专利名称：转基因木瓜品系16-0-1的核酸分子及其检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1的核 酸分子。本发明也涉及应用前述序列的一种用于检测对于木瓜环斑病毒具有广泛抗性的转 基因木瓜品系16-0-1的方法，以及依据前述序列所设计出的引物、探针及试剂盒。
背景技术：
木瓜(Papaya) (Carica papaya L.)生长于热带与亚热带地区。量产木瓜所面 临的最大问题是在于木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus, PRSV)造成的破坏性疾病 (Purcifull et al. 1984)。1975 年，PRSV 首次在南台湾地区发现(Wang et al. 1978)，至 今已经摧毁了商业果园大部分的木瓜生产。I3RSV是属于马铃薯Y群病毒(Potyvirus)的一 员，此族群病毒是最庞大且影响经济甚巨的植物病毒族群(Fauquetet al. 2005)。I3RSV可 以通过蚜虫传递并且诱发叶部斑点以及变形、茎杆条纹以及生长停滞的发生，而导致果实 品质及产量的骤减(Purcifull et al. 1984)。目前被使用来保护木瓜免于rasv感染的控制措施，主要包括选择种植时间， 以避开蚜虫生长高峰期；使用银色覆盖物(silver mulch)，以驱离蚜虫远离种苗；以及 应用减弱的PRSV病毒株的交叉保护作用(cross protection) (Yeh et al. 1988 ；Yehand Gonsalves,1994) 0然而，这些方法皆无法提供对抗I3RSV的长期有效的保护。目前在台 湾，将木瓜种植于网室内已经变成用于避免木瓜遭受经蚜虫传递的I3RSV感染的最有效的 控制方法。然而，网室构筑需要较高的成本，且所使用的塑料材料于自然中难以分解，这 将会对环境造成危害，且热带风暴造成损害的高度风险亦为需要考量的重要问题(Bau et al. 2003)。近年来，以病源体衍生的抗性(pathogen-derived resistance, PDR)的观念 (Sanfordand Johnson, 1985)为基础，含有植物病毒基因组片段的转基因植物的研发已经 广泛地被使用作为控制病毒的对策(Beachy，1997)。在大部分的实例中，会产生后转录性的 抗性(posttranscriptional resistance)机制，这是因一种以序列特异性方式针对病毒的 RNA 以及转基因 mRNA 降解的 RNA 调节路径所致(English et al. 1996 ；Lindboet al. 1993 ； Siien and Kooter 2000 ；Vaucheret et al. 1998)。PRSV 的外壳蛋白(coatprotein, CP)基 因通过粒子轰炸法(particle bombardment)予以转移至木瓜中(Fitch etal. 1990)，并且 蹄选出对PRSV感染具有高度抗性的转基因品系(Fitch et al. 1992 ；Lius et al. 1997)。转基因木瓜自1998年起已成功地于夏威夷商业化(Gonsalves，2002 ；Tripathi etal. 2007)。在台湾，带有台湾严重病毒株I3RSV (的CP基因的转基因木瓜品系则通过 农杆菌媒介的转化方法(Agrobacterium-mediated transformation)已成功的被制造出 (Cheng et al. 1996)。当前述转基因木瓜被接种予PRSV (时，它们对病毒的反应落在高 度易感性(high susceptibility)到具有完全抗性(complete resistance)的范围内(Bau et al. 2003) 0在温室条件下，转基因品系16-0-1、17-0-1、17_0_5以及18-2-4对于源自不 同地理来源的I3RSV具有广泛的抗性(Bau et. al.，2003)，而于田野试验中则有高度的抗性(Bau et al. 2004)，显示这些品系具有控制不同地理区域中的PRSV的能力。实验观察发现16-0-1、17-0-5以及18_2_4于植株生长至5公分高度时，会表现 高度的转基因，然而其他诸如18-0-9、19-0-1则于相同阶段完全没有表现，可见16-0-1、 17-0-5以及18-2-4等转基因木瓜品系中的转基因插入于基因组的位点必然有其特殊性。 现有技术尚无法得知前述转基因木瓜品系，特别是转基因木瓜品系16-0-1的转基因插入 位置旁侧的基因组序列，若能了解其插入基因组位置，将可针对各种品种的木瓜直接进行 诸如以同源性的基因重组有效率的产生具有抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系，而无 需经由长时间的筛选以及田间试验，以取得高抗病毒性的木瓜品系。另一方面，近年来，基因改造生物(genetically modified organism,GM0)的安全 性议题已引起相当大的注意(Singh et al.，2006)。各国已经实施各种不同的关于GM食物 认证以及标示(food apporval and labeling)的法规。欧盟法规第1830/2003条[European Union (EU) regulation (EC) No. 1830/2003]规定在生产至供应链的市场中的各个阶段必须 能够追踪基因改造生物及基因改造生物衍生的产品(EuropeanParliament and Council of European Union, 2003, p.1-5)。同样的，台湾对于基因改造作物(GM crop)的田间试验以及接续的品种权的法规 亦要求提供有关于特定转基因品系的转基因旁侧的基因组序列的资讯。因此，用以鉴定特 定基因改造生物的具特异性且可信赖的方法对于符合法令规定而言是必要的，且对于监测 未授权的基因改造生物的销售与耕种而言是具有重要性的。因此，在此技术领域中，对于一种用以鉴定特定基因改造生物的方法存在有迫切 的需求，其中该方法对于前述的诸如16-0-1的转基因木瓜品系而言必须是具有特异性、再 现性、高敏感度以及可信赖的。
发明内容
发明概要有鉴于现有技术领域中的对于有效率的产生具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的 转基因木瓜品系的需求，以及现有技术缺乏对于转基因木瓜品系具有特异性的鉴定方法， 本发明的目的即在于解决现有技术必须经由长时间的筛选以及田间试验，才能取得高抗病 毒性的木瓜品系的问题，以及提供针对转基因木瓜品系16-0-1进行鉴定的问题的各种相 关技术方案，例如具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系的核酸分子、相关转 基因木瓜品系的检测方法、引物、探针、试剂盒，而前述的技术方案对于16-0-1的转基因木 瓜品系而言必须是具有特异性、再现性、高敏感度以及可信赖的。为了达到上述目的，在第一方面，本发明系提供一种分离的具有广泛性抗木瓜环 斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1的核酸分子，其具有一位于5’端的右边界旁侧区 域，一位于3’端的左边界旁侧区域，以及一位于右边界旁侧区域与左边界旁侧区域之间的 含有木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV CP gene)的转基因序列，其中右边界旁侧区域包 含一与SEQ ID NO : 所示序列具有90%同源性的序列；左边界旁侧序列包含一与SEQ ID NO 31所示序列具有90%同源性的序列；而该转基因序列系包括一木瓜环斑病毒外壳蛋白 基因以及一可操作的连结于木瓜环斑病毒外壳蛋白基因上游的启动子。在第二方面，本发明系提供一种用于扩增转基因木瓜核酸序列的引物，其系选自于由下列所构成的群组一具有如SEQ ID NO : 所示序列或其互补序列之中的至少10个 连续序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO :31所示序列或其互补序列之中的至少10 个连续序列的核酸片段。在第三方面，本发明系提供一种用于检测转基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括 下列步骤提供一木瓜核酸样品以及一引物对，其中该引物对包括一正向引物以及一反向引 物；令该木瓜核酸样品与该引物对形成一聚合酶链反应混合物，进行扩增反应，得到 一扩增反应产物；以及检测扩增反应产物，其中如有一预定大小的扩增片段存在，则代表该木瓜核酸样 品含有源自于转基因木瓜品系16-0-1的基因组DNA ；其中该正向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID NO : 所示序列 之中的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列中的至少10个连 续序列的核酸片段；以及它们的互补序列；以及该反向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID N0:31所示序列 的互补序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:33所示序列的互 补序列中的至少10个连续序列的核酸片段；以及它们的互补序列。发明的详细说明在过去十年来，在夏威夷以及台湾地区已成功培育出商业上可取得的转基因木瓜 品系，其因带有木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)的外壳蛋白(coatprotein， CP)基因，而可具有对抗各种不同地域来源的PRSV病毒的广泛性病毒抗性。然而要筛选出 一对木瓜环斑病毒具有高度广泛稳定抗性的转基因木瓜品系以现有技术的方法必须经由 长时间的筛选、田间试验才能取得。有鉴于此，本发明利用分子生物技术成功解析出转基因木瓜品系16-0-1的含有 木瓜环斑病毒外壳蛋白的T-DNA插入的位点，并分析得到其右、左边界旁侧的基因组序列， 因而分离出一具有可适用于制造具有高度广泛稳定抗性的转基因木瓜的核酸分子，其具 有一位于5’端的右边界旁侧区域，一位于3’端的左边界旁侧区域，以及一位于右边界旁 侧区域与左边界旁侧区域之间的含有木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV CP gene)的转基 因序列，其中右边界旁侧区域包含一与SEQID NO 29所示序列具有同源性的序列；左边界 旁侧序列包含一与SEQ ID NO :31所示序列具有同源性的序列；而该转基因序列系包括一 木瓜环斑病毒外壳蛋白基因以及一可操作的连结于木瓜环斑病毒外壳蛋白基因上游的启 动子。另一方面，基于欧盟以及部分亚洲国家的法规对于基因改造生物的追踪的 要求，本技术领域中迫切需要一种针对前述转基因木瓜品系的事件特异性检测方法 (event-specific detection)，此一事件特异性检测方法具有高效率以及高灵敏度的特
点ο有鉴于此，本发明以聚合酶链反应为基础，针对rasv CP基因的转基因木瓜品系的 特性研发出如前所述的检测方法、引物及试剂盒。转基因特异性产物可以通过使用针对转 基因中的启动子、终止子、筛选标记以及转基因的各种引物对予以扩增出。此外，所述的利用接头-接合聚合酶链反应(adaptor ligation-PCR, AL-PCR)所扩增出的植物基因组DNA 与T-DNA插入物之间的连接区域(junction)于本发明中被选殖(cloned)及定序。另外，本发明提供一种针对转基因及其旁侧序列的事件-特异性检测方法，其系 可用于鉴定特定的转基因木瓜品系16-0-1。本发明中依据转基因的左、右边界的旁侧序列 所设计出的引物，当被使用于扩增反应中时，其所扩增出的PCR产物的态样系具有再现性 以及特异性。本发明亦证实I3RSV CP基因是插入至转基因木瓜的基因组的不同位置中，且插 入的T-DNA的复本数目通过即时PCR被测定出。因此，本发明所提供的事件-特异性方法、 引物以及试剂盒对于法规要求需追踪基因改造生物的国家以及对于保护知识产权而言是 有用且重要的。此外，本发明所提供的方法、引物以及试剂盒有助于于育种计划(breeding program)中迅速蹄选出纯合子转基因子代(homozygote-transgenic progeny)。依据本发明，用语“同源性(homology”意指二序列之间相关连的程度，其可以序列 间相同及/或保守(conservative)比率定的。由于核酸或氨基酸序列的变异并不必然影 响其所构成的特性，因此只要核酸或其编码出的氨基酸序列具有一定程度的同源性而不影 响核酸序列的特性或该蛋白质的活性，即为本发明所涵盖，上述一定程度的同源性优选是 至少90%。在本发明的分离的具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1 的核酸分子的优选实施例中，其中该启动子为花椰菜镶莰病毒35S启动子(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter, CaMV 35S promoter)。在本发明的分离的具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1 的核酸分子的优选实施例中，其中该转基因序列系包含一与SEQ ID N0:34所示序列具有 90%同源性的序列。在本发明的分离的具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1的 核酸分子的优选实施例中，如前所述的核酸分子，其是由下列者所构成一位于5’端的右 边界旁侧区域，一位于3’端的左边界旁侧区域，以及一位于右边界旁侧区域与左边界旁侧 区域之间的含有木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的转基因序列，其中右边界旁侧区域具有如 SEQ ID NO 29所示序列；左边界旁侧序列具有如SEQID NO 31所示序列；而该转基因序列 具有如SEQ ID NO 33所示序列。依据本发明的方法，所述的用于扩增转基因木瓜核酸序列的引物系选自于由下列 所构成的群组一具有如SEQ ID NO 29所示序列或其互补序列之中的至少10个连续序列 的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO 31所示序列或其互补序列之中的至少10个连续序 列的核酸片段。优选的，前述引物是选自于由下列所构成的群组一具有如SEQ ID NO : 所示序 列或其互补序列之中的至少15个连续序列的核酸片段；以及一具有如SEQID NO :31所示序 列或其互补序列之中的至少15个连续序列的核酸片段。依据本发明的方法，前述用于扩增转基因木瓜核酸序列的引物优选的是选自于由 下列引物所构成的群组Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；以及Papa57引 物，其具有如SEQ ID N0:20所示序列。依据本发明，“引物(primer)”可以利用此技术领域中所知的任何化学或生化的 合成方法制备。例如，当引物为核酸所构成时，其可通过遗传工程领域中常见的核酸合成方法制备。例如，核酸可通过使用DNA合成仪直接合成。而为了使得到的核酸可于细胞 内较为稳定，可进一步针对核酸的碱基、醣基以及磷酸部分进行化学性修饰，诸如烷基化 (alkylation)、酰基化(acylation)或其他类似作用。用语“探针”意指可产生可辨识特定序列并且可产生供检测的信号的材料，如此处 所示用的探针包括经标记的核酸片段，其中该标记包括但不限于放射性物质、荧光染料以
及受质专一性酵素等。依据本发明的用于检测转基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸 样品以及一引物对，其中该引物对包括一正向引物以及一反向引物；令该木瓜核酸样品与 该引物对形成一聚合酶链反应混合物，进行扩增反应，得到一扩增反应产物；以及检测扩增 反应产物，其中如有一预定大小的扩增片段存在，则代表该木瓜核酸样品含有源自于转基 因木瓜品系16-0-1的基因组DNA;其中该正向引物系选自于由下列者所构成的群组一具 有如SEQ ID NO 29所示序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；优选的，至少15个连 续序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO 33介于第4468至M68核苷酸位点的序列 之中的至少10个连续序列的核酸片段；优选的，至少15个连续序列的核酸片段；以及该反 向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID NO :31所示序列的互补序列之 中的至少10个连续序列的核酸片段；优选的，至少15个连续序列的核酸片段；以及一具有 如SEQ ID NO 33介于第1至1000核苷酸位点的序列的互补序列之中的至少10个连续序 列的核酸片段；优选的，至少15个连续序列的核酸片段。在本发明的一优选的实施例中，前述的正向引物系选自于由下列引物所构成的群 组Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID N0:13所示 序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID NO :21所示序列；以及m引物，其具有如SEQ ID NO :16所示序列；而反向引物系选自于 由下列引物所构成的群组S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示序列；Papa27引物，其具有 如 SEQ IDNO :12 ；以及 Papa57 引物，其具有如 SEQ ID NO :20。依据本发明，所述的扩增片段(amplified fragment)意指利用前述引物以核酸样 品为模板进行聚合酶链反应所扩增出的特定片段，例如使用Papa31引物(SEQ IDNO 17)为 正向引物以及Papa27引物(SEQ ID NO 12)为反向引物，以转基因木瓜品系16_0_1的基因 组DNA为模板，于适当的聚合酶链反应条件下，则可扩增出一 241碱基对的扩增片段。依据本发明，所述的聚合酶链反应混合物如此技术领域所知的包括引物、模板、聚 合酶、去氧核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP)以及反应缓冲液，并可 进行一扩增反应，得到一扩增反应产物。在本发明的一优选的实施例中，所述的聚合酶链反 应混合物更包含一染料，该染料系可与扩增片段结合，并且接受适当的荧光激发而放出可 检测的荧光信号，例如，但不限于SYBR Green0依据本发明，所述的木瓜核酸样品系可通过任何本技术领域中已知的核酸萃取方 法从木瓜的各个器官、部位(诸如根、茎、叶、花、果实、种子等)所制得。优选的是从木瓜的 叶部利用溴化鲸蜡基三甲基铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)纯化而得。依据本发明，检测扩增反应产物优选的系包括通过电泳分析以及直接检测扩增反 应的荧光信号等方式进行，其中直接检测扩增反应的荧光信号的方式系包括检测经染料标记的特异性探针或使用SYBR Green等染料经适当荧光激发后所发射出的荧光信号。
图1显示转基因木瓜品系中的T-DNA的旁侧区域，其中图1 (a)区显示位于木瓜基 因组内的T-DNA插入物，图1 (b)区显示右边界旁侧的基因组序列的扩增策略，以及图1 (c) 区显示左边界旁侧的基因组序列的扩增策略。图2利用类型1、2、3的PCR检测鉴定转基因木瓜品系；其中图2(a)区显示针对35S启动子的类型1检测的结果，其利用35S启动子特异性引 物对35S-F/35S-R扩增而得一 836碱基对的产物；图2(b)区显示针对nptll的类型1检测的结果，其利用nptll特异性引物对 npt-l/npt-2扩增而得一 8 碱基对的产物；图2(c)区显示针对nos终止子之类型1检测的结果，其利用nos终止子特异性引 物对nos-l/nos-2扩增而得一 1 碱基对的产物；图2(d)区显示针对转基因的类型2检测的结果，其利用I5RSV CP基因特异性引物 对PRSV-F/PRSV-R扩增而得一 840碱基对的产物；以及图2(e)区显示针对CaMV 35S启动子以及I3RSV CP转基因的类型3检测的结果， 其利用引物对35S-F/PRSV-R扩增而得一 700碱基对的产物。图3显示T-DNA右边界/木瓜基因组DNA连接区域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其右边界是以小写表示，SspI的辨识位点(ATT)如箭头标示，此外Apl、Ap2、Papa27、 Papa31以及Papa32等引物位置如图所标示；其中图3(a)区显示转基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA右边界的基因组旁侧序 列(SEQ ID NO 29)；以及图3 (b)区显示转基因品系18-2-4的T-DNA右边界的基因组旁侧序列(SEQ IDNO 30)。图4显示T-DNA左边界/木瓜基因组DNA连接区域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其左边界是以小写表示，DraI以及EcoRV的辨识位点(TTT以及GAT)分别如箭头标示， 此外Apl、Ap2、Papa52、Papa56、Papa57、Papa58 Papa59以及附等引物位置如图所标示；其 中图4(a)区显示转基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA左边界的基因组旁侧序 列(SEQ ID NO 31)；以及图4(b)区显示转基因品系18-2-4的T-DNA左边界的基因组旁侧序列(SEQ IDNO 32)。图5显示转基因木瓜品系的事件特异性检测，其是利用对基因组旁侧序列以及 T-DNA序列具有特异性的引物对产生跨越T-DNA右边界以及植物基因组的DNA产物或者跨 越T-DNA左边界以及植物基因组的DNA产物；其中图5 (a)区显示针对16-0-1品系(右边界)利用引物对Papa31/Papa27扩增出一 241碱基对的特异性产物；图5 (b)区显示针对18-2-4品系(右边界)利用引物对Papa32/Papa27扩增出一 384碱基对的特异性产物；
图5 (c)区显示针对16-0-1品系(左边界)利用引物对Papa56/Papa57扩增出-106碱基对的特异性产物；图5 (d)区显示针对18-2-4品系(左边界)利用引物对Papa58/Papa59扩增出-140碱基对的特异性产物；
及
图5(e)区显示利用引物对Papa31/Papa57扩增出一 227碱基对的特异性产物；以
图5 (f)区显示利用引物对Papa32/Papa59扩增出一 345碱基对的特异性产物。 图6显示利用Southern印迹分析测定PRSV CP转基因复本数目。 图7显示I3RSV CP转基因的即时PCR扩增图，其中to数值差值(delta Rn value) 以报导子染剂从TaqMan :探针被释放出来时的经归一化的荧光发射表示；其中图7 (a)区显示16-0-1杂合子Ttl植物体的典型扩增曲线图7 (b)区显示16-0-1纯合子T1植物体的典型扩增曲线图7 (c)区显示18-2-4杂合子Ttl植物体的典型扩增曲线；以及图7(d)区显示18-2-4纯合子T1植物体的典型扩增曲线。
具体实施例方式本发明将进一步通过下面的实施例来作说明，但应明了的是，该等实施例仅为说 明之用，而不应被视为本发明的实施上的限制。实施例一般材料与方法1.植物材料下述实施例中所使用的植物材料是具有rasv的CP基因以及对rasv具高度抗性 的转基因木瓜(Cheng et al.，1996)，其中包括16-0-1、17-0-5以及18-2-4品系的T0植物 体以及16-0-1以及18-2-4品系杂合子或纯合子子代的T1植物体，其皆以组织培养的方式 进行微体繁殖(micropropagated) (Yang et al.，1996)。使用作为比较的非转基因的物种 (varieties)为台农一号(Tainung No. 1，1^1)、台农二号(TainungNo. 2，TN2)、台农五号 (Tainung No. 5, TN5)、台农六号(Tainung No. 6, TN6)、日升(Sunrise)、红妃(Red Lady)、 穗中红(Red Ear)、马大瓜(Mai Tai Kua)以及泰国(Thailand)。它们的种苗是由位于台 湾行政院农委会农业试验所(Taiwan AgriculturalResearch Institute, TARI)的凤山热 带园艺试验分所(Fengshan Tropical HorticulturalExperiment Branch)所提供。转基 因品系与非转基因品种的植物是于TARI附设的温室中培育生长。2.木瓜基因组 DNA (genomic DNA)纯化木瓜基因组DNA是从0. 5g转基因木瓜品系以及非转基因物种的新鲜叶片中所纯 化出，其是以Dolyle等人所使用的方法(Doyle and Doyle, 1990)利用溴化鲸蜡基三甲基 铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)(SIGMA-ALDRICH Inc.，St. Louis, MO, USA) 纯化而得。将聚乙烯基吡咯并吲哚[poly (vinylpolypyrrolidone)，PVPP) (SIGMA-ALDRICH Inc.)予以加入至萃取缓冲液，用以增加萃取的DNA的纯度。DNA浓度通过光谱仪(U-3000 Spectrophotometer, Hitachi Instruments Inc. , SanJose, CA, USA)予以评估测量 OD260, 而DNA品质是利用琼脂醣凝胶进行分析。
3.利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的转基因特异性检测作为类型1 的鉴定，引物对 35S-F/35S-R、npt-l/npt-2 以及 nos-l/nos-2， 如表1所示，分别被使用来检测花椰菜镶莰病毒35S启动子(Cauliflower mosaic virus 35Spromoter, CaMV 35S promoter)、康纳霄素蹄选标记基因 npt II (kanamycin selectionmarker gene nptll)以及 i若中白林合成 Sl 终 it 子(nopaline synthase terminator, nosterminator) (Hoist-Jensen et al.,2003)。对于类型 2 鉴定，是使用如表 1所示的对PRSVCP基因序列具有特异性的引物对PRSV-F/PRSV-R(Bau et al.，2003)。对于 类型3鉴定，是使用对35S启动子(35S promoter)具有特异性的引物对以及对I3RSV CP基 因具有特异性的引物对35S-F/PRSV-R。PCR扩增反应混合物(最终体积30 μ L)含有USng HIS.DNA (template DNA) UR^] 1. 2unit FastStart Polymerase (RocheDiagnotics GmbH, Penzberg, Germany) ,2. 5mM MgCl2、200yM dNTP 以及 0. 2 μ M 引物，它们系配于 PCR 缓冲液 (50mM KCl ；IOmM Tris-HCl，pH9. 0 ；0. 1 % TritonX-100)中。PCR是以包括下列步骤的 30 个 循环利用一热循环机(thermocycler) (Gene Amp PCR System 9700,Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)进行于94°C下历时1分钟，用以裂解(melting)，于不同的黏合温 度下历时1分钟，用以黏合(annealing)，以及于72°C历时2分钟，用以合成(synthesis)。 PCR产物通过2%琼脂醣凝胶于TAE缓冲液(Tris acetate, pH8. 0 ； ImM EDTA)中以电泳进 行分析。PCR产物直接使用 310 Genetic Analyzer (ABI PRISM ,Applied Biosystems)予 以定序。PCR延长作用(PCR elongation)的定序过程是进行于前述热循环机中历经25个循 环。最后的延长作用之后，该定序的产物接而被沉淀、萃取以及复溶(redissolved)于定序 电泳缓冲液(sequencing running buffer) (Hi-Di Formamide,Applied Biosystems)。样 品接而利用61公分毛细管被装载至ABI 310，以进行定序。Lasergen Software (DNASTAR, 2001，DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)被使用来排列比较(align)扩增的序列与特定的已 知序列。表1本发明中所使用的引物的序列及其黏合温度
权利要求
1.一种分离的具有广泛性抗木瓜环斑病毒特性的转基因木瓜品系16-0-1的核酸分 子，其具有一位于5’端的右边界旁侧区域，一位于3’端的左边界旁侧区域，以及一位于右 边界旁侧区域与左边界旁侧区域之间的含有木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的转基因序列，其 中右边界旁侧区域包含一与SEQ ID NO : 所示序列具有90%同源性的序列；左边界旁侧 序列包含一与SEQ ID NO :31所示序列具有90%同源性的序列；而该转基因序列系包括一 木瓜环斑病毒外壳蛋白基因以及一可操作的连结于木瓜环斑病毒外壳蛋白基因上游的启 动子。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中该启动子为花椰菜镶崁病毒35S启动子。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中该转基因序列进一步包括一抗生素抗性基因 以及一终止子。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中该转基因序列系包含一与SEQID N0:33所 示序列具有90%同源性的序列。
5.根据权利要求1所述的核酸分子，其是由下列者所构成一位于5’端的右边界旁侧 区域，一位于3’端的左边界旁侧区域，以及一位于右边界旁侧区域与左边界旁侧区域之间 的含有木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的转基因序列，其中右边界旁侧区域具有如SEQ ID NO 29所示序列；左边界旁侧序列具有如SEQ ID NO 31所示序列；而该转基因序列具有如SEQ ID NO 33所示序列。
6.一种用于扩增转基因木瓜核酸序列的引物，其系选自于由下列所构成的群组一具有如SEQ ID NO : 所示序列或其互补序列之中的至少10个连续序列的核酸片 段；以及一具有如SEQ ID NO :31所示序列或其互补序列之中的至少10个连续序列的核酸片段。
7.根据权利要求1所述的引物，其系选自于由下列引物所构成的群组Papa31引物，其 具有如SEQ ID NO 17所示序列；以及Papa57引物，其具有如SEQ ID NO 20所示序列。
8.一种用于检测转基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸样品以及一引物对，其中该引物对包括一正向引物以及一反向引物；令该木瓜核酸样品与该引物对形成一聚合酶链反应混合物，进行扩增反应，得到一扩 增反应产物；以及检测扩增反应产物，其中如有一预定大小的扩增片段存在，则代表该木瓜核酸样品含 有源自于转基因木瓜品系16-0-1的基因组DNA ；其中该正向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID NO : 所示序列之中 的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列中的至少10个连续序 列的核酸片段；以及它们的互补序列；以及该反向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID N0:31所示序列的互 补序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33所示序列的互补序 列中的至少10个连续序列的核酸片段；以及它们的互补序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该正向引物系选自于由下列者所构成的群组一 具有如SEQ ID NO : 所示序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :33介于第4468至讨68核苷酸位点的序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；以及它们的互补序列；以及该反向引物系选自于由下列者所构成的群组一具有如SEQ ID N0:31所示序列的互 补序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:33介于第1至1000核 苷酸位点的序列的互补序列之中的至少10个连续序列的核酸片段；以及它们的互补序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其中该正向引物系选自于由下列引物所构成的群组Papa31引物，其具有如SEQ IDNO 17 所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID NO 13所示序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO: 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID NO :21所示序列；以及m引物，其具有 如SEQ ID NO 16所示序列；而该反向引物系选自于由下列引物所构成的群组S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示 序列；Papa27引物，其具有如SEQ ID NO 12 ；以及Papa57引物，其具有如SEQ ID NO :20。
11.根据权利要求8所述的方法，其中该正向引物为Papa31引物，其具有如SEQID NO 17所示序列；反向引物为Papa27引物，其具有如SEQ ID NO :12所示序列，而该扩增片段的 预定大小为241碱基对。
12.根据权利要求8所述的方法，其中该正向引物为Papa56引物，其具有如SEQID NO 19所示序列，反向引物为Papa57引物，其具有如SEQ ID NO :20所示序列，而该扩增片段的 预定大小为106碱基对。
13.根据权利要求8所述的方法，其中该木瓜核酸样品来源系单一木瓜植物体；该正向 引物为Papa31引物，其具有如SEQ ID NO 17所示序列；而反向引物为Papa57引物，其具有 如SEQ ID NO :20所示序列；并且该扩增反应系包括使用一聚合酶于具有一介于55至65°C 的黏合温度的聚合酶链反应条件下进行；以及检测扩增反应产物进一步包括检测一 227 碱基对的扩增片段存在，则代表该木瓜植物体非为纯合子转基因木瓜品系。
全文摘要
本发明涉及转基因木瓜品系16-0-1的核酸分子及其检测方法及应用。本发明提供一种用于检测转基因木瓜品系16-0-1的方法，其包括提供一木瓜核酸样品以及一引物对；令该木瓜核酸样品与该引物对形成一聚合酶链反应混合物，进行扩增反应，得到一扩增反应产物；以及检测扩增反应产物，其中当有一预定大小的扩增片段存在，则代表该样品含有转基因木瓜品系16-0-1的DNA。本发明也提供用于检测转基因木瓜品系16-0-1的引物、探针以及试剂盒。前述序列、方法、引物以及试剂盒有助于符合法规要求、知识产权保护及迅速筛选出纯合子转基因子代。
文档编号C12N15/40GK102071208SQ20091022618
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者包慧俊, 叶锡东, 苏天财, 范宗宸, 郑樱慧, 陈述, 龚怡蓉 申请人:包慧俊, 叶锡东, 苏天财, 范宗宸, 郑樱慧, 陈述, 龚怡蓉