专利名称：中药中龟源性成分的pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及中药的鉴定技术领域，特别是指一种中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，非常适合于深度加工型龟甲源性产品，尤其是针对因深 度加工而导致DNA含量极少、片段极短的龟甲胶，操作简单，可用于产品检验部门对市场假 冒伪劣的该种中草药的灵敏快速鉴定。
背景技术：
龟甲，即龟科动物乌龟(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲，属于传统名贵中药。 据最新版的中国药典记载，服用龟甲能够滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心。近些年来，随着生 物学水平的提高，龟甲的相关研究也不断深入。有研究表明，龟甲粉末及其提取物不仅能够 增强肝功能、缓解压力，还具有抗癌以及调节免疫抵抗力的功效。以龟甲为原料而制成的两 类产品龟苓膏和龟甲胶在整个中药市场上占据着重要的位置。据2005年版中国药典记载，龟甲胶是以龟甲为原料，经水煎煮、浓缩制成的固体 胶，性成、甘、凉，归肝、肾、心经。能够滋阴、养血、止血，主要用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝 酸软、血虚萎黄、崩漏带下等。长期服用龟甲胶还有利于增强机体自身调节，能够延年益寿， 也利于阴虚阳亢患者的身体康复。随着生活水平的不断提高，与阿胶类似，龟甲胶也成为人 们进补的首选之一。由于龟甲自身比较名贵，药用价值显著，并且龟肉也常常用于烹饪各类补品供人 们食用，近些年来对各种龟类的捕杀现象十分严重，甚至于某些龟类品种濒临灭绝。因此， 龟甲原料的供应非常有限，并且价格高昂，也直接影响到了龟甲胶的生产。在龟甲胶市场上 存在某些假冒伪劣产品，其制作原料并非龟甲，而是由其他动物杂皮、碎骨代替，包括猪皮、 牛皮，甚至病死动物之皮，脏皮、烂皮等。该类假冒伪劣产品一旦成形，无论外观、色泽、气味 都与正品龟甲胶及其相似，真伪难辨。服用这些伪品不仅没有任何疗效，还很可能对身体有 害，后果十分严重。对于龟甲或龟甲胶的真伪鉴别，研究人员也已做了大量尝试，包括基于光谱学 分析的方法，如衰减全反射-傅立叶变换红外光谱法(ATR-FTIR) (Paris C，Lecomte S， Coupry C.ATR-FTIR spectroscopy as a way to identify natural protein-based materials,tortoiseshell and horn, from their protein-based imitation, galalith. Spectrochim Acta A. 2005,62 :532_538)、拉曼光谱法(FT-Raman)等(Edwards HGM, Hunt DE,Sibley MG. FT-Raman spectroscopic study of keratotic materials :horn,hoof and tortoiseshell. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 1998,54A 745-757) UR 基于DNA分子标记的分析方法，包括利用线粒体DNA的细胞色素b基因(Hsieh HM, Huang LH, TsaiLC, Liu CL, Kuo YC, Hsiao CT, Linacre A, Lee JCI. Species identification of Kachugatecta using the cytochrome b gene. J Forensic Sci. 2006,51 :52_56)禾口 12S rRNA 基因等(Lo CF, Lin YR, Chang HC, Lin JH. Identification of turtle shell and its preparations byPCR-DNA sequencing method. J Food Drug Anal. 2006,14 153-158)。光谱学分析的方法在处理不同深加工程度样品时，需要对仪器的检测参数作出 相应的调整，操作比较繁琐，实用性较差。而已经报道的基于DNA水平的检测方法大多基 于线粒体DNA，拷贝数有限，比较适合于DNA保存比较完整，或者轻度破坏的样品的PCR检 测。然而对于龟甲胶这类经过高温高压长时间作用而导致DNA含量极少，片段极短的深加 工产品，这些方法也略显不足，有报道表明，利用基于12S rRNA基因的PCR方法无法鉴别 龟甲胶(Hsieh HM, Huang LH, Tsai LC, Liu CL, Kuo YC, Hsiao CT, Linacre A, Lee JCI. Species identification of Kachuga tecta using the cytochrome b gene. J Forensic Sci. 2006,51 52-56)。事实上，到目前为止，国内外都没有出现任何有效的、大家公认的、能 够用于龟甲胶真伪鉴别的方法。 SINE序列是在高等真核生物基因组中广泛存在的短分散重复序列，拷贝数极高， 其拷贝数远高于细胞器DNA (包括线粒体DNA、叶绿体DNA等)以及核糖体DNA，并且具有良 好的种属特异性，大小适中，能够用于某些物种的特异性鉴别。因其具有拷贝数高的特点， 该序列常常被用于微量DNA检测领域，例如古DNA研究、法医鉴定学研究等。Pol III/SINE序列是广泛存在于隐颈亚目(Cryptodira)动物基因组上的一类 SINE序列，属于高度重复序列，包括陆龟、海龟、鳖等。在不同的龟类种属间，该SINE序 列存在 9 种亚型，包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 以 及 CryIIE(Sasaki, Τ. , Takahashi, K. , Nikaido, Μ. , Miura, S. , Yasukawa, Y. andOkada, N. 2004. First application of the SINE (Short Interspersed Repetitive Element) method to infer phylogenetic relationships in reptiles -.an example from the turtlesuperfamiIy testudinoidea. Mol. Biol. Evo1. 21 :705_715.)。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种中药中龟源性成分 的PCR鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定龟源性产品的真 伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型龟甲胶的真 伪，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案一种中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特点是，包括下列步骤a)提取所述中药中的DNA ；b)用根据隐颈亚目基因组SINE序列设计的特异性引物对所述DNA进行PCR扩增， 获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如 果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自隐颈亚目动物，含有龟源性成分；如 果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自隐颈亚目动物，也不含有 任何龟源性成分。较佳地，在步骤a)中，所述中药是深度加工型中药。更佳地，所述深度加工型中药是深度加工型龟甲源性中药。更进一步地，所述深度加工型龟甲源性中药是因深度加工而导致DNA含量极少， 片段破坏极其严重的龟甲胶。
更佳地，采用消化液和蛋白酶预处理所述深度加工型中药，再采用针对短片段DNA 的抽提方法提取所述DNA。
较佳地，所述隐颈亚目基因组SINE序列是Pol III/SINE序列。更佳地，所述Pol III/SINE 序列包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 和 CryllE。更进一步地，所述特异性引物根据所述的CrylA、Cry IB, CrylC、CrylD、CryI ΙΑ, CryIIB、CryIIC、CryIID 和 CryIIE 的 5，同源区来设计的。尤其，所述特异性引物包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。较佳地，所述阳性扩增条带的长度在IOObp以下。采用本发明的方法，能够快速检测龟甲类中药的物种来源，从而分辨真伪，且由于 其采用基于种属特异性的SINE序列设计种属特异性引物，对所要鉴定的DNA样品进行PCR 扩增，因SINE序列是真核细胞基因组中存在的短分散重复序列，不同SINE在各个真核细胞 基因组中具有种属特异性的特点，大小适中，相对于rDNA，mtDNA而言，SINE最大的优势在 于其在基因组中拷贝数极高，基于SINE所建立的PCR检测方法更适用于DNA破坏严重的样 品，因此，尽管深度加工的龟甲类中药特别是由龟甲熬制而成的龟甲胶，其DNA含量极少， 破坏极其严重，但是，本发明的基于SINE序列的PCR检测方法完全能够达到检测目的，并 且本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测，操作简单、成本 低、灵敏快速、能有效鉴定深度加工型龟甲类产品的真伪。
图1是采用基于隐颈亚目动物SINE序列PolIII/SINE设计的种属特异性引物进 行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测各种肉源性成分中的龟源性成分。其中M. DNA Marker, 1.龟肉基因组DNA，2.驴肉基因组DNA，3.马肉基因组DNA，4.牛肉基因组DNA，5.猪 肉基因组DNA，6.空白对照。图2是采用基于隐颈亚目动物SINE序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获 得的扩增产物电泳图，用于检测龟甲胶中的龟源性成分。其中M. DNA Marker, 1.空白对照， 2.龟肉基因组DNA，3.龟甲胶DNA，4.阿胶DNA，5.黄明胶DNA，6.猪皮胶DNA。图3是采用基于隐颈亚目动物SINE序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获 得的扩增产物的测序比对结果，用于验证扩增产物的可靠性。其中1.龟肉基因组扩增产 物，2.龟甲胶DNA扩增产物，3.隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE序列片段。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。本发明以鉴定龟甲胶真伪为例，为了检测龟甲胶中龟源性成分，并与其他各类杂 皮胶进行区分，基于隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE,包括CryIA(GenBankAccession No. AB125500)、CryIB (GenBank Accession No. AB125508)、CryIC(GenBankAccession No. AB125524) XryID (GenBank Accession No. AB125555)以及CryIIA(GenBank Accession No.AB125536)、CryIIB(GenBank Accession No.AB125447)、CryIIC(GenBank Accession No.AB125517)、CryIID(GenBank Accession No.AB125488)、CryIIE(GenBank AccessionNo. AB125499)的5，端同源区进行优化设计引物如下根据隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE设计引物，理论目标条带大小72bp，用于检测龟甲胶中龟源性成分。其序列如下上游引物Tortoise up =SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列下游引物Tortoise down =SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列各实施例提取胶类中药的DNA的具体步骤如下1、胶类中药的预处理将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心 管中，并向其中加入消化缓冲液，该缓冲液PH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA， 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 5% SDS构成，然后将离心管置于50°C _60°C水浴中保温，其间不时轻微 搅拌混勻，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白酶K溶液，混勻，56°C 保温1小时，其间不时轻微摇勻。2、胶类中药DNA的提取向上述胶类中药预处理液中加入PN缓冲液，混勻，分若干 次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入 PE缓冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用热的PH 8. 0 的TE缓冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于_20°C保存。提取得到的DNA可用紫 外分光光度法定量。上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)，包括 PN 缓冲液(Cat. No. 19071)、PE 缓冲液(Cat. No. 19065)、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。用上述方法提取得到各个胶类制品DNA样之后，利用上述引物进行常规的PCR操 作，将产物加于2% -3%的添加了荧光染料的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下观察，根据是否出 现阳性扩增条带判断待检测样品中是否含有龟源性成分，从而完成对这些样品的检测。实施例1检测各种肉基因组中所含有的龟源性成分1材料和试剂材料各种肉类包括龟、驴、马、牛、猪的基因组DNA提取液(lng/yL)。试剂PCR预混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version (购于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 荧光染料 10000 XGelRed =DNA 荧光染料(购于 Biotium，Cat. No.41000)。2检测方法取各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE 所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10 μ M备用。25 μ L反应体系的具体 加样情况如下Premix Εχ-Taq Hot Start Version 12· 5 μ L，弓L Tortoise up 0. 5μ L,^!^ Tortoisedown 0. 5 μ L,基因组DNA提取液1 μ L,无菌双蒸水10. 5 μ L ；(在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4 μ Μ,各种肉类DNA模板量lng。)扩增条件-MV6min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (30 循环)；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备2. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例混 入荧光染料GelRed 。按照比例将10 μ 1的PCR产物与上样缓冲液均勻混合，加入凝胶孔 中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶 块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
结果见图1，由于引物根据隐颈亚目动物SINE序列设计，泳道1具有阳性条带，而 其它泳道均没有出现阳性条带，可见该方法能够特异性检测龟源性成分，而与其他各种动 物源性成分包括驴、马、牛、猪等进行区分。实施例2检测胶类中药中所含有的龟源性成分1材料和试剂材料龟甲胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(lOng/μ ；阿胶(山东 东阿股份有限公司生产)DNA提取液(lOng/μ ；黄明胶(山东东阿股份有限公司研究所 采用牛皮熬制)DNA提取液(lOng/μ ；猪皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用猪皮 熬制)DNA提取液(lOng/μ 。试剂PCR预混酶 Premix Ex-Taq Hot Start Version ；(购于 TAKARA，Cat. No. DRR030A) ；DNA 荧光染料 lOOOOXGelRed =DNA 荧光染料(购于 Biotium，Cat. No.41000)。2检测方法取各种胶DNA提取液(lOng/μ L)备用，使用根据隐颈亚目动物SINE序列PolIII/ SINE所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10 μ M备用。25 μ L反应体系 的具体加样情况如下Premix Taq Hot Start Version 12. 5 μ L，弓L Tortoise up 0.5yL，弓L Tortoise downO. 5 μ L,模板 5 μ L,无菌双蒸水 6. 5 μ L ；(在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4 μ Μ，待检测胶类DNA模板量 50ngo )扩增条件:94°C6min -MV 30s, 50°C 30s, 72°C 30s (40 循环)；72°C 7min ；4°C ①。PCR操作结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备2. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例混 入荧光染料GelRed 。按照比例将10 μ 1的PCR产物与上样缓冲液均勻混合，加入凝胶孔 中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶 块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
结果见图2，由于引物根据隐颈亚目动物SINE序列设计，所以泳道2，泳道3都具 有阳性条带，可见尽管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对隐颈亚目动物SINE序 列设计的引物，通过PCR能够检测出胶类制品中的龟源性成分，而在其它样品中没有扩增 出阳性条带。接着对该实施例中的龟基因组扩增产物以及龟甲胶扩增产物进行连接载体并 测序，将所得到的测序结果进行比对，结果见图3，同源性良好，并且与所设计的产物序列相 符，进一步验证了检测结果的可靠性。因此利用这种方法能够将龟甲胶与其他各种杂皮胶 进行区分。上述试验结果表明，针对隐颈亚目动物基因组SINE序列设计引物，以龟甲胶DNA 提取液作模板，确实能够得到清晰的条带。由于SINE序列具有极高的拷贝数以及良好的种 属特异性，根据该序列设计引物进行PCR扩增就能够特异性识别龟甲胶中的龟源性成分， 从而将龟甲胶与其他各类杂皮胶区分开来。另一方面，在上述这些PolIII/SINE的不同亚 型序列间，其5’端是相对比较保守的，而3’端则相互间变化较大，因此根据这些序列的5’ 端设计引物进行PCR扩增就能够保证检测结果的可靠性和有效性。因此，利用隐颈亚目动 物种属特异性的SINE序列设计特异引物进行PCR就可以识别龟源性成分，达到深度加工龟甲胶产品的检测目的。SINE序列相对rDNA及mtDNA而言，拷贝数高，特异性好。所以，本发明对待检测样品的初始DNA模板质量要求较低，因此尽管从深度加工胶类中药中提取得到的DNA浓度极 低，破坏极其严重，但是，利用本发明进行检测，依然能够得到较为理想的结果。本发明的基 于隐颈亚目动物SINE的PCR检测方法能够适用于因深度加工而导致DNA含量极少、片段极 短的龟甲胶产品的检测。这也是本发明最大的特点和优势。并且该法并不需要十分昂贵的 仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测。因此，这种基于隐颈亚目动物SINE序列构建的深度加工型产品检测方法是整个 深度加工型龟甲胶鉴定方法的关键。这一点在利用分子生物学技术鉴别深度加工型龟甲胶 的领域意义重大。目前利用SINE序列来进行龟甲胶的分子鉴别技术国内外尚未见报道。综上所述，本发明的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本 低、能有效鉴定龟源性产品的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段 极短的深度加工型龟甲胶的真伪，适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的 而非限制性的。序列表<110>华东理工大学，山东东阿阿胶股份有限公司<120>中药中龟源性成分的PCR鉴定方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (20)<223>根据隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE设计的上游引物<400>1gagcattggc ctgctaaacc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1). . . (20)<223>根据隐颈亚目动物SINE序列Pol III/SINE设计的下游引物<400>2
ttttgcccca gatccctaaa 20
权利要求
一种中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤a)提取所述中药中的DNA；b)用根据隐颈亚目基因组SINE序列设计的特异性引物对所述DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自隐颈亚目动物，含有龟源性成分；如果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自隐颈亚目动物，也不含有任何龟源性成分。
2.根据权利要求1所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，在步骤a) 中，所述中药是深度加工型中药。
3.根据权利要求2所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述深度加 工型中药是深度加工型龟甲源性中药。
4.根据权利要求3所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述深度加 工型龟甲源性中药是因深度加工而导致DNA含量极少，片段破坏极其严重的龟甲胶。
5.根据权利要求2所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，采用消化液 和蛋白酶预处理所述深度加工型中药，再采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述DNA。
6.根据权利要求1所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述隐颈亚 目基因组SINE序列是Pol III/SINE序列。
7.根据权利要求6所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述 PolIII/SINE 序列包括 CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CryIΙΑ, CryllB、CryllC、CryIID 和 CryllE。
8.根据权利要求7所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述特异 性引物根据所述的 CryIA、CryIB、CryIC、CryID、CryIIA、CryIIB、CryIIC、CryIID 和 CryIIE 的5’同源区来设计的。
9.根据权利要求8所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述特异性 引物包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，其特征在于，所述阳性 扩增条带的长度在IOObp以下。
全文摘要
本发明提供了一种中药中龟源性成分的PCR鉴定方法，包括下列步骤a)提取中药中的DNA；b)用根据隐颈亚目基因组SINE序列设计的特异性引物对所述DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自隐颈亚目动物，含有龟源性成分；如果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自隐颈亚目动物，也不含有任何龟源性成分。本发明操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定龟源性产品的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型龟甲胶的真伪，适于大规模推广应用。
文档编号C12Q1/68GK101838684SQ20091020077
公开日2010年9月22日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者吕品, 周祥山, 尤金花, 张元兴, 田守生, 秦玉峰 申请人:华东理工大学;山东东阿阿胶股份有限公司