专利名称：：用dna指纹筛选鸡早期体重增长程度的方法
技术领域：
：本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种用DNA指纹筛选鸡早期体重增长程度的方法。
背景技术：
：传统的数量遗传学对数量性状遗传机制的理解建立在抽象的微效多基因假设基础上，将影响一个数量性状的所有基因当作一个整体来处理，而不考虑其中的各个基因是如何作用的。这一假说在多年的动植物育种中发挥了重要作用，推动了动植物育种工作的进展，在当时的理论和技术条件下不失为一个很好的基础。但这一假说不了解数量性状的遗传背景，不了解控制数量性状的基因在染色体上的位置及其传递规律，无法对其效应作出准确的估计，更不能从分子水平分离和定位该类基因。随着现代分子生物学技术的飞速发展，遗传学家和育种学家认识到控制数量性状的基因并非在基因组中随机分布，且存在影响数量性状的主效基因。目前，在育种中对鸡早期体重增长程度的筛选方法主要是通过数量遗传学方法选择，尚未开发出一个在多个群体中效应一致的分子遗传标记。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种鸡早期体重增长程度的筛选方法，该方法利用鸡EAV/DNA指纹图谱对鸡早期体重进行标记辅助选择，不受环境影响。本发明的原理是20世纪90年代本课题组就开展了分子遗传标记在家禽育种中的应用研究工作，研究发明利用标记的鸡EAVDNA片段(其基因登录号为x59844.1)(鸡内源性反转录病毒因子，这种因子在现代鸡种个体中大约有40100个插入)为探针，得到的EAV/DNA指纹图谱中长度为3.48Kb的条带J的有无对京海黄鸡、新扬州鸡、萧山鸡、SR92A系以及后两者的杂交后代早期生长有显著的遗传效应。且无DNA指纹的个体早期生长速度大于有DNA指纹的个体，DNA指纹指纹能稳定遗传，不受环境影响，可以用于鸡早期体重选择的分子遗传标记，进行标记辅助选择。本发明所说的方法是提取待测样本的鸡基因组DNA，将经EcoRI限制性内切酶酶切的鸡基因组DNA进行电泳，电泳后转移到硝酸纤维素膜上，以标记的鸡EAVDNA片段为探针，进行Southern杂交，得DNA指纹图谱，根据图谱中长度为3.48Kb的条带的有无对待测样本的早期体重增长快慢进行判断。经多品种实验研究，证实鸡DNA指纹图谱中长度为3.48Kb的条带J的有无对鸡早期生长具有显著的影响，且DNA指纹图谱中无J条带的个体早期生长速度大于有J条带的个体，DNA指纹能稳定遗传，不受环境影响，可以用于鸡早期体重选择的分子遗传标记，进行标记辅助选择。对于鸡辅助育种、加快选择进展、培育新品种具有显著的效果。图1是探针电泳图，Marker为ADNA/HindIII+EcoRI图2.EAV探针所得到的DNA指纹图具体实施例方式实施例一EAV/DNA指纹图谱的制备1.待测基因组DNA的提取1.1采血准备5ml禽血DNA提取裂解缓冲液，鸡翅静脉取血0.5ml左右，加入禽血DNA提取裂解液中摇匀至透亮，制成血液裂解缓冲液，4t:保存。1.2消化蛋白质和RNA取上述2001血液裂解缓冲液(此时血液稀释液比较粘稠，可用剪刀剪断)，于1.5ml离心管中，加入300ii1TE，加入蛋白酶K(终浓度为100ng/iU)和RNaseA酶(终浓度为20ng/1)，混匀后55t:水浴过夜，充分消化蛋白质和RNA。1.3有机溶剂提取DNA加入O.5ml酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液颠倒混匀成悬浮液，冷冻离心机4"离心(10000rmp)10min，吸取上层透明的DNA溶液至另一干净的1.5ml离心管中进行第一次抽提后，再连续抽提三次，然后用氯仿-异戊醇(24:1)混合液再抽提一次，最后加入2倍体积的无水冰乙醇，颠倒混匀，离心管中出现絮状漂浮物，放入-20°C冰箱沉淀4h后，离心(4000rmp)5min，倒掉乙醇，沉淀用70%的无水冰乙醇洗两遍，去掉沉淀中的离子等杂质，待乙醇挥发后，加200iU的TE37。C过夜溶解DNA。1.4DNA浓度和纯度的测定用紫外分光光度仪检验抽提样品中DNA的0D26。及0D28。，0D26。与0D28。的比值高于1.700的基因组DNA用于实验，低于该值的重新抽提，计算DNA的浓度，根据各个体基因组DNA的浓度，把基因组DNA稀释成100ng/iU，4。C贮存，备用。2探针制备2.1PCR模板用作探针制备的PCR模板的白莱航鸡基因组DNA制备同上。2.2引物及其合成根据EAV序列合成引物，序列如下EAV-1:5'-GGTTCTTACGGTGAGGGAGGC-3';EAV-2:5'-CACGTCTATTACAACATCTCCC-3';按PCR要求进行引物稀释。2.3EAV片段的合成与纯化用PCR仪合成长度为1.5kb片段EAVDNA探针，模板为白莱航鸡基因组DNA。扩增开始95t:预变性8min，然后进入循环，循环条件为94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，共进行33个循环。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳(图1)，所用的Marker为ADNA/HindIII。用低熔点挖块法回收探针DNA目的片段，回收时先6(TC熔解，然后加等体积的酚和氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，再加0.5倍体积5M醋酸胺和2倍体积预冷的无水冰乙醇于-2(TC过夜沉淀，在高速冷冻离心机中于10000rpm离心15min，弃上清后，用70%冰乙醇洗涤两次，沉淀干燥后溶于TE(pH=8.OlOmMTris-Cl，pH=8.0，lmMEDTA)缓冲液。42.4探针标记2.4.l随机引物标记法稀释探针DNA(约liig)至总体积15iU，在沸水中加热，变性10min，迅速放入冰水混合物中冷却，然后依次加入21随机六核苷酸寡聚引物混合物，21dNTP(含标记物DIG-dUTP)，1ii1Klenow酶，离心混匀后37。C孵育20h后，加2ii10.2mol/LEDTA(PH8.0)终止反应。2.4.2PCR标记法PCR反应体系白莱航鸡基因组DNA1ii1(50ng)，10Xbuffer2.5iil，Mg2+2.2ul，dNTP(DIG-dUTP)1ii1(25mmol/L)，EAV-1和EAV-2引物各1iil(8pmol/ii1)，TaqDNA聚合酶0.5U，加超纯水补足至25ill。扩增条件:95。C预变性8min，94。Clmin，55。Clmin，72。C2min，共进行33个循环。2.5DNA指纹图谱的制备纯化的鸡基因组DNA用EcoRI酶于37。C消化8h以上，酶的用量为10U/ug，由于反应体积超过电泳凝胶孔的加样量，所以要浓縮体积。方法是在酶切完全后，加入10mmo1/LEDTA终止反应，用等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提，离心后吸取上清，用预冷的酒精沉淀过夜，待酒精挥发后，溶于TE缓冲液，加样电泳。每样品DNA用量约为10i!g。留一泳道加DNA分子量标记(ADNA/Hind111+EcoRI)，水平电泳琼脂糖凝胶浓度为0.80%，室温下电压30V电泳48h，凝胶在变性液(1.5MNaCl，O.5MNaOH)中变性40min后，用中和液(pH=7.0，1MTris-HCl，1.5MNaCl)中和两次各15min，然后进行毛细管转印，以硝酸纤维素膜为固相载体，转移液为10XSSC，转移48h后，膜用6XSSC漂洗5min，37。C烘干，8(TC烤膜1.5h。固定了由EcoRI酶酶切的基因组DNA片段的硝酸纤维素膜，在HybridizationIncubator中与杂交液(5XSSC，2%SDS，1%blockingreagent)在67。C下预杂交2h，，然后加入已标记并经变性处理的探针，同样67t:杂交20h，将膜取出，进行洗涤和显色反应，制备DNA指纹图谱(图2)。最后，在指纹图谱上选取清晰度较好的若干条带，用凝胶成像分析系统，计算出各条带的分子量，判别个体是否携带分子量为3.48kb的DNA指纹。实施例二EAV/DNA指纹图谱中长度为3.48Kb的条带J与的个体早期体重关系的研究经对多个品系研究表明，EAV/DNA指纹图谱中长度为3.48Kb的条带J的有无与个体早期体重的影响如表1、表2、表3、表4和表5，可见，无论京海黄鸡、新扬州鸡、萧山鸡，还是SR92A系鸡，其有J带的个体早期体重均小于无J带的，所以J带的有无可以作为筛选鸡早期体重增长程度的方法。表lJ带有无对京海黄鸡体重的影响5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注同一行不同字母表差异显著(P<0.05)，+、_表示该标记有无。表2J带有无对不同周龄新扬州鸡体重的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注同一性别不同大写字母表示差异极显著表3萧山X萧山不同J带组合各性能比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。表4条带J对SR92A系($)X萧山(罕)后代的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中同列不同字母表示差异显著(P〈0.05)，下同。表5SR92ASX萧山鸡罕不同J带型杂交组合屠宰性能比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例三在京海黄鸡品种培育过程中(该品种2009年通过国家新品种审定)，采用了本方法进行早期增重的选择，建立了有J带品系和无J带的品系。各世代根据J带有无进行了体重选择，其选择结果如表6和表7。同样说明J带的有无，其效应确实存在。表6京海黄鸡J+品系不同世代不同周龄体重<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表7京海黄鸡J-品系不同世代不同周龄体重<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求一种用DNA指纹筛选鸡早期体重增长程度的方法，其特征在于，提取待测样本的鸡基因组DNA，将经EcoRI限制性内切酶酶切的鸡基因组DNA进行电泳，电泳后转移到硝酸纤维素膜上，以标记的鸡EAVDNA片段为探针，进行Southern杂交，得DNA指纹图谱，根据图谱中长度为3.48Kb的条带的有无对待测样本的早期体重增长快慢进行判断。2.根据权利要求l所述的用DNA指纹筛选鸡早期体重增长程度的方法，其特征在于，所说的标记的鸡EAVDNA探针是通过随机引物标记法或PCR标记法制备。全文摘要本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种用DNA指纹筛选鸡早期体重增长程度的方法。该方法是提取待测样本的鸡基因组DNA，将经EcoRI限制性内切酶酶切的鸡基因组DNA进行电泳，电泳后转移到硝酸纤维素膜上，以标记的鸡EAVDNA片段为探针，进行Southern杂交，得DNA指纹图谱，根据图谱中长度为3.48Kb的条带的有无对待测样本的早期体重增长快慢进行判断。该方法对于鸡辅助育种、加快选择进展、培育新品种具有显著的效果。文档编号C12Q1/68GK101709333SQ20091026444公开日2010年5月19日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者刘向萍,张鹏,戴国俊,易洪琴,王金玉,盛浩伟,谢恺舟,龚允陈申请人:扬州大学