专利名称：Mbd重组蛋白及其表达方法
技术领域：
本发明涉及一种甲基化的CpG结合域(methyl-CpG-binding domain,MBD)蛋白重 组表达方法，属分子生物学和生物技术领域，特别涉及MBD重组蛋白及其表达方法。
背景技术：
DNA异常甲基化与基因表达沉默密切相关。人类的DNA甲基化主要发生在CpG 二 核苷酸上，形成甲基化的CpG 二核苷酸(mCpG)。甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)是一类能特异 识别mCpG,并与之结合的核蛋白。典型的MeCPs含有保守的甲基化DNA结合基序MBD，是与 mCpG结合的关键区域。MeCP2是MeCPs家族中第一个被发现的能特异结合甲基化DNA的蛋 白质。其N-末端含有一个约70个氨基酸的区域，能够选择性的结合甲基化的DNA，即MBD。 MBD能与甲基化的DNA特异结合，此特性可被应用于MBD亲和柱，甲基化芯片等甲基化研究 工具。在本发明之前，获得具生物学活性的MBD的高效重组表达一直是一个难题。不同 的表达方案都不可避免的存在着不足之处酵母和哺乳动物细胞等真核表达系统，操作繁 琐，且重组蛋白产量很低；以往普通的原核表达，尽管产量通常高于真核表达系统，但由于 大肠杆菌密码子的偏爱性，高效表达依然困难。此外，传统方法重组表达的MBD蛋白难以保 留天然MBD蛋白特异性结合甲基化DNA的生物学功能。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种MBD的重组蛋白及其表达方法。本发明的技术方案是MBD重组蛋白，其主要技术特征在于重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分 子量为63KDa，等电点为5. 03 ；其序列如下1 MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK61 PMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA121 EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA181 GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE241 AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE301 AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA361 LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS421 AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP481 PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGffTRKLKQ RKSGRSAGKY541 YFEKV⑶TSL DPNDFDFTVT GRGS。本发明的另一技术方案是MBD重组蛋白表达方法，其主要技术特征在于对人Mecp2的MBD区行密码子优化，
SELVNVAKKV RIDGFRKGKV PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF TffKEKDGAVE AEDRVTIDFT EFTIDVTFPE EYHAENLKGK VRKNMERELK SAIRNRVKSQ LELPRELFEE QAKRRVVVGL KNKELMD匪R NVALEEQAVE RGSGGIEGRH MDDDDKASAS DVYLINPQGK AFRSKVELIA并人工合成编码MBD的DNA，克隆至原核表达载体pCOLD-TF，转化大肠肝菌R0Setta-DE3，以 IPTG在15°C诱导表达，镍柱亲和纯化；具体步骤如下(1)对人Mecp2的MBD区的编码DNA序列进行优化，并人工合成核酸片段；(2)通过双酶切，将目的核酸亚克隆至原核表达载体pCOLD-TF上，构建重组表达 质粒 pCOLD-TF-MBD ； (3)重组表达质粒pCOLD-TF-MBD热激法转化感受态细胞Rosetta_DE3 ；(4)加入 IPTG，15°C诱导表达 20h ；(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5. 03 ；其序 列如下1MNHKVHHHHHHMQVSVETTQ GLGRRVTITIAADSIETAVKSELVNVAKKVRIDGFRKGKV
61PMNIVAQRYGASVRQDVLGD LMSRNFIDAIIKEKINPAGAPTYVPGEYKLGEDFTYSVEF
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541YFEKVGDTSLDPNDFDFTVT GRGS。本发明的优点和效果在于第一，通过密码子优化的方法，既克服了大肠肝菌的密码子偏爱的缺点；又显著降 低了 mRNA的二级结构，使得蛋白获得高表达；第二，选择的原核表达载体pCOLD-TF以TF肽段与目的蛋白融合，提高了 MBD的可 溶性，保证了其与甲基化DNA结合的生物学活性。本发明能高效表达MBD蛋白，所得MBD重组蛋白具有特异性结合甲基化DNA的生 物学功能。该蛋白能够被应用于MBD亲和柱，甲基化芯片等甲基化检测领域；对其深入研 究，还将有助于阐明甲基化所致的基因表达抑制的机理。本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。
图1—本发明中MBD诱导表达的SDS-PAGE电泳图。其中，1—蛋白分子量marker ；2—未经诱导的转化有pCOLD-TF-MBD重组质粒的Rosetta-gami (DE3)菌；3,4—经诱导的转化有 pCOLD-TF-MBD 重组质粒的 Rosetta-gami (DE3)菌。图2——本发明中纯化的MBD的SDS-PAGE电泳图。其中，1—未纯化的含MBD蛋白的细菌裂解物；
2—以20mM咪唑洗柱；3—以50mM咪唑洗脱；4—以250mM咪唑洗脱； Μ—蛋白分子量marker。图3—本发明中Western blot鉴定MBD蛋白示意图。以抗Hi s标签的抗体，行Western blot鉴定，在预计的分子量大小(约63KDa) 处有特异条带。图4一本发明中肽质量指纹图谱鉴定MBD蛋白示意图。肽质量指纹图谱检测结果与MBD蛋白序列比对，结果表明被检出的肽段覆盖目的 蛋白44%的区域。图5--本发明中利用Sra生物传感器鉴定MBD识别甲基化DNA的生物学功能示意 图。
具体实施例方式一、MBD的核酸序列优化、蛋白表达和纯化1. MBD核酸序列优化与合成人工合成密码子优化的MBD的核酸序列，并将其克隆在puc57载体上。优化的MBD 的核酸序列为5' -GCCAGCGCGA GCCCGAAACA GCGTCGTAGC ATTATTCGCG ATCGCGGCCC GATGTATGATGATCCGACCC TGCCGGAAGG CTGGACCCGT AAACTGAAAC AGCGTAAAAG CGGCCGTAGCGCGGGCAAAT ATGATGTGTA TCTGATTAAC CCGCAGGGTA AAGCGTTTCG TAGCAAAGTGGAACTGATTG CGTATTTTGA AAAAGTGGGC GATACCAGCC TGGATCCGAA CGATTTTGATTTTACCGTGA CCGGTCGTGG TAGC-3‘。2.亚克隆至表达载体pCOLD-TF，构建重组质粒pC0LD-TF_MBD碱裂法抽提质粒，Nde I和XhoI双酶切后克隆至表达载体pC0LD_TF，构建重组表 达质粒 pCOLD-TF-MBD。3.热激法转化大肠杆菌Rosetta (DE3)取1 μ 1 重组表达质粒 pCOLD-TF-MBD，加入 100 μ 1 感受态细胞Rosetta-gami (DE3) 中，轻轻吸打均勻，在冰上放置30min ；将离心管放置42°C水浴，热击90秒，快速将离心管转 移至冰浴，放置l_2min ；加入900 μ 1 LB培养基，在37°C摇床温和摇动温育45分钟，使细菌 复苏；取200 μ 1均勻涂布于Amp+的LB平板；倒置培养皿，于37°C培养12_16h ；挑取单菌 落，酶切、测序鉴定阳性克隆。4.诱导表达挑取阳性克隆接种于含3ml LB培养基的试管中，37°C振荡培养过夜。次日取过夜 培养物1 50比例转种于新鲜的Amp+LB培养液中，37°C振荡，至OD值达0.4时，将培养液 冷却至15°C，放置30min ；加入IPTG，使终浓度为0. 5mM ；继续在15°C诱导，振荡20h。5.超声破菌，镍柱亲和纯化蛋白4 V，4000rpm离心15min，沉淀细菌；预冷的PBS洗涤菌体，离心去上清，以 25mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)重悬，并加入 0. 1 倍体积的 10mg/mL 溶菌酶，4°C，30min ；超声
6破碎细菌(冰浴中)，功率小于100瓦，视菌液量调整破碎时间；4°C，IOOOOrpm离心15min，
收集上清。取出镍柱，用缓冲液1 (IOmM pH 7. 9的Tris-HCl缓冲液含0. 25M NaCl)平衡10个 柱床体积，控制流速为lml/min ；取步骤6所得上清，0. 45 μ m滤膜过滤，上样，流速为Iml/ min.用缓冲液1再洗10个柱床体积，流速为lml/min。用含50mM咪唑的缓冲液(又称缓 冲液2)，缓冲液2是在缓冲液1中加入的咪唑，使终浓度为50mM而得，洗脱5个柱床体积， 流速为2ml/min，收集洗脱峰。将洗脱液置于透析袋中，以20mM Tris缓冲液(pH 8. 0)为透析液，使透析袋中的 溶液体积不得超过透析液的1/20，4°C透析过夜，其间共更换5次透析液。二、MBD表达产物的SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定1. SDS-PAGE测定蛋白质分子量分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度5%，样品煮沸3min后加样电泳，同时加入标准分 子量作对照；开始电压为80V，样品浓缩成线进入分离胶后加大到120V，总共电泳约2. 5h， 剥胶后考马斯亮蓝染色；电泳后根据标准蛋白分子量和其相对迁移率在半对数坐标纸上作 分子量标准曲线，然后根据待测蛋白的相对迁移率从标准曲线上查知其分子量。如图1所示密码子优化的MBD重组蛋白于SDS-PAGE中电泳，结果表明经密码子 优化设计，MBD能在Rosetta-gami (DE3)菌中高水平表达。如图2所示镍柱亲和纯化密码子优化的MBD蛋白，以不同浓度的咪唑洗柱，当咪 唑浓度为50mM时，MBD的得率最高。2. Western blot 鉴定样品经SDS-PAGE后，将凝胶上蛋白条带在80V下转印2h，至硝酸纤维膜上；用1% BSA室温封闭lh，TBST洗膜，置杂交袋内，加1. 5mL TBST稀释的anti-His Mab (1 1000)， 37 °C温箱振荡孵育2h，TBST洗涤后加入1. 5mL酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP (1 4000), 37 °C 振荡孵育2h ；洗涤后加入1. 5mL底物液，振荡15min，待充分显色后，自来水冲洗终止反应。如图3所示以抗His标签的抗体，对密码子优化的MBD重组蛋白行Westernblot 鉴定，在预计的分子量大小(约63KDa)处有特异条带。三、MBD蛋白的肽质量指纹图谱鉴定1.蛋白斑点肽质量指纹谱的样品制备切取考马斯亮蓝染色的胶块上的目标蛋白点，用含50%乙腈，25mmol/L碳酸氢钠 振摇20min，脱去胶中蓝色，胶粒真空离心干燥，加入胰酶(0. 05 μ g/ μ L) 10 μ L，37°C保温 反应20h，5%三氟乙酸溶液120 μ L，于40°C保温lh，吸出上清液，2. 5%三氟乙酸、50%乙腈 溶液120 μ L，30°C保温lh，吸出上清液，合并上清液冰冻干燥。2.质谱分析冻干样品管中加5μ L 5%三氟乙酸溶液，与基质混勻后取1 μ L点于靶上做质谱 分析。进行Reflex IV MALDI-T0F质谱分析时，采用反射模式、正离子谱测定，离子源加速 电压1为20kV，加速电压2为18. 85kV，N2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取 500ns，真空度4Χ10_7Τοπ·，信号单次扫描累加50次，并用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子 峰作为内标校正质谱峰，获得肽质量指纹图谱。如图4所示密码子优化的MBD重组蛋白的肽质量指纹图谱检测结果与Genbank中MBD蛋白序列比对，结果表明被检出的肽段覆盖目的蛋白44%的区域。四、利用表面等离 子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)生物传感器鉴定MBD识别甲基化DNA的生物学 功能1.扫描基线SPR 常流缓冲液 HBS-EP (IOmM HEPES, 150mM NaCl，3mM EDTA, 0. 005 % P20, pH 7. 40)，200 μ 1/min冲洗包被有亲和素的SI3R芯片，20min ；再以5 μ 1/min，缓缓流过芯片， SI3R实时扫描。2.甲基化核酸固定于SPR芯片表面待基线平稳(波动小于士 5m° )，一般需5-lOmin，取200 μ 1 0. 4 μ M的生物素标 记的甲基化DNA mAPC48,以5 μ 1/min的速度进样，流经包被有亲和素的SI3R芯片；由于生 物素和亲和素间强烈的相互作用，核酸被固定于芯片表面；同时取等体积相同浓度的生物 素标记的非甲基化DNA APC48，相同方式进样，作为阴性对照，STO实时扫描。mAPC48 的序列为(M 为 5mC)5 ‘ -biotin-CCMGTMGGGAGCCMGCMGATTGGCTGGGTGTGGGMGCAMGTGACMGAC-3‘APC48的序列为5 ‘ -biotin-CCCGTCGGGAGCCCGCCGATTGGCTGGGTGTGGGCGCACGTGACCGAC-3‘3.进MBD识别甲基化DNA待核酸样品，进样完毕，以5μ 1/min速度，将HBS-EP缓缓流过芯片，约5min。取 50 μ 1 50 μ g/mL的MBD以5 μ 1/min的速度进样，SPR实时扫描。由于MBD能特异识别并结 合甲基化的CpG位点，包被有甲基化DNA的流池Sra角明显升高。如图5所示MBD进样后，SPR生物传感器上包被有甲基化DNA的通道SI3R角明显 抬高，而包被非甲基化DNA的通道Sra角保持原水平不变，结果表明重组表达的MBD具有特 异性识别甲基化DNA的生物学功能。本发明请求保护的范围并不仅仅局限于本具体实施方式
的说明。
权利要求
MBD重组蛋白，其特征在于重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其序列如下 1MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV 61PMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF121EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA TWKEKDGAVE AEDRVTIDFT181GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE EFTIDVTFPE EYHAENLKGK241AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE VRKNMERELK SAIRNRVKSQ301AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA LELPRELFEE QAKRRVVVGL361LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS KNKELMDNMR NVALEEQAVE421AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP RGSGGIEGRH MDDDDKASAS481PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGWTRKLKQ RKSGRSAGKY DVYLINPQGK AFRSKVELIA541YFEKVGDTSL DPNDFDFTVT GRGS。
2.MBD重组蛋白表达方法，其特征在于对人Mecp2的MBD区行密码子优化，并人工合 成编码MBD的DNA，克隆至原核表达载体pCOLD-TF，转化大肠肝菌Rosetta_DE3，以IPTG在 15°C诱导表达，镍柱亲和纯化，获得具有特异性结合甲基化DNA功能的MBD蛋白；具体步骤 如下(1)对人Mecp2的MBD区的编码DNA序列进行优化，并人工合成核酸片段；(2)通过双酶切，将目的核酸亚克隆至原核表达载体pCOLD-TF上，构建重组表达质粒 pCOLD-TF-MBD ；(3)重组表达质粒pCOLD-TF-MBD热激法转化感受态细胞Rosetta_DE3；(4)加入IPTG，15°C诱导表达20h；(5)超声破菌，裂解物上样于镍亲和柱，纯化目的蛋白，并透析；重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5. 03 ；其序列如下1MNHKVHHHHH HMQVSVETTQ GLGRRVTITI AADSIETAVK SELVNVAKKV RIDGFRKGKV 6IPMNIVAQRYG ASVRQDVLGD LMSRNFIDAI IKEKINPAGA PTYVPGEYKL GEDFTYSVEF 121EVYPEVELQG LEAIEVEKPI VEVTDADVDG MLDTLRKQQA TffKEKDGAVE AEDRVTIDFT 181GSVDGEEFEG GKASDFVLAM GQGRMIPGFE DGIKGHKAGE EFTIDVTFPE EYHAENLKGK 241AAKFAINLKK VEERELPELT AEFIKRFGVE DGSVEGLRAE VRKNMERELK SAIRNRVKSQ 301AIEGLVKAND IDVPAALIDS EIDVLRRQAA QRFGGNEKQA LELPRELFEE QAKRRVVVGL 361LLGEVIRTNE LKADEERVKG LIEEMASAYE DPKEVIEFYS KNKELMD匪R NVALEEQAVE 421AVLAKAKVTE KETTFNELMN QQASAGLEVL FQGPSAGLVP RGSGGIEGRH MDDDDKASAS 481PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGffTRKLKQ RKSGRSAGKY DVYLINPQGK AFRSKVELIA 54IYFEKV⑶TSL DPNDFDFTVT GRGS。
3.根据权利要求2所述的MBD重组蛋白表达方法，其特征在于步骤⑴是根据 大肠杆菌密码子偏爱性对MBD编码序列进行优化，优化后并被用于表达的人工合成 核酸序列为5 ‘ -GCTAGCGCGA GCCCGAAACA GCGGCGTAGC ATTATTCGCG ATCGCGGCCC GATGTATGATGATCCGACCC TGCCTGAAGG CTGGACCCGT AAACTGAAAC AGCGTAAAAG CGGCCGTAGCGCGGGCAAAT ATGATGTGTA TTTGATTAAC CCGCAGGGTA AAGCGTTTCGTAGCAAAGTGGAACTGATTG CGTATT TTGA AAAAGTGGGC GACACCAGCC TGGATCCGAA CGATTTTGATTTTACCGTGA CCGGTCGTGG GAGC-3‘。
全文摘要
本发明涉及MBD重组蛋白及其表达方法。本发明重组表达的MBD蛋白由564个氨基酸组成，分子量为63KDa，等电点为5.03；其表达方法是对人Mecp2的MBD区行密码子优化，并人工合成编码MBD的DNA，克隆至原核表达载体pCOLD-TF，转化大肠肝菌Rosetta-DE3，以IPTG在15℃诱导表达，镍柱亲和纯化。本发明解决了酵母和哺乳动物细胞等真核表达系统的操作繁琐、重组蛋白产量很低，以及高效表达依然困难、难以保留天然MBD蛋白特异性结合甲基化DNA的生物学功能等缺陷。本发明克服了大肠肝菌的密码子偏爱的缺点，显著降低了mRNA的二级结构，使得蛋白获得高表达，选择的原核表达载体pCOLD-TF以TF肽段与目的蛋白融合，提高了MBD的可溶性，保证了其与甲基化DNA结合的生物学活性。
文档编号C12R1/19GK101985466SQ20091026418
公开日2011年3月16日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者丁清清, 夏文颖, 张美娟, 徐婷, 徐建, 潘世扬, 王芳, 赵纯, 黄蕾 申请人:潘世扬