例检测为9个反应管，每管中总体积10 u 1,其中8 u 1 PCR反应液，每一个SNP位点检测使用3个反 应管，1个反应管中加入2 u 1被检测DNA，另外2个反应管中加入2 y 1阳性对照和阴性对照，在ABI7900 荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为5(TC、 2分钟，95°C、 10分钟，再进行60个循环的95°C、 30秒， 60°C、 l分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
4. 结果
被检测样本的N-乙酰基转移酶2基因(NAT2)上T342C位点的二维荧光图参见图2， G590A位点的二 维荧光图参见图3， G857A位点的二维荧光图参见图4，所有位点实时扩增曲线参见图5。
30例被测样本的三个SNP位点基因型统计结果参见表1。
表l SNP位点基因型统计结果
SNP位点
高风险基因型
无风险基因型1
无风险基因型2
T342C位点 G590A位点 G857A位点
CC 21例 AA 25例 AA 28例
TC 8例 AG 4例 AG l例
TT l例 GG l例 GG l例
权利要求1.一种膀胱癌遗传风险基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(1)、衬垫(2)、装有检测三个SNP位点的荧光定量PCR反应液的三个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置三管荧光定量PCR反应液(3)、阳性对照品(4)和阴性对照品(5)。
专利摘要本实用新型提供了一种膀胱癌遗传风险基因位点检测试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测三个SNP位点的荧光定量PCR反应液的三个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置三管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测三个膀胱癌遗传风险基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病相关的三个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对膀胱癌遗传风险的结果分析也更便捷。
文档编号C12Q1/68GK201390750SQ2008201569
公开日2010年1月27日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司