人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体及其构建方法

专利名称：人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及了一种双基因共表达重组载体及其构建方法，特别是涉及一种人Bcl-2和人VEGF165双基因共表达重组载体及其构建方法。属于生物基因治疗领域。
背景技术：
心肌梗死(Myocardium infarction , MI)是在冠状动脉病变基础上发生冠状动脉血供急剧减少或中断，造成相应的心肌严重而持久地缺血导致心肌坏死。心肌细胞是终末分化细胞，心肌损伤后不能通过细胞再生而修复，而是形成纤维化瘢痕。目前临床上对MI的治疗方法主要是药物治疗、冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路手术，这三大方法虽然能使部分病人闭塞的血管再通并恢复血流灌注， 一定程度上挽救濒死的心肌，减缓心肌重构和心衰进程，减轻患者症状，降低病死率。但由于这些疗法无法使梗死的心肌再生，使得远期预后仍不理想。心脏移植则由于存在供体缺乏、免疫排斥和费用昂贵等缺陷使其在临床上难以推广。因此，临床上需要一种新的治疗该疾病的有效手段。
基因治疗或对干细胞基因修饰后移植治疗是当今研究心肌梗死治疗方法的热点，已进入临床研究的是抗凋亡基因或促血管生成基因等单基因的治疗方法。中国发明专利CN200810302770.6中涉及一种重组双基因腺病毒载体，其特点是在一个载体上重组了两种不同的基因，虽然其在疗效方面效果要比用单基因治疗效果好，但是这两种基因分别是bFGF蛋白的基因和PDGF-B蛋白的基因，同属于促进血管生成的因子，其效果只能是在促进血管生成上增加，而且此专利是采用两个启动因子，容易产生两个启动子间相互抑制导致一条基因表达抑制另一条基因表达的弊端。
研究中发现，Bcl-2基因家族是目前已知的最重要的调控细胞凋亡的基因家族。Bcl-2基因及其编码的蛋白质能在不影响细胞周期和分化的情况下抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前发现的促血管生成作用最强的细胞因子。有研究表明，单独应用Bcl-2基因或VEGF基因对心肌梗死有明显的治疗效果，但仍不理想，有进一步提升的空间。在多数细胞中Bcl-2基因和VEGF基因之间存在着互相上调的级联关系，在生物学功能上能够形成协同作用。

发明内容
本发明的目的之一，是为了构建一种人Bc1-2和人VEGFi65双基因共表达重组载体，为联合基因治疗心肌梗死的研究奠定基础。
本发明的目的之二，是为了提供一种上述重组载体的构建方法。
本发明的目的之一，主要通过以下技术方案实现
人Bcl-2和人VEGFt65双基因共表达重组载体，其特征是所述重组载体包括人Bcl-2基因(hBcl-2)和人VEGF啦基因(hVEGF165);
其中，hBcl-2基因序列如序列表SEQ IDN2: 1所述；hVEGF啦基因序列如序列表SEQ IDNs: 2所述；利用IRES片段连接hBcl-2、 hVEGF股基因，以AdEasy系统为基础利用细菌内同源重组机制重组构建本发明hBcl-2和hVEGF^双基因共表达重组载体。
本发明所用载体是腺病毒载体，腺病毒载体宿主范围广、转染效率和基因表达水平高、安全性较好，是基因治疗的优良载体，是心肌梗死基因治疗较为理想的载体。也可以使用其他腺相关病毒、慢病毒和质粒等其他载体。
本发明的目的之二，主要通过以下技术方案实现
人Bcl-2和人VEGF啦双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是主要包括以
下几个步骤
1)获得hBcl-2、 hVEGF!65基因；(2)构建重组腺病毒穿梭载体pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165; (3)重组构建携带hBcl-2基因、IRES片段和hVEGF!65的腺病毒载体质粒pAd-Easy -CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165; (4)脂质体
转染法介导重组腺病毒载体质粒在HEK293细胞中的包装。
本发明的目的之二，还可以通过以下技术方案实现
本发明的目的之二的一种实施方案是步骤l)可以通过RT-PCR获得hBcl-2、hVEGF!65基因；根据Genebank中基因序列设计合成扩增hBcl-2和hVEGF^5的PCR引物；
其中扩增hBcl-2的PCR弓1物序列是
正向5 ， GAAGATCTATGGCGCACGCTGGGAGAA弓I入BglII位点，反向5 ， ACGCGTCGACTC ACTTGTGGCTBC AGATAGGCACC弓|入SalI位点；扩增hVEGF!65的PCR引物序列是
正向5，GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC引入XbaI位点，反向 5 ， CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC AT弓|入EcoRV位点。
本发明的目的之二的一种实施方案是步骤(2)主要包括将人Bcl-2基因、IRES 片段和人VEGFi65依次定向装载入腺病毒穿梭载体质粒。
本发明的目的之二的一种实施方案是步骤(3)是以AdEasy系统为基础，将 线性化去磷酸化的重组穿梭载体质粒pAd-Track-CMV-hBd-2-IRES-hVEGF165与骨架 质粒pAd-Easy-l利用细菌内同源重组机制重组。
本发明具有的有益效果如下
1、 本发明将具有抗凋亡能力的Bcl-2基因和目前促血管生成作用最强的细胞因 子VEGF!65基因重组在同一载体上共表达，在解决了移植细胞在低氧、炎症的条件 下生存率低的问题的同时发挥VEGF165的促血管生成作用，并利用Bcl-2和VEGF165 的相互上调作用，使单一作用效应放大，两者在生物学功能上形成协同效应，进而 促进心梗后心脏的血管再生、心肌细胞修复，加快心功能的恢复。本发明将在心肌 梗死的基因治疗和细胞移植研究领域发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
2、 本发明是在同一载体上搭载抗调亡基因Bcl-2和促血管生成基因VEGF165， 通过IRES片段的连接来实现两个基因的共表达。本发明利用IRES片段连接hBd-2、 hVEGF165基因实现双基因共表达，避免了应用双启动子存在启动子间相互抑制的现 象可能导致的基因表达抑制的弊端。 '


图l为腺病毒载体构建示意图。 图2为腺病毒穿梭载体质粒图谱。
图3为hBcl-2和hVEGF!65的PCR产物电泳图。图中，M: DL2000; 1: 734bp的hBcl-2 片段；2: 595bp的hVEGFw5片段。
图4为pMD19T-hBcl-2质粒酶切鉴定图。图中，M: DL2000; 1: pMD19T-hBcl-2质 粒BglII、 SaJI双酶切产物。
图5为pMD19T-hBcl-2质粒基因测序图。
图6为pMD19T-hVEGF!65质粒酶切鉴定图。图中，M: DL2000; 1: pMD19T- hVEGF165 质ftXbal、 EcoRV双酶切产物。
图7为pMD19T-hVEGFw5质粒基因测序图。
图8为穿梭载体质粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGFw5酶切鉴定图。图中， M: DL15000 marker h BglIIXSalI双酶切得到722bp的片段；2- Xbal疋coRV双酶切得到584bp的 片段；3: XhoIVXbal双酶切641bp的片段；4: BgimEcoRV双酶切得到2Kb左右的片段。图9为重组腺病毒载体质粒的酶切鉴定图。图中，M: lkb ladder Marker; h重组 腺病毒载体质粒PacI单酶切产物。
图10为重组腺病毒DNA的PCR鉴定。图中，M: DL2000; 1: 584bp的hVEGF^片段; 2 : 734bp的hBcl-2片段。
图ll腺病毒包装扩增过程中HEK293细胞形态变化和同视野GFP的表达。图中， A:转染后2小时的HEK293 (x100)B:转染后2小时GFP的表达(x100)
C:转染后第3天的HEK293细胞(x100)D:转染后第3天GFP的表达(x100)
E:第二轮扩增第7天的HEK293细胞(xl00)F:第二轮扩增第7天GFP的表达(x100)
G:第二轮扩增第10天的HEK293细胞(x200) H:第二轮扩增第10天GFP的表达(x200)
具体实施例方式
以下通过实施例来描述本发明，应该指出的是，所列举的实施例不应理解为对 本发明的限制。
具体实施例l
图1 11构成本发明的具体实施例1。
人Bcl-2和人VEGFi65双基因共表达重组载体，包括人Bcl-2基因和人VEGFi65基因； 其中，人Bcl-2基因序列如序列表SEQ IDNs: 1所述；人VEGFw5基因序列如序列表 SEQ IDN2: 2所述；所述载体是腺病毒载体，也可以使用其他腺相关病毒、慢病毒 和质粒等其他载体。
所述人Bcl-2和人VEGF^双基因共表达重组腺病毒载体的构建过程如图1所示，
其构建方法具体如下
1、主要实验试剂与设备
生化试剂DNAMarker(日本Takara),胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉(日本 Oxoid)，琼脂糖(西班牙Biowest)，卡那霉素、氨节青霉素(美国Amresco) Trizol 试剂(美国Invitrogen)。
工具酶和试剂盒逆转录反应试剂盒、Lipofectamine2000 (美国Invitrogen)、 质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒(德国Qiagen)，去内毒素中量质粒提取试剂盒(德 国MN) ， PCR引物、LATaq酶试剂盒、pMD19T载体试剂盒(日本Takara) ， T4连 接酶、碱性磷酸酶及限制性内切酶BglII、 Sall、 Xbal、 EcoRV、 Xhol、 Xbal、 Pacl、 Pmel (美国NEB) ， DMEM细胞培养液、Opti-MEM细胞培养液、胎牛血清(美国 GIBCO),腺病毒沉淀法纯化试剂盒(美国GENMED)。
质粒、菌株和细胞株A549肺癌细胞株、pIRES质粒、AdEasy系统 (pAd-Track-CMV质粒、含pAd-Easy-l质粒的大肠杆菌BJ5183、 HEK293细胞)、大肠 杆菌DH5d(广州医学院实验医学研究中心保存)。
主要仪器与设备FORMA3111水套C02培养箱(美国Thermo)、实时荧光定 量PCR仪(美国Bio-md)、超净工作台(苏州净化设备厂)、倒置式荧光生物显微镜(德国Leica)、凝胶成像系统(美国Bio-rad)、核酸蛋白定量仪(美国NanoDrop)、 振荡培养箱(美国Thermo)、多功能细胞电穿孔仪(德国Eppendorf)。
2、实验内容
2.1hBcl-2、 hVEGF貼基因的获得
2丄1复苏、培养、传代A549细胞
取出液氮中保存的A549细胞，迅速放入37。C的恒温水浴中，并剧烈摇晃，使其 尽快融化，超净工作台内将细胞液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，用含 10。/。FBS的DMEM培养液重悬浮，并转移至T-25细胞培养瓶中，补充培养液至5 mL， 置37。C、 5。/。C02细胞培养箱中培养，次日更换培养液，继续培养，观察生长情况。 待细胞长至丰度约80%时弃去旧培液，加入l mL37。C预热的胰蛋白酶消化液(0.25X) 消化细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，待大部分细胞变圆、细胞之间不再连接成 片时倒去消化液，加入新鲜的培养液，用滴管将细胞吹打成单细胞悬液，按1:3比例 接种传代，继续培养。
2.1.2提取A549细胞的总RNA
将实验用的玻璃器皿、EP管、枪头经0.in/。DEPC浸泡过夜灭活RNA酶，并高 压灭菌。挑选生长状态良好，丰度约80%的细胞，按Trizol试剂说明书进行首先 弃去细胞培养液，加入lmLTrizol试剂铺盖细胞，反复摇动至细胞脱落后，移至1.5 mL的EP管中，室温温育5min。加入0.2mL氯仿，振荡15 s，静置2min。 4°C离 心，12000 gxl5min，取上清，将无色水相轻轻吸出转移至另一 EP管中。力卩入0.5 mL 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 4。C离心，12000 gx10 min，可见 少许絮状沉淀，弃上清。加入lmL75。/。乙醇，颠摇混匀，轻轻洗涤沉淀。4。C离心， 7500gx5min，弃上清。晾干，加入25 pl的DEPC水溶解。取5pl琼脂糖凝胶电泳 鉴定RNA完整性。核酸蛋白定量仪定量。其余即刻保存于-80。C冰箱。
2.1.3逆转录反应获得cDNA
按M-MLV逆转录反应试剂盒说明书进行，20 pl反应体系
将以下4种试剂加入去RNA酶的PCR管中
。ligo(dT)(500叱/mL) 1 pl
总RNA 2 pl
10mMdNTPMix 1^1
8将混合物65°C加热5 min，然后快速移至冰上，将PCR管简单离心
往PCR管中加3种试剂
5 x First-strand Buffer 4 pi
0.1 M DTT 2^1
40 U/pl Rnase inhibitor 1 pi
轻轻摇匀离心管后37°C放置2 min，往管中加入M-MLV RT 1 pi (200 U),轻轻 摇匀，置PCR仪上37°C孵育50 min， 70°C、 15 min，所得到的cDNA置-20°C保 存作为下一步PCR的模板。
2.1.4 PCR获得hBcl-2和hVEGF165基因
根据Genebank中基因序列设计合成扩增hBcl-2和hVEGF!65的PCR引物，序列分 别为hBcl隱2:正向5 ， GAAGATCTATGGCGC ACGCTGGGAGAA弓|入BglII位点， 反向5'ACGCGTCGACTCACTTGTGGCTBCAGATAGGCACC弓i入Sail位点； hVEGF165:正向5'GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC弓|入XbaI位 点，反向5，CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCACAT弓I入EcoRV位点。
按下列组份配制PCR反应液，50^1反应体系 TaKaRaLATaq (5，) 1 OxLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus ) dNTP Mixture (各2.5mM) 模板cDNA 上游引物 (20 pM) 下游引物(20 nM) 灭菌蒸馏水
反应条件
94。C 3 min
94°C 30 s
58°C (hBcl-2)， 55°C (hVEGF165) 30 s 35个循环
72。C 1 min
72°C 10 min
Store at 4°C
0.5 jxl 5^1 8 pi 0.5 pi 1 pi 1 nl 34 pi取10^1PCR产物行琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶的2%琼脂糖)检测。检测结果 如图3所示，PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见734bp的hBcl-2片段和595bp的hVEGF!65片段。
2.1.5从PCR产物中回收纯化DNA片段
应用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收纯化PCR产物将40 pi PCR产物 全部进行琼脂糖凝胶电泳(2%琼脂糖)，紫外分析仪下用干净锋利的手术刀片切下 含待回收DNA条带的凝胶，置1.5mL无色EP管中，称重。加入Buffer QG (按每 100 mg凝胶加Buffer QG 300 pi)，置50°C水浴10 min;检査所加Buffer与溶解物 颜色，黄色即完全溶解；将柱子放在2mL收集管上，将上述溶液加于柱上。4°C离 心13000 gxl min;弃去收集管中液体，将吸附柱重新放入收集管中。加入500 pi Buffer QG于柱上，4°C离心13000 gxl min，弃去收集管中液体。加入750 Buffer PE于 柱上，4。C离心13000gxl min，弃去收集管中液体。4°C离心13000gxl min,弃去 收集管。将柱放于一新1.5mLEP管中，加50^1 buffer EB于柱上。放置1 min， 4°C 离心13000 gxl min，此EP管中液体即为回收的DNA片段。取5 pi回收的DNA电 泳检测，核酸蛋白定量仪定量。
2.1.6氯化钙法制备感受态大肠杆菌DH5a
a. 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5cc，在LB培养基平板表面划线，于37°C
培养16 h;
b. 挑取一个单菌落，接种到5mL无抗生素的LB培养基中，于37°C、 200 rpm 振荡培养5 h;
c. 培养液全部转到100 mL LB培养基中培养2 h-3 h，到OD6W=0.3 0.4;
d. 将培养液转入1.5mL离心管中，在冰上放置15—30min;
e. 4。C离心，4000 rpmx5 min，弃上清；
f. 加入0.8 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液悬浮沉淀，冰上预冷10 min;
g. 4。C离心，4000 rpmx5 min，弃上清；
h. 加入0.2 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液悬浮沉淀，加入预冷的甘油使总体 积为15%，分装100 pl/管置于一70。C长期保存。
2.1.7 pMD19T-hBcl-2质粒、pMD19T- hVEGF16S质粒的获得
按Takara pMD19T simple vector试剂盒说明书进行在微量离心管中配制下列 DNA溶液，全量为5 j^l: 10pMD19-T Simple Vector DNA ( hBcl國2或hVEGF!6s) 灭菌双蒸水
1 pi
0.1 pmol up to 5 pi
加入5 pi的SolutionI液，16。C反应30min，全量(IO pl)加入至感受态E. coliDH5a (使用前中在冰中解冻)中，冰中放置30min， 42。C孵育45 s后，再在冰中放置l min, 加入890plLB培养基，37。C振荡培养60 min,取100pl涂布在含有氨苄青霉素的LB 培养基平板，37。C倒置培养16h，形成白色的单菌落。挑选8个白色菌落分别接种于 2mL含氨苄青霉素的LB培养基，37°C、 200 rpm振荡培养12h，可见液体变浑浊。
2.1.8 pMD19T- hBcl-2质粒、pMD19T- hVEGFi65质粒的菌落PCR鉴定和测序鉴定
取50pl菌液1000rpm离心l min，弃上清，加入30 pl双蒸水，煮沸10min， 1000 rpm离心lmin，取2 pl上清为模板行PCR，反应体系及反应条件同前。将菌落PCR鉴 定阳性的菌液送大连宝生物工程有限公司测序，测序引物为M13。
用BglII、 SalI双酶切pMD19T-hBcl-2质粒，琼脂糖凝胶电泳见722bp和2.6Kb 的特定酶切产物(如图4)，基因测序结果(如图5)通过BLAST比对与Genebank 中的hBcl-2序列gill61277340l完全相同。pMD19T-hVEGF165质粒经Xbal、 EcoRV 双酶切，琼脂糖凝胶电泳见584bp和2.6Kb的特定酶切产物(如图6)，基因测序结 果(如图7)通过BLAST比对与Genebank中的hVEGF!65序列别19909064|完全相 同。
2.2重组腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165的构建 2.2.1 pMD19T-hBcl-2、 pMD19T隱hVEGF165、 pAd-Track誦CMV三种质粒的提取 按QIAprep Spin Miniprep Kit说明书进行
a. 取5 nl甘油保存的测序正确的pMD19T-hBcl-2质粒、pMD19T- hVEGF165 质粒菌液按l: IOOO体积比例接种于含氨苄青霉素的LB培养基；AdEasy系 统(pAd-Track-CMV)质粒接种于含卡那霉素的LB培养基，37°C振荡培养 过夜；
b. 室温下将菌液10000 rpmx3 min离心，吸掉LB培养基；
c. 加入250^1 PI液重悬浮，吹打至不能见有细菌团块，然后转移入EP管；
d. 加入250 nlP2液，倒置摇晃4-6次(不可震荡)，至完全混合，为蓝色；
e. 加入350 ^1N3液，马上倒置摇晃4-6次，至为白色；
11f. 13000 rpmxlO min离心，将上清吸至柱子，13000 rpmx 60 s离心，弃废液；g. 加入500 plPB液，然后13000 rpmx 60s离心；h. 加入750 nl PE液，13000卬mx 60s离心，弃废液，再离心一次去除剩余洗液；i. 置一干净的EP管于柱子下面，加入50plEB液至柱子中间，静置lmin，离 心lmin，分别得到三种质粒，并用核酸蛋白定量仪定量。2.2.2重组pAd-Track-CMV-hBcl-2质粒分别将pAd-Track-CMV、 pMD19T-hBcl-2用BglII、 Sail双酶切，50 pl酶切体系pAd-Tmck-CMV 2吗 或pMD19T-hBcl-2BglII 1 plSail 1 pl10xNEB缓冲液3 5 nl100xBSA 0.5 pl灭菌双蒸水 至50 pl37。C酶切过夜，取5pl酶切产物琼脂糖凝胶电泳凝胶鉴定，确定酶切正确后用 QIAquick Gel Extraction Kit回收9205bp的切开的pAd-Tmck-CMV质粒片段和 726bp的hBcl-2基因片段，并用核酸蛋白定量仪定量。按pAd-Track-CMV和hBcl-2的摩尔数比为1: 10的比例建立20 ^连接体系， 使用T4DNA连接酶16°C连接过夜。连接产物全量加入感受态E. coliDH5a (使用前 中在冰中解冻)中，冰中放置30min， 42。C加热45s后，再在冰中放置1 min，加 入890 pi LB培养基，37°C振荡培养60 min。取100 pl涂布在卡那霉素LB培养基平 板，37。C倒置培养16 h，形成白色的单菌落，挑选8个白色菌落分别接种于2 mL 含卡那霉素的LB培养基，37°C 、 200 rpm摇菌12 h，可见LB变浑浊，行hBcl-2 的菌落PCR鉴定(方法同前)。将PCR阳性的用质粒小提试剂盒提取质粒，用BglII、 Sall双酶切鉴定，并用核酸蛋白定量仪定量。2.2.3重组pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF脇质粒分别将pAd-Track-CMV-hBcl-2、 pMD19T- hVEGF165质粒用Xbal、 EcoRV双酶 切，50pl酶切体系pAd國Track國CMV-hBcl-2 2 ug(或pMD19T隱跳GFi65)Xbal 1 piEcoRV 1 pl10xNEB缓冲液2 5^1100xBSA 0.5 pl灭菌双蒸水 至50 ^37°C酶切过夜，取5 ^酶切产物琼脂糖电泳凝胶鉴定，确定酶切正确后用QIAquickTM Gel Extraction Kit回收9925bp的切开pAd-Track-CMV-hBcl-2质粒片段和584bp的 hVEGFw基因片段，并用核酸蛋白定量仪定量。按pAd-Track-CMV-hBcl-2和hVEGF165的摩尔数比为1:10的比例建立20 pi连 接体系，使用T4DNA连接酶16°C连接过夜。将连接产物全量转化感受态E. coliDH5a，涂布在卡那霉素LB培养基平板，培养后挑选8个白色菌落，接种于含卡 那霉素的LB培养基，行hVEGFw菌落PCR鉴定(方法同前)。将PCR阳性的用 质粒小提试剂盒提取质粒，Xbal、 EcoRV双酶切鉴定，并用核酸蛋白定量仪定量。2.2.4重组pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF貼质粒分别将pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165 、 pIRES质粒用Xhol、 Xbal双酶切，酶切体系pAd隱Track-CMV- hBcl-2-hVEGF165 2吗 (或pIRES)Xhol 1 nlXbal 1 nl10xNEB缓冲液2 5 pi腦xBSA 0.5 pi灭菌双蒸水 至50 fil37°C酶切过夜，取5 ^酶切产物琼脂糖电泳凝胶鉴定，确定酶切正确后用 QIAquick Gel Extraction Kit回收10507bp的切开pAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165 质粒片段和641bp的IRES片段，用核酸蛋白定量仪定量。按PAd-Track-CMV-hBcl-2-hVEGF165和IRES的摩尔数比为1:10的比例建立20 ^连接体系，使用T4 DNA连接酶16°C连接过夜。将连接产物全量转化感受态E. coliDH5a，涂布在卡那霉素LB培养基平板，培养后挑选8个白色菌落，接种于含卡 那霉素的LB培养基，行菌落PCR鉴定(引物为hBcl-2上游和hVEGF!65下游)。13将PCR阳性的用质粒小提试剂盒提取质粒，Xhol、 Xbal双酶切鉴定，并用核酸蛋白 定量仪定量。2.2.5重组穿梭载体质粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF16S的酶切鉴定重组穿梭载体质粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165经BglII\SalI 、 XbaI\EcoRV、 XhoI\XbaI、 BglII\EcoRV四种组合的双酶切鉴定分析。结果如图8所 示，琼脂糖凝胶电泳见与质粒图谱相符的条带。2.3重组腺病毒载体质粒的构建和鉴定2.3.1含有骨架质粒pAd-Easy-1的BJ5183电穿孔感受态细菌的制备在含氨苄青霉素LB平板上划线培养BJ5183 (含有pAd-Easy-1质粒)。挑取单 个菌落接种3mLLB液体培养基，37°C、 200rpm振荡培养过夜。次日，将过夜培养 物按2%体积接种100 mL LB液体培养基，37°C， 200 rpm振荡培养，至OD600=0.4 0.6。将培养物冰浴30min， 4000 rpm离心10 min收获菌体。弃去所有上清，用等体 积、冰浴冷的WB溶液(WB^O。/。甘油，90%双蒸水，高压灭菌)重悬细菌，4°C、 4000 卬m，离心30min。重复上一步骤2次。弃去大部分WB，使剩余体积为原始培养物 的0.5%)，重悬，即制备得到含pAd-Easy-l的BJ5183电转化感受态细胞。每管分装 50pl， -80。C冻存备用。2.3.2线性化去磷酸化重组穿梭载体质粒将重组穿梭载体质粒用Pmd单酶切线性化，50 pl酶切体系 pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF1652昭 10xNEB缓冲液4 訓xBSA Pmel灭菌双蒸水37°C酶切过夜，将酶切产物用CIAP酶去磷酸化， 酶切产物 10xCIAP buffer C1AP5^1 0.5 pi 1 pl至50 nl50 Hl反应体系:43 pl 2^150。C反应30min,苯酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)抽取两次，氯仿/异戊醇(24: 1) 抽取一次，添加5pl的3M的NaOAC，添加125 pl (2.5倍)的冷乙醇，在-20。C下保 冷lh，离心分离回收沉淀，用200^70%的冷乙醇洗净，干燥后用20nl的灭菌蒸馏水溶解。用相同方法制备线性化的不带治疗基因的穿梭载体质pAd-Track-CMV-GFP。2.3.3穿梭载体质粒与骨架质粒的细菌内同源重组取出一管储于-80。C的电穿孔感受态BJ5183在冰上融化。取0.4pg线性化去磷酸 化的穿梭载体质粒在1700V、 5ms条件下电穿孔转化，加入卯Opl不含抗生素的LB 培养基，37。C摇菌lh后接种含50mg/L卡那霉素的LB平板，放置于37。C孵育24 h。挑 选体积最小的十个白色菌落，接种于5mL含卡那霉素LB培养基，37。C摇菌过夜。菌 落PCR初筛(方法同前)。质粒小提试剂盒提取PCR阳性菌液的质粒，测浓度。将候 选的阳性质粒用PacI初步酶切鉴定，20 nl酶切体系质粒 1吗10xNEB缓冲液4 2 ^100xBSA 0.2 piPacl 0.5 (al灭菌双蒸水 至20 ^将全量酶切产物琼脂糖凝胶电泳观察。将阳性质粒用氯化钙法转化感受态E.coUDH5a 扩增(方法同前)。用去内毒素中量质粒提取试剂盒提取质粒，根据说明书进行a. 取白色菌落，接种于5mL的氨苄抗性LB培养基，37°C、 300 rpm振荡培养8 h;b. 取2mL菌液按h 100比例接种于200mL的氨苄抗性LB培养基，37。C、 300rpm 振荡培养16h;c. 紫外分光光度计测菌液OD值，通过V[mlh800/OD60()计算最适体积；d. 4。C、 6000gxl5min离心，弃上清；e. 6 mL RES-EF buffer重悬浮，用移液器吹匀；f. 加入16mLLYS-EF，轻柔摇晃5次，室温放置5 min;g. 取出树脂过滤柱，15mLEQU-EFbuffer湿润柱子；h. 加入16mLNEU-EF buffer,立即轻柔颠倒10次，摇匀，冰上放置5 min;i. 混合液倒进过滤柱，液体随重力流尽，5mLFIL-EFbuffer清洗柱子，流尽后 向过滤柱添加35 mL ENDO-EF buffer清洗，流尽后添加15 mL WASH-EF buffer;j.流尽后添加5 mL ELU-EF buffer溶解质粒DNA，用15 mL的离心管收集；15k.加入3.5 mL的异丙醇沉淀质粒DNA，充分混合后放置2 min， 4。C离心6000 gx30 min;1.加入2mL的70"/。乙醇清洗沉淀，室温下离心6000 gx5 min,移液器小心吸尽上 清，室温干燥15min;m. 100nl去内毒素水重溶沉淀，进一步PacI酶切鉴定；经PacI酶切后琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约30Kb的大片段和一条约4.5Kb的 小片段(如图9)，提示穿梭载体质粒和骨架质粒pAd-Easy-l在右臂与左臂区发生重 组，重组腺病毒载体质粒构建成功。得到重组腺病毒载体质粒(pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF165质粒)，利用核酸 蛋白定量仪定量。用相同方法制备不携带治疗基因的对照腺病毒载体质粒 pAd-Easy-GFP。2.4重组腺病毒载体质粒在HEK293细胞中的包装2.4.1转染前pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF貼质粒的准备Pacl酶切质粒，50nl酶切体系pAd-Easy-hBcl-2-IRES-hVEGF165 3吗10xNEB缓冲液4 5 nl100xBSA 0.5 plPacl 2 nl灭菌双蒸水 至50 pi37。C酶切过夜，取lnl稀释5倍后琼脂糖凝胶电泳确定酶切是否完全，乙醇沉 淀法纯化线性化的质粒(方法同前)，重溶于20pl灭菌双蒸水。2.4.2包装细胞HEK293细胞的准备取出液氮中保存的HEK293细胞，迅速放入37。C的恒温水浴中，并剧烈摇晃， 使其尽快融化，超净工作台内将细胞液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min， 细胞培养液重悬浮，并转移至T-25细胞培养瓶中，补充培养液至5mL，置37°C、 5%C02细胞培养箱中培养，次日更换培养液，继续培养，观察生长情况。待细胞长 至丰度约80%时弃去旧培液，加入0.5 mL 37°C预热的胰蛋白酶消化液(0.25%)消化 细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，待大部分细胞变圆、细胞之间不再连接成片时 倒去消化液，加入新鲜的培养液，用滴管将已经消化细胞吹打成单细胞悬液，按l: 3比例接种传代，培养至有数瓶细胞，挑选状态好、融合度为50%-70%的细胞准备转染。
转染3天后在显微镜下观察细胞形态未有明显变化，荧光显微镜观察到散在的 GFP表达，此后可见GFP有扩散趋势；第二轮扩增的第7天可见大部分细胞变圆、 飘起、透光度增加等典型的CPE改变；第IO天几乎全部细胞飘起、葡萄串样的CPE 改变(如图11)。
2.4.3脂质体转染HEK293细胞，观察荧光的表达和细胞状况 按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染
a. 将3吗线性化的质粒和15^1脂质体混合于500 )al的Opti-MEMI培养基， 混合物室温下放置30min;
b. 等待的时候在超净工作台内弃去HEK293细胞的培养液，加入4 mL的无血 清DMEM培养液洗净残余的血清，吸去DMEM，添加2.5 mL Opti-MEMI 培养液，37°C、 5%<:02培养箱中放置10min;
c. 将混合物加入细胞培养瓶中，37°C、 5%(302培养箱中培养；
d. 6h后添加8mL的无血清的DMEM培养液。
转染后每天观察细胞变化，10d-20d后用无菌细胞刮子刮下细胞，转移至15mL 离心管，4。C离心500 gx10 min，留下2mL上清，移液器吹打重悬浮细胞，-80°C 放置30 min， 37°C迅速融解，反复冻融四次裂解细胞以释放病毒，4°C离心500 gx10 min去除细胞碎片，将上清-20。C保存。取一半体积的腺病毒接种于长至90%融合度 的HEK293细胞，用含2%血清的DMEM培养液继续培养，每日观察GFP和细胞病 变效应(cytopathic effect, CPE):即细胞变圆、透亮度增加、飘起、呈葡萄串状等。 如培养7 d后未出现CPE则按上述办法收获病毒继续接种于HEK293细胞。如仍未 出现CPE，则重新进行转染。
2.4.4获取重组腺病毒载体
继续接种病毒原液于HEK293细胞直至3 d内能出现明显CPE，收获细胞，取 10%混合液反复冻融用于继续接种扩增病毒，其余则保存于-80。C作为原代重组腺病 毒载体备用。以相同方法制备对照腺病毒Ad-GFP。
2.4.5重组腺病毒载体DNA的PCR鉴定
分别取重组腺病毒载体Ad-hBcl-2-hVEGF165上清50 jxl于EP管中，加入20 mg/mL蛋白酶K 2 pl ，置于56°C反应1 h ，沸水浴10 min，离心13000 rpmx10 min
17后，取2 pl为DNA模板行hBcl-2和hVEGF165的PCR反应(引物、反应体系和反应 条件同前)，以Ad-GFP病毒上清为阴性对照。
成功提取重组腺病毒的DNA，以其为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见 734bp的hBcl-2片段和595bp的hVEGF^片段(图11)，证明重组腺病毒的DNA 中带有hBcl-2序列和hVEGF165序列。
2.5重组腺病毒载体的扩增和纯化
按照GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒说明书进行
a. 将HEK293细胞接种于5个T-75的细胞培养瓶培养，直至达到90%的细胞融 合时倒去培养液，并用无血清的DMEM洗去残存的血清；
b. 取一管保存的病毒原液分5份加入5瓶HEK293细胞，十字形缓慢摇晃培养 瓶使病毒原液分布均匀，37°C、 5MC02培养箱中培养2h，每个培养瓶再加 入15 mL含2%血清的DMEM培养液后继续培养；
c. 感染后72 h或直至出现CPE和50%的细胞脱落时用无菌细胞刮子刮下所有 培养瓶的细胞，连同培养液合并转移至50mL离心管，4°C离心500 gx10 miii， 小心弃去上清；
d. 加入1 mL GENMED裂解液，涡旋振荡30 s，室温下放置5 min;
e. 加入100 ^ GENMED沉淀液，涡旋振荡60 s，移取500 nl混合液到GENMED 过滤柱；
f. 4°C离心500 gx2 min，弃去过滤柱；
g. 继续移取剩余的500 pi混合液到新的过滤柱，4°C离心500 gx2 min，弃去过 滤柱；
h. 分别加入100 ^ GENMED保存液，混匀，-80°<:冰箱保存。
2.5重组腺病毒载体的滴度测定
将HEK293细胞接种于96孔培养板中，用含10%FBS的DMEM培养至细胞融 合度为80%;将待测腺病毒原液用维持液(含2。/。FBS的DMEM)作1: IO倍比稀 释；弃去96孔板中的培养液，接种稀释好的病毒液，每个稀释度接种6个孔，100^1/ 孔；置于37。C、 5。/。C02培养箱培养24h;在荧光显微镜下计数每个孔中的荧光数， 一个发光的细胞为一个表达单位，按下列公式计算病毒滴度病毒滴度(pfWmL) =GFP阳性细胞数x病毒稀释倍数/0.1 mL。
经四轮扩增和最终纯化后重组腺病毒载体滴度为5xl09pfWmL。< 110〉广州医学院第二附属医院
<120〉人Bcl-2和人VEGFI65双基因共表达重组载体及其构建方法
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〈212〉薩
〈213〉人工序列
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<223〉人Bcl-2基因，利用该基因和人VEGF^基因共表达构建重组腺病毒载体，应
用在心肌梗死的基因治疗和细胞移植研究领域。
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〈223〉人VEGF，65基因，利用该基因和人Bcl-2基因共表达构建重组腺病毒载体，应 用在心肌梗死的基因治疗和细胞移植研究领域。
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gaacgtacttgc卿tgtgacaagccgaggcggtga 57权利要求
1、人Bcl-2和人VEGF165双基因共表达重组载体，其特征是所述重组载体包括人Bcl-2基因和人VEGF165基因，其中Bcl-2基因序列如序列表SEQ ID№1所述；VEGF165基因序列如序列表SEQ ID№2所述。
2、 根据权利要求l所述的重组人Bc卜2和人VEGF165双基因共表达重组载体，其特征是所述重组载体利用IRES片段连接人Bcl-2、人VEGFw5基因。
3、 根据权利要求l所述的重组人Bcl-2和人VEGF165双基因共表达重组载体，其特征是所述载体是腺病毒载体。
4、 人Bcl-2和人VEGFw5双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是包括以下几个歩骤1) 获得人Bcl-2、人VEGFw5基因；2) 构建重组腺病毒穿梭载体pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGFw5;3) 构建携带人Bcl-2基因、IRES片段和人VEGF165的重组腺病毒载体质粒pAd-Easy-hBc1-2-IRES-hVEGF165;4) 脂质体转染法介导重组腺病毒载体质粒在HEK293细胞中的包装。
5、 根据权利要求4所述的人Bcl-2和人VEGFi65双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是通过RT-PCR获得人Bcl-2、人VEGFw5基因。
6、 根据权利要求5所述的人Bcl-2和人VEGFw5双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是根据Genebank中基因序列设计合成扩增hBcl-2和hVEGFw5的PCR引物；其中扩增hBcl-2的PCR弓l物序列是正向5，GAAGATCTATGGCGCACGCTGGGAGAA弓|入BglII位点，反向5 ， ACGCGTCGACTC ACTTGTGGCTBCAGATAGGCACC弓|入SalI位点；扩增hVEGF船的PCR引物序列是正向5 ， GCTCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC弓|入XbaI位点，反向5'CCGGATATCGCTCACCGCCTCGGCTTGTCACAT弓I入EcoRV位点。
7、 根据权利要求5所述的人Bcl-2和人VEGF^双基因共表达重组载体的构建方法，其特征是步骤(2)主要包括将人Bcl-2基因、IRES片段和人VEGF^依次定向装载入腺病毒穿梭载体质粒。
8、根据权利要求5所述的人Bcl-2和人VEGFi65双基因共表达重组载体的构 建方法，其特征是步骤(3)是以AdEasy系统为基础，将重组腺病毒穿梭载 体质粒pAd-Track-CMV-hBcl-2-IRES-hVEGF165与骨架质粒pAd-Easy-l利用细菌内同源重组机制重组构建。
全文摘要
本发明涉及一种人Bcl-2和人VEGF₁₆₅双基因共表达重组载体及其构建方法，其特征是利用IRES片段连接hBcl-2、hVEGF₁₆₅基因，以AdEasy系统为基础利用细菌内同源重组机制重组构建hBcl-2和hVEGF₁₆₅双基因共表达重组载体。本发明将具有抗凋亡能力的Bcl-2基因和目前促血管生成作用最强的细胞因子VEGF₁₆₅基因重组在同一载体上共表达，在解决了移植细胞在低氧、炎症的条件下生存率低的问题的同时发挥VEGF₁₆₅的促血管生成作用，本发明将在心肌梗死的基因治疗和细胞移植研究领域发挥重要作用，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/85GK101654685SQ20091004166
公开日2010年2月24日 申请日期2009年8月5日 优先权日2009年8月5日
发明者何晓青, 倪晓彬, 刘世明, 罗承锋, 陈敏生 申请人:广州医学院第二附属医院