专利名称：：大家白蚁快速pcr检测方法
技术领域：
：本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体的说是一种对大家白蚁进行快速检测的PCR检测方法。
背景技术：
：白蚁隶属于昆虫纲等翅目(Isoptera)，共有7科286属2860余种，是一类世界性的重要害虫。我国已记载的白蚁超过400种，具有较大危害性的白蚁种类繁多，特别是乳白蚁属(Coptoter附"Wasmann，1896)，其中大家白蚁(C.cwn^m^wsHollmgren)是世界已知为害严重且易被引进和传播蔓延的最具威胁的白蚁种之一。该白蚁适应性强，分布广，繁殖迅速，不仅能危害多种树木，蛀食坚硬的木材甚至含纤维素的木材加工品如纸、棉布、皮革制品等，还能危害埋地通讯电缆塑料护套层和农林作物。该白蚁的危险性不仅表现在它所造成的损失，更重要的是它在传入或输出后能在新的地域快速建群、繁殖、扩散，给新的地域造成新的损失和危害。我国的淮河以南地区是大家白蚁的适生地区，特别是广东、广西、海南、云南和福建等地处亚热带和热带的气候条件，森林资源丰富，降雨量充足，是大家白蚁种群理想的栖息地。一旦传入，筑巢建群，将给我国的森林资源、环境资源以及建筑业等造成难以估量的损失。长期以来，有关白蚁的分类和鉴定单纯依赖于物种的生物学性状、形态解剖学的主要特征，结合生物地理学信息为依据；由于昆虫许多表型特征的保守性，且易受环境的诱变，在种内也存在一定的形态变异范围，来自不同地理种群的生物型其行为学和生物学特点也存在差异。因而传统的以形态学进行的鉴定不仅主观而且繁琐，难以可靠地分析和鉴别近似种间存在的差异，更难于揭示不同类群的昆虫在进化过程中的亲缘关系。有关乳白蚁属种类的鉴定难度为世界白蚁分类专家所公认，该属下各种，形态彼此极为相似，同时相当数量的种类，其兵蚁头型有变异，而且大量使用白蚁各个部位的大小度量作为区分近似种的特征，有时还是重要特征，这也给鉴定工作带来非常大的困难。此外，在白蚁现场检疫时不易获得兵蚁品级，获得有翅成虫的几率更低，仅仅依据工蚁形态特征很难鉴定到种级水平，结果也不可靠。这种以兵蚁的形态学和解剖学的主要特征，结合形态测量值为主要依据的传统鉴定方法，受环境和地理条件的影响相当大，并且不同地理分布的白蚁在形态数据测量上也不尽一致，导致实际鉴定过程中可靠性低，准确性差，漏检、错检普遍，并不符合检验检疫口岸快速通关的要求。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速、稳定可靠、灵敏度高的大家白蚁PCR检测方法。如图1所示，编码核糖体RNA的基因(rDNA)是真核生物中最为保守的结构基因，它以衔接重复的方式排列，每一个重复包括三个编码区(分别编码18S，5.8S和28SRNA基因)，编码区之间被两个ITS(InternalTranscribedSpacers)所分隔，重复之间分别被一个ETS(ExternalTranscribedSpacer)和一个IGS(IntegenicSpacer)所分隔，由于rDNA在基因组内有数百个拷贝(增加了检测的灵敏度)和ITS及IGS区域在种内的稳定性及种间的差异，使其成为许多生物遗传变异研究的重要对象，也是近年来昆虫遗传变异、系统进化及分子鉴定研究中的一个热点，已有的研究表明许多昆虫同一类群不同种的ITS区域在碱基序列的长度上高度保守，并无明显的差异，而核苷酸序列的却具有高度变异性，是非常理想的昆虫分子标记基因。本发明通过实验克隆鉴定了大家白蚁、印缅乳白蚁、塞庞乳白蚁、台湾乳白蚁和婆罗乳白蚁5种乳白蚁18个种群的ITS序列，用于对乳白蚁属种间以及种内不同地理种群之间的遗传差异进行研究，结果显示ITS序列在乳白蚁属种内高度保守，种间又有一定程度的变异，是比较好的研究乳白蚁不同种间系统发育关系的标记基因；其中通过测序得到的大家白蚁ITS序列长度为904bp，测序结果为(如序列表N0.6):ACACACACACACTACATCCGACCTCAGATCAGGCGAGA-3，;根据上述实验得到的大家白蚁ITS序列以及其他种群的ITS序列，经过DNAstar软件比对分析，依据其在ITS1与ITS2上的差异，对大家白蚁的特异性引物进行设计，得到本发明所采用的第一种检测方案为(1)取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-2(TC保存备用-，(2)建立PCR反应体系取上下游引物CC-F5和CC-R5、10xPCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶和ddH20，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述上游引物CC-F5和下游引物CC-R5序列分别为上游引物CC-F5:5，國AGCACGGACCTGTCCGATGCC-3，下游引物CC-R5:5'画CCATCTTCGGGCCCGCGGCCT隱3，；(3)进行PCR扩增，PCR反应条件是预变性94'C，5min;94'C变性lmin，退火延伸72。C，lmin，30个循环；最后72"延伸5min。(4)rDNAITS区扩增完成后，取PCR反应产物及上样缓冲液在1.5%的琼脂糖TAE凝胶电泳分离，电泳后经EB染色，凝胶成像系统上观察记录和拍照。所述PCR反应体系的反应总体积为50pl，各成分组成如下5pl的710xPCR缓冲液、3pi的MgCl2(25mmol/mL)、4|al的dNTP混合物(各10mmol/mL)、上下游引物CC-F5和CC-R5各2fxl、2.5units的TaqDNA聚合酶，最后加ddH20补充至总体积为45^d，再加5)ilDNA悬浮液。所述上游引物CC-F5和下游引物CC-R5的使用浓度为0.10.5)imol/mL，优选浓度为0.2jimol/mL。所述模板DNA的检测限度为lng/ul，最适检测浓度为540ng/ul。本发明所采用的另一种检测方案包括(1)取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA和模板DNA的制备，-20°C保存备用；(2)建立PCR反应体系取上下游引物及特异性探针CC-F6、CC-R8禾nCC-TZ-6、10xPCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶和ddH20，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述上游引物CC-F6、下游引物CC-R8和引物探针CC-TZ-6具有的核苷酸序列分别为上游引物CC-F6:5，匿AGGCCGCGGGCCCGAAGATGG-3，下游引物CC-R8:5'-CCGAGATCTCTCTCGTATTTTC-3，引物探针CC-TZ-6:5'-FAM-ACGACAGCACTGTCTTAATCTTCG-TAMRA画3'，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；(3)进行PCR扩增，PCR反应条件是预变性94。C，lmin;95""C变性15s，60。C退火延伸lmin，45个循环；(4)荧光PCR仪读取Ct值判断检测的结果。所述PCR反应体系的反应总体积为20pil，各成分组成如下2的10xPCR缓冲液、2pl的MgCl2(25mmol/mL)、1.6pl的dNTP混合物(各10mmol/mL)、上下游引物(CC-F6、CC-R8)各0.5pl、CC-TZ-6探针0.25|il、TaqDNA聚合酶0.5units,模板DNA2ial，加ddH20至最终体积。所述上游引物CC-F6和下游引物CC-R8的引物浓度为0.10.5jimol/mL，所述引物探针CC-TZ-6的探针浓度为0.050.2)amol/mL。所述模板DNA的检测限度在0.1pg/pl。本发明的有益效果是本发明根据大家白蚁ITS基因序列特征，筛选特异性引物，建立了基于"多聚酶链式反应(PCR)"分子检测体系，克服了传统形态学检测的局限，实现了对大家白蚁的快速、准确和稳定的检测。选择大家白蚁ITS2保守区域，筛选设计了引物和探针，在对反应条件优化的基础上，建立了适用于大家白蚁不同品级的实时荧光定量PCR检测技术。该检测技术可以有效检测出8个不同种群的大家白蚁，而对其它5种白蚁11个种群检测结果阴性，证实该技术特异性强、可靠性好。灵敏性实验表明，荧光PCR方法能够检测出0.1pg/pl浓度的样品，灵敏度远远高于常规PCR。本发明建立的常规PCR和荧光PCR检测方法具有快速、灵敏和准确等优点，适用于大家白蚁不同品级样本的检测，为我国乳白蚁属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进出境植物检疫中大家白蚁的检疫鉴定，这对保护我国农林业生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全都有极为重要的意义。图1是rDNA与ITS区的序列结构示意图2是特异性引物和探针位置示意图3是本发明实施例一常规PCR特异性验证结果；图4是本发明实施例一常规PCR特异性引物的灵敏度检测结果；图5是本发明实施例二实时荧光PCR特异性验证结果；图6是本发明实施例二实时荧光PCR灵敏度检测结果。具体实施例方式实施例一本实施例对大家白蚁的特异性引物进行设计，在实验中用对大家白蚁、台湾乳白蚁、塞庞乳白蚁、印缅乳白蚁、婆罗乳白蚁和黄胸散白蚁6种白蚁进行PCR特异性检测，各标本编号及来源见下表白蚁种类品级标本来源标本编号兵蚁马来西亚原木截获DJML1兵蚁马来西亚原木截获DJML2兵蚁马来西亚原木截获DJML3兵蚁马来西亚原木截获DJML4大家白蚁兵蚁马来西亚原木截获DJ2003兵蚁马来西亚原木截获DJML5兵蚁马来西亚原木截获DJML6-2004兵蚁马来西亚原木截获DJML7-1-2008工蚁DJML7-2-2008婆罗乳白蚁兵蚁马来西亚原木截获PEML8印緬乳白蚁兵蚁缅甸原木截获YMMD1兵蚁马来西亚原木截获YMML9<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如图2所示，设计常规PCR上游引物编号为CC-F5，位于大家白蚁ITS1的第407bp-427bp位置处，见序列号NO.l;下游引物编号为CC-R5，位于大家白蚁ITS2的第641bp-661bp位置处，见序列号N0.2，扩增片段的大小为254bp。具体检测步骤为DNA模板的制备，取白蚁一头于双蒸水中漂洗，吸水纸吸干，解剖镜下剔除其体表的附着物及腹部内容物，以免原生动物污染。置于1.5mLEppendorf管中，加入40uL提取液A(含1%SDS，50mmol/LTrisCl，25mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA)，放置于-7(TC冰箱中，4min后取出，用牙签捣碎，匀浆，加入等体积的提取液B(3mmol/LKAC(PH7.2))，冰上放置lh，酚/氯仿提取基因组DNA，溶解在TE中，用微量分光光度仪测定DNA浓度和纯度后，将样品于-2(TC保存备用。以基因组DNA为模板，分别对PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化，建立高效稳定的PCR反应体系反应总体积为50pl，各成分组成如下5^1的10xPCR缓冲液、3ji1的MgCl2(25mmol/mL)、4^1的dNTP混合物(各10mmol/mL)、上下游引物(CC-F5、CC画R5)各2^1(10,ol/mL)、2.5U的TaqDNA聚合酶，最后加ddH20补充至总体积为45^1，再加5|alDNA悬浮液，而后进行PCR扩增。PCR反应条件是预变性94"C，5min;94"C变性lmin，退火延伸72°C，lmin，30个循环；最后72。C延伸5min。rDNAITS区扩增完成后，取10PCR反应产物及4pl上样缓冲液在1.5%的琼脂糖TAE凝胶电泳(90V，100mA)分离，电泳后经EB染色，凝胶成像系统上观察记录和拍照。为确保结果的可靠性，每次实验均重复三次以上。特异性验证用CC-F5/CC-R5对大家白蚁、台湾乳白蚁、塞庞乳白蚁、印缅乳白蚁、婆罗乳白蚁和黄胸散白蚁等进行PCR特异性检测，如图3(1:DJ2003，2:DJML1，3:DJML2，4:DJML3，5:DJML4，6:DJML5，7:DJML6-2004，8:DJML7画1-2008，9:DJML7画2-2008，IO:SPMLIO，ll:SPMLll，12:TWHZ1-1，13:TWPJ4，14:TWSG3，15:TWXG5，16:TWZH2-1，17:YMMD1，18:PLML8，M:Marker)所示，大家白蚁的8个种群9个样本能扩增出1条约250bp左右的DNA片段，其它5种白蚁的14个样本均未扩增出特异性条带，表明该体系具有良好的特异性。检测灵敏度:选用DJML1样本的7个不同浓度的模板DNA用来确定PCR的检测灵敏度，每个样本做两个平行样，重复三次。结果如图4(模板浓度1-2:0.lng/pl，3-4:0.5ng/|il，5-6:lng/pl，7-8:5ng/|il，9-10:10ng/(il，ll-12:20ng/(al，13-14:40ng/|il，M:Marker)，模板浓度为5-40ng/pl时，能够扩增出强烈的检测信号；对于lng/ul的模板DNA，扩增产物明显降低，检测信号较弱；0.1-0.5ng/nl模板浓度由于无扩增产物或检测信号太弱而无法检出。表明该方法的检测限度为lng/^l,最适检测浓度为5-40ng/W。实施例二本实施例采用实时荧光PCR检测，(如图2所示)荧光引物和探针都设计位于ITS2，上下游引物和探针分别编号为CC-F6、CC-R8禾nCC-TZ-6，在序列表中序列号分别为N0.3、N0.4和N0.5，预测扩增片段的大小为155bp，上游引物CC-F6序列为5，-AGGCCGCGGGCCCGAAGATGG-3，，下游引物CC-R8序列为5，-CCGAGATCTCTCTCGTATTTTC-3，，引物探针CC-TZ-6序列为5'-FAM画ACGACAGCACTGTCTTAATCTTCG-TAMRA-3'。基本检测步骤同实施例一，不同在于PCR反应体系的建立总体积为20^，各成分组成如下2|il的10xPCR缓冲液、2pl的MgCl2(25mmol/mL)、1.6)il的dNTP混合物(各10mmol/mL)、上下游引物(CC-F6、CC-R8，10Hmol/mL)各0.5(al、CC-TZ-6探针(10|imol/mL)0.25^1、TaqDNA聚合酶0.5U，模板DNA2(al，加ddH20至最终体积。PCR反应条件是预变性94"C，lmin;95。C变性15s，60"C退火延伸lmin，45个循环。将引物浓度从0.10.5pmol/mL以0.05pmol/mL递增，探针浓度从0.050.2jimol/mL以0.025pmol/mL递增，对引物和探针浓度进行不同的配比试验，根据CT值和曲线形态，确定最佳浓度以及配比；另外针对实验室所使用ABIPrism@7700型荧光定量PCR仪，对退火温度、循环参数等各个方面进行了优化试验，以期待达到最佳扩增效率。特异性验证对所有供试样本(见实施例一表格)进行实时荧光PCR反应，以检测CC-F6/CC-TZ-6/CC-R8的特异性。结果见图5(基线上方分别为1:DJ2003，2:DJML1，3:DJML2，4:DJML3，5:DJML4，6:DJML5，7:DJML6-2004，8:DJML7-l-2008，9:DJML7-2-2008;基线下方分别为IO:SPMLIO，ll:SPMLll，12:TWHZ1-1，13:TWPJ4，14:TWSG3，15:TWXG5，16:TWZH2國1，17:YMMD1，18:YMML9，19:PLML8，20:HXHZ1-1)，大家白蚁不同种群的9个样本都出现了荧光信号，Ct值在18左右，而台湾乳白蚁、塞庞乳白蚁、印缅乳白蚁、婆罗乳白蚁和黄胸散白蚁等样本都没有荧光信号，表明该方法能够对大家白蚁目标基因进行特异性的扩增。检测灵敏度为了确定实时荧光PCR检测体系的灵敏度，选取大家白蚁重组质粒为扩增模板，分别稀释为100ng/pl、10ng/pl、lng/pl、100pg4d、10pg/pl、lpg4d和0.1pg/^d等7个不同浓度加入到荧光PCR反应体系中进行测试，以台湾乳白蚁TWHZ1-1样本作为阴性对照，每个样本做两个平行样，重复三次。实时荧光PCR灵敏度检测结果见图6(基线上方从左到右模板浓度l隱2:100ng/Vd，3-4:10ng/|J，5-6:lng/Vl，7-8:100pg/Vl，9-10:10pg/nl，H醒12:lpg/Vl，13-14:0.1pg/^d，基线下方15-16为阴性对照)，大家白蚁的所有测试浓度都出现荧光检测信号，Ct值与DNA模板浓度相关，模板浓度为100ng/(al、10ng4d、lng/(il、100pg/jil、10pg/jil、lpg/^il时，扩增的Ct值分别为13.3，18.1，21.9，25.0，29.1禾卩32.8。在O.lpg/pl的浓度下荧光PCR扩增曲线明显，两个平行样间的Ct值分别为36.2和36.5，体现了良好重复性，表明该方法的检测限度在0.1pg4il以下。重复性和稳定性对5个不同种群的大家白蚁重组质粒的2组不同浓度进行重复性和稳定性检测，结果如下表，模板浓度为lng/|il，lpg/)ll的变异系数分别为4.26%和2.03%，检测结果并不存在显著差异，表明该检测方法的重复性和稳定性良好。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>经过以上两实施例特异性常规PCR和荧光PCR扩增产物测序结果与大家白蚁的DNA序列完全吻合，进一步证明上述检测方法是对大家白蚁的特异性扩增。大家白蚁隶属乳白蚁属，在这个属内种类众多，己经定名的多达76种，彼此间形态接近，其种类鉴定的难度为世界白蚁分类专家所公认。本发明通过对大家白蚁以及台湾乳白蚁、印缅乳白蚁、塞庞乳白蚁、婆罗乳白蚁等近缘种的rDNA-ITS比较研究，设计特异性的引物和TaqMan探针，通过对退火温度、引物和探针比例以及Mg^浓度等进行优化，建立了针对大家白蚁的常规PCR和实时荧光定量PCR检测体系，适用于白蚁的各个不同品级，克服了传统形态学检测的局限，实现了对大家白蚁的快速、准确、稳定鉴定。序列表SEQUENCELISTING<110>中华人民共和国珠海出入境检验检疫局<120>大家白蚁快速PCR检测方法<130><160>5<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature16<222>(1)..(21)<400>13gcacggacctgtccg^tgcc21<210〉2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(1)..(21)<400>2ccatcttcgggcccgcggcct21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(1)..(21)<400>3aggccgcgggcccgaagatgg21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<222>(1)..(22)<400>4ccgagatctctctcgtattttc22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—fea加re<222>(1)..(24)<400>5acgacagcactgtcttaatcttcg24<210>6<211>904<212>DNA<213>大家白蚁(C.curvignathusHollmgren)<400>6gtaggtgaacctgcggaaggatcattaacgctactgagacagaactgtgactctaccgag60ataatggtcgagatagaacgtgagggacgagacctcccgcctgcgggcgggtggcacgct120tcgcacgccgtcggcacctctgccggcaagcgggtgtttcagaactctccgcgtggcgtg180acgggcgtcagagctcccgaactcgaacgacttgaagccggtctcggctgcggcaggccg240tggtaccagccaggtttgaaggccctcaagggggtcgccaacggtcgcgccgctgattcg300agcggcgcctagaacgaagaagcgaggcccaatggccgtggggtgcggtctggcgtgacc360tccccagtggtcgcacgtcgcgtgcccacggcctgcttcgcggcaaagcacggacctgto420cgatgccgccacatggatggcgaatgaaacgcacaaccctgaacggtggatcacttggct480cgtgggtcgatgaagaacgcagcaaattgcgcgtcgacatgtgaactgcaggacacatga540acatcgacgtttcgaacgcacattgcggtccttggatttccaatcccggaccacgcctgg600ctgagggtcggccttctgaaaccactgggcccgccgcgtaaggccgcgggcccgaagatg660ggggcacgcgcgctcgtcctatccgggcgggtcgcgcgacgctctcgaagattaagacag720tgctgtcgtggctaaccgcgcccgccggcgcccggcttgagaggggaaggtcccgaattt780tgaacgacacagaagccgggcgcgagaaaatacgagagagatctcggtaagcgagggcac840cggcggaagtgccatgcacatgcgcgacacacacacactacatccgacctcagatcaggc900gaga90419权利要求1、一种大家白蚁快速PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20℃保存备用；(2)建立PCR反应体系取上游引物CC-F5、下游引物CC-R5、10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶和ddH2O，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述上游引物CC-F5和下游引物CC-R5核苷酸序列分别为上游引物CC-F55’-AGCACGGACCTGTCCGATGCC-3’下游引物CC-R55’-CCATCTTCGGGCCCGCGGCCT-3’；(3)进行PCR扩增，PCR反应条件是预变性94℃，5min；94℃变性1min，退火延伸72℃，1min，30个循环；最后72℃延伸5min；(4)rDNAITS区扩增完成后，取PCR反应产物及上样缓冲液在1.5％的琼脂糖TAE凝胶电泳分离，电泳后经EB染色，凝胶成像系统上观察记录和拍照。2、根据权利要求1所述的大家白蚁快速PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应体系的反应总体积为50^1，各成分组成如下5pl的10xPCR缓冲液、25mmol/mL的MgCl23(il、各10mmol/mL的dNTP混合物4|il、2|il的上游引物CC-F5、2(xl的下游引物CC-R5、2.5units的TaqDNA聚合酶，最后加ddH20补充至总体积为45^1，再加5|ilDNA悬浮液，而后进行PCR扩增。3、根据权利要求1所述的大家白蚁快速PCR检测方法，其特征在于所述上游引物CC-F5和下游引物CC-R5的使用浓度为0.10.5|imol/mL。4、根据权利要求2所述的大家白蚁快速PCR检测方法，其特征在于所述上游引物CC-F5和下游引物CC-R5的最佳使用浓度为0.2jimol/mL。5、根据权利要求1所述的大家白蚁快速PCR检测方法，其特征在于所述模板DNA的检测限度为lng/W，最适检测浓度为540ng/W。6、一种大家白蚁实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取待检样品，采用SDS法提取基因组DNA，制备模板DNA，-20°C保存备用；(2)建立PCR反应体系取上游引物CC-F6、下游引物CC-R8、引物探针CC-TZ-6、10xPCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶和ddH20，加入待检模板DNA，配成PCR反应体系；其中所述上游引物CC-F6、下游引物CC-R8和探针CC-TZ-6的核苷酸序列分别为上游引物CC-F6:5'-AGGCCGCGGGCCCGAAGATGG-3，下游引物CC-R8:5'-CCGAGATCTCTCTCGTATTTTC-3，引物探针CC-TZ-6:，5，隱FAM-ACGACAGCACTGTCTTAATCTTCG画TAMRA-3，，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；(3)进行PCR扩增，PCR反应条件是预变性94匸，lmin;94'C变性15s，60。C退火延伸lmin，45个循环；(4)荧光PCR仪读取Ct值判断检测的结果。7、根据权利要求6所述的大家白蚁实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应体系的反应总体积为20|11，各成分组成如下2|11的10xPCR缓冲液、25mmol/mL的MgCl22^1、各10mmol/mL的dNTP混合物1.6(^1、0.5^1的上游引物CC-F6、0.5|il的下游引物CC-R8、0.25^1的引物探针CC-TZ-TaqDNA聚合酶0.5U、模板DNA2)al，加ddH20至最终体积。8、根据权利要求6所述的大家白蚁实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述上游引物CC-F6和下游引物CC-R8的使用浓度为0.10.5|imol/mL，所述荧光探针CC-TZ-6的使用浓度为0.050.2pmol/mL。9、根据权利要求6所述的大家白蚁实时荧光PCR检测方法，其特征在于所述模板DNA的检测限度在0.1pg/pl。全文摘要本发明公开了一种对大家白蚁进行快速检测的PCR检测方法，包括常规PCR检测和实时荧光PCR检测，步骤包括待检样品DNA模板的制备，设计特异性引物和/或探针，建立PCR反应体系进行PCR扩增，凝胶成像系统上观察记录和拍照。本发明是一种快速、稳定可靠、灵敏度高的大家白蚁PCR检测方法，适用于大家白蚁不同品级样本的检测，为我国乳白蚁属在分子水平上的分类和近缘种的快速鉴定奠定了基础。研究结果可直接应用于进出境植物检疫中大家白蚁的检疫鉴定，这对保护我国农林业生产安全、维持生态平衡，保证公共卫生安全都有极为重要的意义。文档编号C12Q1/68GK101665828SQ20091004194公开日2010年3月10日申请日期2009年8月19日优先权日2009年8月19日发明者乐海洋,力廖,张卫东申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局