专利名称：一种豇豆重花叶病毒反转录pcr分子检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus, CPSMV)检测的 试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
豇豆重花叶病毒(CPSMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)豇豆花叶病毒属 (Comovirus)的确定种。该病毒的自然寄主为豆科植物，可严重侵染豇豆、大豆等多种作物。 该病毒侵染豇豆后，可造成叶片花叶和斑驳，严重的可导致整株枯死；在田间对豇豆的侵染 率可达100%，造成产量损失可达50%。目前CPSMV主要分布在美洲地区，如美国、巴西、秘鲁、委内瑞拉、特立尼达、波多 黎各、哥斯达黎加和苏里南等国，中国尚无发生与危害的报道。CPSMV可通过种子进行远距离传播，其中豇豆的种传率为10 %，长豇 豆(Vignasesquipedalis)的种传率为8 % ；在田间，该病毒还可以通过菜豆叶甲 (Ceratomatrifurcata),带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)禾口南美叶甲(D. speciosa) 等媒介昆虫及机械传播。该病毒的自然寄主在中国广泛种植，且气候条件与该病毒发生地 的气候条件相似，因此，CPSMV传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随种子的调运或害虫 的迁移而在国内传播。CPSMV已成为我国豆科植物尤其是豇豆和大豆生产潜在的巨大威胁。鉴于该病毒的自然寄主豇豆和大豆等为中国的主要经济作物，能够对其造成很大 的危害，中国已将该病毒列入“中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录”。目前，CPSMV多采用DAS-ELISA试剂盒(即双抗夹心酶联免疫吸附法)检测，但该 方法不够快速、灵敏、准确，难以适合检疫口岸使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种适宜于检疫口岸使用的豇豆重花叶病毒反转录PCR分 子检测试剂盒，以便于口岸简便、快速、准确地对进口的豇豆种子进行豇豆重花叶病毒的检 测。本发明从豇豆种子或植株中提取病毒RNA，进行豇豆重花叶病毒RT-PCR检测。本发明提供一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，包括如下试剂 dNTP 混合物、无 RNase 的 ddH20、5XRT Buffer、RNase 抑制剂、反转录酶、IOXPCR Buffer、 MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH20 ；所述CPSMVf序列 为 5，-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中 R = A 或 G，N = I (次黄嘌呤核苷酸)，M = A 或 C ； 所述CPSMVr序列为5，-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3，，其中N = I (次黄嘌呤核苷酸)，R = A 或G。该豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，还含有用作阳性对照的豇豆重花 叶病毒冻干粉。
本发明还提供利用所述试剂盒检测豇豆重花叶病毒的方法，包括如下步骤(1)分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA ；(2)反转录反应以步骤⑴所述样品RNA为模板，以CPSMVr为引物进行反转录反应，获得反转录产物；阳性对照中的模板为所述的豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA ；(3)以步骤⑵所述的反转录产物为模板，以CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反 应，获得PCR产物；(4)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR电泳图谱中，对应于样品RNA的泳道 在356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了 CPSMV。步骤⑵所述反转录反应步骤为在PCR管中配制反转录反应液，其组成为IyL 浓度为10 μ M的CPSMVr，1 μ L浓度为l(kimol/L的dNTP混合物，样品RNA，用无RNase的 ddH20补足体系至10 μ L ；反应程序为65°C反应5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中继续 添加如下成分4 μ L的5 X RT Buffer, 0. 5 μ L浓度为40U/ μ L的RNase抑制剂，1 μ L浓度 为 200U/ μ L 的 RTase，4· 5μ L 无 RNase 的 ddH20,反应程序为42°C 反应 60min，70°C 反应 15min。步骤(3)所述PCR反应体系的组成为2 μ L的10XPCR Buffer (不含Mg2+)、2 μ L 浓度为25mM的MgCl2、2 μ L浓度为2. 5mM的dNTP混合物、浓度为20 μ M的CPSMVf和CPSMVr 各0. 5 μ L、0. 2 μ L浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶以及2 μ L所述反转录产物，以ddH20补 足体系至20μ L ；所述PCR反应程序为94°C预变性3min ；94°C变性45s，52°C复性45s，72°C 延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸5min。本发明提供的豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法。利用从 美国菌种保藏中心(ATCC)引进CPSMV标准菌种，经测序后，综合已知的GeneBank中CPSMV 外壳蛋白基因序列设计了一对特异性的简并引物，能较好地扩增出目标条带。该方法具有 快速、操作简便，特异性好、重复性高等优点。针对该病毒可以通过种子传播的特点，对豇豆 种子或植株都可以直接进行检测。本发明适合对进出境豇豆等豆类蔬菜种子及种苗中豇豆 重花叶病毒的检测，在各植物检疫口岸具有良好的应用前景。
图1用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒(CPSMV)的电泳图谱，其中M(bp)为 marker, ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，+为阳性对照(CPSMV)，1为感染CPSMV的豇豆种子， 2为感染CPSMV豇豆叶片。图2采用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒的特异性验证电泳图谱，其中M(bp) 为marker，ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，+为阳性对照(CPSMV)，1为豇豆花叶病毒，2为 菜豆荚斑驳病毒，3为烟草环斑病毒，4为黑眼豇豆花叶病毒，5为大豆花叶病毒；图3用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒(CPSMV)的灵敏度电泳图谱，其中M(bp) 为marker，ck为阴性对照(灭菌双蒸水)，1 8分别对应的是总RNA量lOOng、10ng、lng、 lOOpg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg ；
具体实施例方式实施例1豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒
本发明豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒的组成如下dNTP 混合物(10mmol/L)、无 RNase 的 ddH20、5XRT Buffer、RNase 抑制剂(40U/ μ L)、RTase (200U/ μ L)、10 X PCR Buffer (不含 Mg2+)、MgCl2 (25mM)、dNTP 混合物(2. 5mM)、 CPSMVr (10 μ Μ)、CPSMVf (20 μ Μ)、CPSMVr (20 μ Μ)、Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L)、ddH20 禾口阳性 对照。其中CPSMVf，CPSMVr 设计过程如下如何通过 GeneBank (http //www. ncbi. nlm. nih.gov)检索，根据CPSMV外壳蛋白编码基因(登录号NC003544、M83309)中的保守序列 设计一对寡核苷酸引物，以CPSMV (美国菌种保藏中心标准菌种编号PV-273)为模板经反转 录PCR(RT-PCR)扩增出产物后测序，根据测序结果以及GeneBank中CPSMV外壳蛋白编码基 因(登录号NC003544、M83309、AF263549、GQ229416)设计如下一对豇豆重花叶病毒的特异 性寡核苷酸简并引物上游引物(CPSMVf) :5，-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3，，其中R = A或G、 N=I(次黄嘌呤核苷酸)、M = A 或 C)；下游引物(CPSMVr) 5，-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3，， 其中N = I (次黄嘌呤核苷酸)，R = A或G。引物CPSMVf和CPSMVr预期的扩增产物大小 为356bp。引物CPSMVf和CPSMVr由金思特科技(南京)有限公司合成。阳性对照为豇豆重花叶病毒冻干粉，其制备方法为利用CPSMV标准毒株(美国菌 种保藏中心编号PV-273)为材料，接种健康的感病豇豆品种(Blackeye EarlyRamshorn)。 植株发病后，采集发病的豇豆叶片，以1 5 (m/v)的比例加入样品抽提缓冲液，充分研磨成 勻浆，制备成病汁液。将病汁液置于70°C水浴锅中，处理10分钟，使病毒灭活。然后将病汁 液分装于安瓿瓶中，_40°C冷冻固化后，放入冷冻干燥机中，在_50°C、真空度0. 04mBar的条 件下冷冻干燥60小时，制备成豇豆重花叶病毒冻干粉。其中抽提缓冲液的成分如下2% (质量浓度)聚乙烯基吡咯烷酮，0.05% (质量 浓度)吐温-20，ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液(0. 01mol/L)。其他试剂按照本领域内常规方法制备。实施例2利用本发明试剂盒检测感病的豇豆叶片和种子样品1.分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA采用Trizol法分别提取样品及豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。利用CPSMV标准毒株(美国菌种保藏中心编号PV-273)为材料，接种感病豇豆品 种(Blackeye Early Ramshorn)，发病后，采集叶片及发病种子，以发病植株的种子和叶片 为样品。种子样品的制备根据豇豆感染该病毒后的症状特点，挑选粒小，粒瘪等症状的种 子，经3% (m/v)次氯酸钠表面消毒IOmin后，用无菌水洗涤三次，选取种胚，加入液氮，充分 研磨成粉状，制成样品。叶片样品的制备豇豆出苗至第一对真叶展平后，选取有疑似症状的植株的叶片， 加入液氮，充分研磨成粉状，制成样品。采用Trizol法分别提取样品称取20mg样品，迅速将其移入灭菌的1. 5ml离心管 中，加入ImL TRIzoL试剂(Invitrogen公司产品)剧烈震荡摇勻3min后，在4°C、离心力 12000g的条件下离心lOmin，取上清液，加入0. 2mL氯仿，上下颠倒混勻，室温静置3min ；然 后再次4°C、12000g条件下离心lOmin，取上层水相，加等体积的异丙醇，颠倒混勻；在4°C、 12000g离心力的条件下离心lOmin，弃上清；加75% (体积浓度)的乙醇洗涤沉淀，在4°C、离心力7500g的条件下离心2min，弃乙醇；将沉淀在室温下充分干燥后，溶于30 μ L经焦碳 酸二乙酯处理的双蒸水(ddH20)中，置于-20°C保存备用。豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA的提取方法同上。2.反转录反应在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyL
RNA (步骤1提取得到)1 μ g无RNase的ddH20 补足体系至10 μ L在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应65°C反应5min，冰上急冷。在上述PCR管中继续添加如下成分5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/ μ L) : 1 μ L无 RNase 的 ddH20 :4· 5 μ L反转录反应总体积20 μ L反转录反应条件42°C反应60min，70°C反应15min。注阳性对照中的模板是豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA，阴性对照为灭菌双蒸水。3.豇豆重花叶病毒的特异性PCR扩增按下列组分配制PCR反应体系(20 μ L)10 X PCR Buffer (Mg2+-free) :2 μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2· 5mM each) :2 μ LCPSMVf (20 μ Μ) :0· 5 μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0· 5 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反转录产物)2yLddH20 补足体系至 20 μ L反应条件为94°C预变性3min ；94°C变性45s，52°C复性45s，72°C延伸lmin，35个 循环；最后72°C延伸5min。此PCR反应的阳性对照为步骤2中的阳性对照产物。4.结果分析取8 μ 1 PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析系统上观察、拍照并记录结果。电泳结果(图1)表明，发病植株的种子和叶片均扩增出356bp的 特异性条带，并与阳性对照大小一致，表明所检测的样品为阳性，也说明本发明提供的试剂 盒可以用来检测豇豆重花叶病毒。实施例3利用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒反转录PCR的特异性1.特异性验证材料及病毒RNA提取选取与豇豆重花叶病毒同属(豇豆花叶病毒属Comovirus)的豇豆花叶病毒(CPMV)和菜豆荚斑驳病毒(BPMV)，同科(豇豆花叶病毒科Comoviridae)的另外一个线 虫传多面体病毒属(N印ovirus)烟草环斑病毒(TRSV)，豇豆上另外一个重要种传病毒马 铃薯Y病毒属的黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)以及大豆花叶病毒(SMV)，进行豇豆重花叶病 毒(CPSMV)RT PCR特异性验证。以上这些病毒毒源来源于美国典型微生物菌种保藏中心 (American Type Culture Collection，简称 ATCC)。病毒 RNA 的提取采用 Trizol 方法提 取。2.反转录反应在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyLRNA 1 μ g无RNase的ddH20 补足体系至10 μ L在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应65°C反应5min，冰上急冷。在上述PCR管中配制下列反转录反应液5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/μ L) =IyL无 RNase 的 ddH20 :4· 5 μ L反转录反应总体积20 μ L反转录反应条件42°C反应60min，70°C反应15min。注阴性对照为灭菌双蒸水。3.豇豆重花叶病毒的特异性PCR扩增按下列组分配制PCR反应体系(20 μ L)10XPCR Buffer(Mg2+-free) :2μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2. 5mM each) 2. μ LCPSMVf (20 μ Μ) :0· 5 μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0· 5 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反转录产物)2yLddH20 补足反应总体积20 μ L反应条件为94°C预变性3min :94°C变性45s，52°C复性45s，72°C延伸lmin，35个 循环最后72°C延伸5min。此PCR反应阳性对照为步骤2中的阳性对照产物。4.结果分析结果如图2，只有CPSMV在356bp处有扩增片段，而其他五个病毒均无扩增，表明用本发明提供的试剂盒来检测豇豆重花叶病毒能满足PCR特异性反应的要求。实施例4利用本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒反转录PCR方法的灵敏度
1.分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA样品为CPSMV标准毒株(美国菌种保藏中心编号PV-273)感染的豇豆叶片。采用Trizol法分别提取样品及豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。2.反转录反应在PCR管中配制下列混合液CPSMVr(IOyM) =IyLdNTP 混合物(10mmol/L) =IyLRNA (步骤1提取得到)500ng无RNase的ddH20 补足体系至10 μ L在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应65°C反应5min，冰上急冷。在上述PCR管中继续添加如下成分5 X RT Buffer :4μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L) :0· 5 μ LRTase (200U/μ L) =IyL无 RNase 的 ddH20 :4. 5 μ L反转录反应总体积20 μ L反转录反应条件42°C反应60min，70°C反应15min。注阳性对照中的模板是豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA。阴性对照为灭菌双蒸水。3. PCR 反应反转录获得的CDNA溶液用EASY Dilution (TAKARA公司产品)按10倍梯度逐级稀 释，各取2 μ L进行PCR反应。此时20 μ L PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于lOOng、 10ng、lg、100pg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg的总RNA量。此PCR反应的阳性对照为步骤2中 的阳性对照产物。按下列组分配制PCR反应体系(20 μ L)10ΧPCR Buffer (Mg2+-free) :2 μ LMgCl2(25mM) :2μ LdNTP 混合物(2· 5mM each) :2 μ LCPSMVf (20 μ Μ) 0. 5μ LCPSMVr (20 μ Μ) :0. 5μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) :0· 2 μ L模板(反转录产物)2yLddH20 补足体系至 20 μ L反应条件为94°C预变性3min ；94°C变性45s，52°C复性45s，72°C延伸lmin，35个 循环；最后72°C延伸5min。4.结果分析PCR反应产物的电泳结果表明，总RNA量从IOOng至Ipg均能扩增出356bp的目的片段，表明本发明试剂盒检测豇豆重花叶病毒的灵敏度可达Ipg的总RNA量(如图3)。SEQUENCE LISTING<110>江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
<120> 一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法<130>JSCHJ0904<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPSMVf<220><221>misc_feature - - _<222>(9). . (9)<223>n = i<220><221>misc_feature<222>(12). . (12)<223>n = i<220><221>misc_feature<222>(15). . (15)<223>n = i<400>1acacargtnm gnccngatac 20<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>CPSMVr<220><221>misc_feature<222>(6). . (6)<223>n = i<400>2
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权利要求
一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，包括如下试剂dNTP混合物、无RNase的ddH2O、5×RT Buffer、RNase抑制剂、反转录酶、10×PCR Buffer、MgCl2溶液、上游引物CPSMVf、下游引物CPSMVr、Taq DNA聚合酶和ddH2O；所述CPSMVf序列为5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，其中R＝A或G，N＝次黄嘌呤核苷酸，M＝A或C；所述CPSMVr序列为5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，其中N＝次黄嘌呤核苷酸，R＝A或G。
2.根据权利要求1所述的豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒，其特征在于还 含有用作阳性对照的豇豆重花叶病毒冻干粉。
3.一种采用权利要求2所述的试剂盒检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于包括如 下步骤(1)分别提取样品及所述豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA；(2)反转录反应以步骤(1)所述样品RNA为模板，以CPSMVr为引物进行反转录反应， 获得反转录产物；阳性对照中的模板为所述的豇豆重花叶病毒冻干粉的RNA ；(3)以步骤(2)所述的反转录产物为模板，以CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反应， 获得PCR产物；(4)取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若PCR电泳图谱中，对应于样品RNA的泳道在 356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了 CPSMV。
4.根据权利要求3所述的检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于步骤(2)所述反 转录反应步骤为在PCR管中配制反转录反应液，其组成为样品RNA、1 μ L浓度为10 μ M的 CPSMVr和1 μ L浓度为10mmol/L的dNTP混合物，用无RNase的ddH20补足体系至10 μ L ； 反应程序为65°C反应5min，冰上急冷；然后在上述PCR管中继续添加如下成分4yL的 5 X RT Buffer,0. 5 μ L 浓度为 40U/ μ L 的 RNase 抑制剂、1 μ L 浓度为 200U/ μ L 的 Rtase 禾口 4. 5μ L无 RNase 的 ddH20，反应程序为42°C 反应 60min，70°C 反应 15min。
5.根据权利要求3或4所述的检测豇豆重花叶病毒的方法，其特征在于步骤(3)所述PCR反应体系的组成为2yL的10XPCR Buffer、2 μ L浓度为25mM的MgCl2、 2 μ L浓度为2. 5mM的dNTP混合物、浓度为20 μ M的CPSMVf和CPSMVr各0. 5 μ L、0. 2 μ L浓 度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和2 μ L所述反转录产物，以ddH20补足体系至20 μ L ；所述 PCR反应程序为94°C预变性3min ；94°C变性45s，52°C复性45s，72°C延伸lmin，35个循环； 最后72°C延伸5min。
全文摘要
本发明提供一种豇豆重花叶病毒反转录PCR分子检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。试剂盒包括引物CPSMVf和CPSMVr；CPSMVf为5’-ACACARGTNMGNCCNGATAC-3’，R＝A或G，N＝I，M＝A或C；CPSMVr为5’-GCTACNGGACTRCTRCTCA-3’，N＝I，R＝A或G。检测步骤提取样品RNA，以CPSMVr为引物进行反转录反应；以反转录产物为模板，CPSMVf和CPSMVr为引物进行PCR反应，并进行电泳，若样品RNA在356bp处有特异性扩增条带，则该样品感染了CPSMV。该方法具有快速、操作简便，特异性好、重复性高等优点。
文档编号C12Q1/70GK101824485SQ200910264108
公开日2010年9月8日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者吴翠萍, 安榆林, 李彬, 李艳华, 杨静, 粟寒, 郑斯竹, 陈贯源 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心