眼的基因治疗的制作方法

专利名称：眼的基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用基因疗法治疗视网膜疾病的方法。本发明还涉及用于治疗视网膜疾病的载体，更特别是反转录病毒载体。
发明概述本发明提供治疗个体视网膜疾病的方法，包括，在患有视网膜疾病的个体中，使该个体眼组织中的体内内皮抑制素(endostatin)浓度升高至治疗该视网膜疾病的有效量。
在一种优选方面中，内皮抑制素为内皮抑制素或内皮抑制素活性片段。
在另一种优选方面中，用于本发明方法中的内皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。在另一种优选方面，该内皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的变体。这样的活性片段及变体列在，例如，美国专利6 174 861中，将该公开文本全文引入本文。
在另一种优选方面中，本发明指向治疗个体视网膜疾病的方法，包括，在患有视网膜疾病的个体中，使该个体眼组织(尤其是视网膜组织)中的体内内皮抑制素浓度升高至有效量，其中这种提高是通过向个体施用外源内皮抑制素来实现的。
在另一种优选方面中，本发明指向治疗个体视网膜疾病的方法，包括，在患有视网膜疾病的个体中，使该个体眼组织(尤其是视网膜组织)中的体内内皮抑制素浓度升高至有效量，其中这种提高是通过使个体内产生内皮抑制素来实现的。在一种更为优选的方面中，这种提高是通过向个体施用有效量的含内皮抑制素编码核酸的病毒载体来实现的。在一种最为优选的方面中，该病毒载体选自腺病毒——例如无病毒基因的腺病毒(gutless adenovirus)、腺伴随病毒、反转录病毒、和慢病毒，并经眼内或眼周给药。
在另一种优选方面中，本发明涉及治疗个体视网膜疾病的方法，包括，在患有视网膜疾病的个体中，使该个体眼组织(尤其是视网膜组织)中的体内内皮抑制素浓度升高至有效量，其中这种提高是通过向个体内植入至少一个微囊来实现的，其中该微囊含有分泌内皮抑制素的细胞。
视网膜疾病包括，例如，视网膜脱离和视网膜水肿(retinaledema)，包括黄斑水肿(macular edema)。
发明详述内皮抑制素是XVIII型胶原蛋白的切割产物，已发现它能抑制肿瘤血管发生和生长。干扰素α2a也阻断肿瘤血管发生并导致血管瘤退化，但是对脉络膜新生血管形成(CNV)无效。本发明人已经令人惊奇且不可预料地发现，提高个体眼组织中的体内内皮抑制素浓度可以治疗象视网膜脱离和视网膜水肿，包括黄斑水肿，这样的视网膜疾病。
因此，本发明提供视网膜疾病，例如，视网膜脱离和视网膜水肿，包括黄斑水肿，的预防性及治疗性治疗方法。“治疗”包括预防性和治疗性治疗两者。“预防性”意指，针对视网膜疾病，例如，视网膜脱离和视网膜水肿，包括黄斑水肿，的完全或部分防护。“治疗性”意指视网膜疾病自身的改善，以及，针对进一步视网膜疾病或已经存在的疾病的恶化的完全或部分防护。本发明尤其可以用于治疗视网膜脱离和视网膜水肿，包括黄斑水肿。
如本文所使用的，内皮抑制素的“视网膜疾病抑制有效量”是可以导致以下任何或全部结果的内皮抑制素量1)视网膜血管渗透性降低；2)视网膜厚度降低；或3)对视网膜脱离的完全抑制或使视网膜脱离程度降低。
本文所使用的术语“编码内皮抑制素的DNA序列”意指编码全长内皮抑制素或内皮抑制素的活性片段、衍生物、或类似物的DNA，例如，这样的DNA可以是编码全长内皮抑制素的全长基因、或截短基因、或编码这样的内皮抑制素的具有内皮抑制素活性的片段或衍生物或类似物的突变基因。术语“DNA序列”通常指多聚脱氧核糖核苷酸分子，且更特别指通过相邻戊糖上3′和5′碳原子间的磷酸二酯键一个一个相连的脱氧核糖核苷酸线性系列。
因此，在一种实施方式中，本发明指向编码内皮抑制素或其具有内皮抑制素活性的片段、衍生物或类似物的DNA序列。
美国专利号5 854 205中显示并描述了编码内皮抑制素的DNA序列或其片段或衍生物，该文全文引入本文作为参考。
术语“内皮抑制素”指分别根据非还原性和还原性凝胶电泳测定其大小优选为18kDa至20kDa的蛋白质。术语内皮抑制素还包括该18kDa至20kDa蛋白质的活性前体形式。人内皮抑制素的全长氨基酸序列示于SEQ ID NO1中。编码人内皮抑制素的核酸序列示于SEQ IDNO2中。小鼠内皮抑制素的氨基酸序列，加上小鼠Igκ引导序列，示于SEQ ID NO3中。编码小鼠内皮抑制素和小鼠Igκ引导序列的核酸序列示于SEQ ID NO4中。
术语内皮抑制素还包括该18kDa至20kDa蛋白质的片段以及具有基本相似氨基酸序列的经修饰的蛋白质和肽，而且它们能够抑制内皮细胞的增殖。例如，氨基酸的沉默置换(其中某氨基酸用一个结构上或化学上相似的氨基酸进行替代不会显著改变该蛋白质的结构、构象或活性)是本领域熟知的。这样的沉默置换意将落入所附权利要求范围内。
可以理解，术语“内皮抑制素”包括缩短的多肽，其中从全长内皮抑制素(也即，具有SEQ ID NO1的多肽)的任一个或两个末端、或从该蛋白质内部除去了一或多个氨基酸，然而所产生的分子仍然保持抑制内皮细胞增殖和/或治疗视网膜脱离、视网膜水肿、和/或眼新生血管形成的效力。这种缩短的多肽在本文中称作“片段”。术语“内皮抑制素”还包括延长的蛋白质或肽，其中在内皮抑制素的任一个或两个末端、或在该蛋白质内部增加了一或多个氨基酸，然而所产生的分子仍然保持内皮增殖的抑制活性。这样的分子，例如在第一位增加了酪氨酸的分子，对于利用例如125J进行标记是有用的。用其它放射性同位素进行的标记可用于为破坏包含内皮抑制素受体的靶细胞提供分子工具。用“靶向”分子例如蓖麻毒蛋白进行标记可以为破坏带有内皮抑制素受体的细胞提供一种机制。延长的内皮抑制素多肽、或已经经过共价修饰的内皮抑制素多肽，在本文中统称为内皮抑制素“衍生物”。
“基本序列同源性”意指内皮抑制素类似物序列和内皮抑制素序列的氨基酸残基序列间至少约70％的同源性，优选至少约80％的同源性，更优选至少约90％的同源性。
术语内皮抑制素的定义中还包括对内皮抑制素蛋白及其肽片段的修饰。这样的修饰包括其它分子，包括但不限于天然或非天然存在的氨基酸，对特定位点天然存在的氨基酸的取代。这样的取代可能改变内皮抑制素的生物活性并产生生物学或药理学激动剂或拮抗剂。这样的修饰多肽在本文中称作“变体”。已经显示出具有抗肿瘤效应和/或抗血管形成效应的内皮抑制素变体、衍生物、和片段是已知的并且已被报道，例如，在已出版的国际专利申请号WO0067771、WO0063249、WO9931616、WO9929855、和WO9948924中，将这些公开文本全文引入本文作为参考。这样的内皮抑制素变体、衍生物、和片段也可用在本发明的方法中。
可以在本发明实践中使用的多肽可以通过常规的药物制剂施用给需要治疗的个体。
本发明另外一种实施方式涉及为上面所讨论的任何一种治疗效果而施用药物组合物，与药学上可接受的载体一起。这样的药物组合物可以由内皮抑制素(例如，内皮抑制素)、或内皮抑制素的抗独特型抗体、或内皮抑制素模拟物组成。这些组合物可以单独或与至少一种其它物质，例如稳定化化合物，一起施用，它们可以在任何无菌的、生物相容的药学载体，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、和水，中进行施用。这些组合物可以单独、或与其它物质、药物或激素一起施用给患者。
本发明的药物组合物可以通过任何途径进行给药，包括但不限于，经眼内、眼周、口服、静脉内、肌内、关节内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、或直肠途径。
除活性成分外，这些组合物还可以包含适宜的药学可接受载体——包括可以使活性化合物便于被加工成可以在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。在最新出版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中可以找到有关制剂和给药的进一步技术细节。
口服药物制剂可以按如下得到通过将活性化合物与固体赋形剂组合，可选地对所得混合物进行研磨，并且在加入适宜助剂(如果需要的话)后对颗粒混合物进行加工得到片剂或糖衣丸核。适宜赋形剂为碳水化合物或蛋白质填充剂，比如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；来自玉米、小麦、稻、土豆、或其它植物的淀粉；纤维素，比如甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素钠；树胶包括阿拉伯胶和黄芪胶，以及象明胶或胶原蛋白等这样的蛋白质。如果想要的话，可以添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、或其盐，比如藻酸钠。
糖衣丸核可与其它适宜的包衣结合使用，比如浓缩糖溶液，它还可包括阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、lacquer溶液，和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖片包衣中可以加入染料或色素便于产物鉴别或表示活性化合物的量，即，剂量。
可以口服的药物制剂包括用明胶制成的push-fit胶囊，以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。Push-fit胶囊可以包含与填充剂或结合剂，比如乳糖或淀粉，润滑剂，比如滑石粉或硬脂酸镁，混合的活性成分，以及可选地包含，稳定剂。在软胶囊中，化合物可以溶解或悬浮在适宜的液体，比如油脂、液体、或含或不合稳定剂的液态聚乙二醇中。
适于肠胃外给药的药物剂型可以在水溶液中配制，优选在生理学上可接受的相容缓冲液例如Hanks’溶液、Ringer’s溶液、或生理缓冲盐水中。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇、或右旋糖酐。此外，活性化合物悬液可适当制成油性注射悬液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括油脂，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可以用于运输。可选地，该悬浮液还包含适宜的稳定剂或提高化合物可溶性的试剂以得以制成高浓度的溶液。
对于局部或鼻给药，制剂中可以使用适于待渗透的特定屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
可以通过本领域公知的方式，例如，通过常规的混合、溶解、颗粒化、制成糖丸、乳化、包囊化、截留、或冻干过程，生产本发明的药物组合物。
该药物组合物可以以盐的形式提供，并可以与许多酸形成盐，这些酸包括但不限于，盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸，等。盐与相应的游离碱形式相比在水性或其它质子溶剂中倾向于更加可溶。在其它情况中，优选制剂可能是包含以下任一或全部成分的冻干粉末1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、和2-7％甘露醇，pH范围4.5至5.5，使用前与缓冲液混合。
药物组合物制好后可以置于适宜容器中并为指定状况的治疗作标记。对于内皮抑制素的给药，这样的标记应当包括剂量、次数、和给药方法。
适于在本发明中使用的药物组合物包括其中含有实现预定目的的有效量的活性成分的组合物。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
活性试剂的治疗有效剂量可以在细胞，例如内皮细胞，培养检测分析中或者在动物模型中进行初步估计，动物模型通常为小鼠、兔、狗、或猪。动物模型还可用于确定适宜的浓度范围和给药途径。这样的信息之后可以用于确定在人类中的有效剂量和给药途径。
治疗有效剂量指活性成分，例如内皮抑制素或其片段，内皮抑制素抗体，内皮抑制素激动剂、拮抗剂或抑制剂，改善症状或状况的量。可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定治疗效力或毒性，例如，ED50(50％群体中的治疗有效剂量)和LD50(对50％群体的致死剂量)。毒性效果和治疗效果间的剂量比率为治疗指数，它可以用LD50/ED50比值表示。表现出高治疗指数的药物组合物是优选的。将得自细胞培养物检测分析和动物研究中的数据用于计算在人类使用时的剂量范围。这样的组合物中所包含的剂量优选在循环浓度范围内，循环浓度包括带极少或不带毒性的ED50。该剂量根据所使用的剂量形式、患者敏感程度、和给药途径在该范围内变化。
确切剂量由医师根据与需要治疗的对象相关的因素确定。对剂量和给药进行调节以形成活性部分的有效水平或保持目的效果。可能考虑的因素包括疾病状态的严重程度、对象的总体健康、年龄、体重和对象的性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感程度、和对治疗的耐受性/反应。长时间作用药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除速率每3至4天、每周、或每两周给药一次。
正常剂量，例如，当施用外源制备的内皮抑制素时，可以根据给药途径和方法在自约0.1至约20mg/kg每天、优选自2.5至20mg/kg每天的范围内变化。特定剂量和运送方法的指导在文献中给出，并且本领域医师通常可以得到。对于核苷酸，本领域技术人员可以使用不同于蛋白质或其抑制剂的制剂。类似地，多核苷酸或多肽的运输针对特定细胞、状况、位置等是特定的。不同的生物可降解或生物相容性聚合物基质，包括微囊、纳米球体(nanospheres)、和植入物，可用于实施本发明。
微球体(microspheres)是含有活性药物的精细球形颗粒。它们与纳米球体的基本不同之处在于颗粒大小；微球体的直径小于约1000μm，而纳米球体是亚微米级的(＜1μm)。微球体系统或者含有均一的整体型微球体(monolithic microspheres)或者含有贮库型(reservoir-type)微球体，在前者中药物均匀地溶解或分散在聚合物基质中，在后者中药物被聚合物基质膜壳所包围。
也可以将整体型或贮库型系统相结合。例如，活性药物可以分散于、或被吸收到贮库型微球体的聚合物表面。
生物可降解聚合物可以包括纯度不同的天然或者合成物质。天然聚合物包括多肽和蛋白质(例如，白蛋白、纤维蛋白原、明胶、胶原蛋白)、多糖(例如，透明质酸、淀粉、壳聚糖)、和病毒包膜和活细胞(例如，红细胞、成纤维细胞、成肌细胞)。天然物质需要在微囊化过程中进行交联，从而使聚合物变性并形成被包埋的药物。因此，最常使用合成聚合物。经常使用的合成聚合物包括如聚乳酸(PLA)这样的多(-羟基)酸、聚羟基丁酸、和乳酸/羟乙酸共聚物(PLGA)。这些化合物是生物相容的、没有免疫原性、并具有使其易于成型的物理特性(控制生物降解速率)。
胶状颗粒载体也可以在本发明的方法中用于运送内皮抑制素。脂质体是优选的胶状载体，它由可同时作为亲水和疏水药物载体的磷脂双层构成。脂质体由，例如，中性脂质、带电磷脂、和胆固醇制成。向脂质体表面中添加如聚乙二醇(PEG)这样的两亲性聚合物可以减缓脂质体的清除。
施用经过PEG修饰的内皮抑制素也在本发明范围内。PEG是由重复乙撑氧亚单位和两个可以被化学激活的末端羟基基团构成的聚合物。PEG分子有大量不同的构型。PEG链包括线性和支链结构——其中一或多个PEG链通过如赖氨酸或三嗪这样的接头相连。PEG可以在一个位点或多个位点与内皮抑制素结合，优选共价结合。由于支链PEG结合于单个位点或者比线性PEG结合的位点少，因此支链PEG或许比多个小线性链PEG的结合不太可能干扰天然分子的生物活性，因此支链PEG为优选的。适于蛋白质口服给药的药物制剂描述于，例如，美国专利5 008 114、5 505 962、5 641 515、5 681 811、5 700 486、5 766 633、5 792 451、5 853 748、5 972 387、5 976 569、和6 051561，全部将其全文引入本文作为参考。
可以用基因疗法将内皮抑制素运输至需要治疗的个体。本领域中可获得的任何基因疗法都可以根据发明使用。示例性方法如下所述。
在一个优选方面，治疗物包括作为表达载体一部分的内皮抑制素编码核酸，所述表达载体在适宜宿主中表达内皮抑制素或其片段或嵌合蛋白质。特别地，这样的核酸具有与多肽编码区可操作性相连的启动子，该启动子是可诱导的或组成型的，以及，可选地，是组织特异性的。在另一种特定实施方式中，使用这样一种核酸分子其中在多肽编码序列和任何其它目的序列两侧是促进在基因组中目的位点发生同源重组的区域，从而使目的核酸在染色体内表达。
向患者体内运输内皮抑制素编码核酸可以是直接的——此时直接将患者暴露于核酸或携带核酸的载体，或间接的——此时细胞首先在体外用核酸进行转化、之后移植到患者体内。这两种方法分别被称为体内或体外基因疗法。
在一种特定实施方式中，内皮抑制素编码核酸直接在体内施用，它在体内表达产生编码产物。这可以通过本领域已知的众多方法中的任何一种来完成，例如，通过将其构建为适宜核酸表达载体的一部分并用其进行给药以使其位于细胞内，例如，通过用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见，例如，美国专利号4 980 286和上面提及的其它文献)，或通过直接注射裸DNA(参见，例如，Blezinger等人，Nature Biotechnology，17，343-348(1999))或通过使用微粒子轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转化剂进行包被、包装入脂质体(参见，例如，Chen等人，Cancer Research，59，3308-3312(1999))、微粒、或微囊中，或通过与已知进入核内的肽关联给药，或通过与接受受体介导的内吞作用的配体关联给药(参见，例如，美国专利5 166 320、5728 399、5 874 297、和6 030 954，全部将其文引入本文作为参考)(这可用于靶向特异表达该受体的细胞类型)，等。在另一种实施方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中的配体含有融合性病毒肽(fusogenic viral peptide)以破坏内体，以使该核酸免于被溶酶体降解。在另一种实施方式中，可以通过靶向一种特异性受体，使该核酸可以在体内被细胞特异性摄取和表达(参见，例如，PCT公开WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188、和WO93/20221)。作为替代方式，可以将该核酸导入细胞内并通过同源重组将其整合到宿主DNA中进行表达(参见，例如，美国专利5 413 923、5 416 260、和5 574 205)。
在一种特异实施方式中，使用了含有内皮抑制素编码核酸的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见，例如，美国专利5 219740、5 604 090、和5 834 182)。这些逆转录病毒载体已经过修饰从而删除了包装病毒基因组以及将其整合进宿主细胞DNA非必需的逆转录病毒序列。把基因疗法中使用的内皮抑制素编码核酸克隆进该载体，使得该基因向患者的运送更为便利。
腺病毒是另一种可以在基因疗法中使用的病毒载体。腺病毒基因组是线性、双链DNA分子，长约36千个碱基对。病毒基因组各末端都有一个称为反向末端重复(或ITR)的短序列，它们是病毒复制所必须的。由于腺病毒分子遗传学已经被详细描述，使腺病毒成为基因转移的有利载体。病毒基因组部分可以用带有外源DNA进行替换。此外，重组腺病毒在结构上是稳定的，而且在大量扩增后没有发现重排病毒。
腺病毒对于将基因运送至呼吸道上皮来说是尤为吸引人的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮而在其中引起轻微的疾病。以腺病毒为基础的运输系统的其它靶物是肝细胞、中枢神经系统、内皮细胞、和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。实施以腺病毒为基础的基因疗法的方法描述于，例如美国专利5 824 544、5 868 040、5 871722、5 880 102、5 882 877、5 885 808、5 932 210、5 981 225、5 994 106、5 994 132、5 994 134、6 001 557、和6 033 8843，全部将其全文引入本文作为参考。
在一种特定实施方式中，为基因治疗目的而将要利用腺病毒载体被导入的核酸含有与编码区域可操作性相连的可诱导启动子，这样，可以通过控制适当转录诱导物的存在与否来控制该核酸的表达。
将基因组元件整合进腺病毒载体可以提高内皮抑制素编码DNA序列的表达。因此，根据本发明的另一方面，提供了包括至少一个内皮抑制素编码DNA序列、和至少一个影响这样的DNA序列表达的基因组元件的腺病毒载体。术语“基因组元件”根据先前所定义的使用。这样的基因组元件包括但不限于内含子、5′非翻译区、和3′非翻译区、以及内含子和3′和5′非翻译区之部分。该腺病毒载体可以是上文所描述的腺病毒载体。控制DNA序列的启动子选自本文中以及现有技术中所描述的那些启动子。
将由具有感染性、但为复制缺陷型的病毒颗粒构成的载体(其含有至少一条编码内皮抑制素的DNA序列)以治疗宿主脉络膜新生血管形成的有效量向宿主体内给药。该组主可以是哺乳动物宿主，包括人和非人灵长类宿主。
可以向哺乳动物宿主施用产生不超过1 000 000ng/ml血液或1mg/ml血液的内皮抑制素水平的有效量的腺病毒载体。可以向哺乳动物宿主施用产生不超过1 000 000ng/ml血液的内皮抑制素水平的有效量腺病毒载体，但是已经发现，一些内皮抑制素，比如内皮抑制素，当由经本发明腺病毒载体转导的哺乳动物细胞表达时，显著地比由非哺乳动物细胞(比如酵母细胞或如大肠杆菌细胞这样的细菌细胞)表达的内皮抑制素更有活性(活性高约1000倍)。因此，为了达到满意的抗-新生血管形成效果，人们通常可以通过向哺乳动物宿主施用腺病毒载体来为哺乳动物宿主提供较低水平的内皮抑制素，这与向哺乳动物提供显著更高水平的由酵母或细菌表达的内皮抑制素相反。
在另一种实施方式中，当向哺乳动物宿主给药时，施用产生宿主体内基本内皮抑制素水平的自约2至20倍内皮抑制素水平的有效量腺病毒载体。通常，在这样的一种实施方式中，向哺乳动物宿主施用产生至少约300ng/ml血液、优选自约300ng/ml至约3000ng/ml、更优选自约500ng/ml至约1500ng/ml水平的活性多肽表达的有效量的腺病毒载体。
在另一种实施方式中，施用其量为自约108噬斑形成单位至约1014噬斑形成单位，优选自约108噬斑形成单位至约1011噬斑形成单位，更优选自约109噬斑形成单位至约1010噬斑形成单位的病毒载体。上述所列量的腺病毒载体为优选。
可以全身性施用感染性载体粒子，比如，例如，通过静脉内(比如，例如，经外周静脉注射)或经门静脉施用，施用至胆管、肌内、腹膜内、或鼻内给药。作为替代，可以局部施用感染性载体粒子，通过例如眼内或眼周注射。可以这样注射进眼前房或后房，例如，注射进房水或玻璃体液。作为替代，可以在视网膜下注射，例如，通过在视网膜后注射含载体的溶液试样(例如，1至10微升每份试样)，之后，溶液被吸收，感染性载体粒子感染眼组织的局部细胞并产生活性多肽。这样的给药可以包括单次注射同一天内多次注射、数周或数月内的单次注射、或数周或数月内的多次注射。
这些载体粒子可以与适于向患者施用的药学可接受载体结合给药。该载体可以是液体载体(例如，盐水溶液)、或固体载体、比如，例如微载体珠(mirocarrier beads)。
腺伴随病毒(AAV)已被提议用于基因治疗，包括治疗肿瘤的内皮抑制素基因疗法(参见，例如，Nguyen等人，Cancer Research，58，5673-5677(1998))。产生并利用AAV的方法描述于，例如，美国专利5 173 414、5 252 479、5 552 311、5 658 785、5 763 416、5 773289、5 843 742、5 869 040、5 942 496、和5 948 675，全部将其全文引入本文作为参考。
基因疗法的另一种途径涉及通过如电击法、脂质转染法、磷酸钙介导的转染、或病毒感染这样的方法将基因转移进组织培养细胞。通常，转移方法包括将选择标记转移进细胞。之后对细胞进行选择以分离已经摄入并表达了该转移基因的那些细胞。之后将那些细胞转移进患者。
在这种实施方式中，在将最后的重组细胞进行体内给药之前，将核酸导入细胞。可以用本领域已知的任何方法来完成这种导入，包括但不限于转染、电穿孔法、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞(microcell)介导的基因转移、原生质体融合，等。本领域中已知了大量用于将外源基因导入细胞的方法而且它们可以用于本发明，只要受体细胞的必须的发育和生理功能未被破坏。这一技术应当使核酸向细胞稳定转移，由此该核酸可以被细胞表达且优选地可被其细胞后代遗传并表达。在另一种实施方式中，在细胞中通常不表达、或由细胞低水平表达的内源基因，可以被与该内源基因可操作性相连的启动子激活，由此提供高水平表达内源基因的细胞，使该细胞合成并分泌内皮抑制素。
产生和注射这样的细胞的方法(也即，从或内源或外源基因或核酸产生高水平蛋白质的那些方法)描述于特别是美国专利号5 641670、5 733 761、5 968 502、6 048 729、6 054 288、6 063 630、和6 187 305。在优选实施方式中，以装入微囊的形式来运送产生内皮抑制素的细胞，例如，装入藻酸钠或藻酸钙聚L-赖氨酸藻酸盐微胶囊中的细胞形式(参见，例如，Read等人，Nature Biotechnology 19，29-34(2001年1月)和Joki等人，Nature Biotechnology 19，35-39(2001年1月))。可以将该微囊化的细胞移植在眼附近或由细胞产生的内皮抑制素最迅速进入对象血流的位置，例如，在肝脏。预计的细胞使用量依赖于期望的效应、患者状态等，而且可由本领域技术人员测定。
可以为基因治疗目的而向其中导入核酸的细胞包括任何想得到的、可以得到的细胞类型，而且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，比如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或始祖细胞，尤其是造血干细胞或祖先细胞，例如，获自骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等的那些。
在一种优选实施方式中，用于基因疗法的细胞是患者自体的。
在一种将重组细胞用于基因治疗的实施方式中，将内皮抑制素编码核酸导入细胞，这样该细胞或其后代可以表达该核酸，而且之后为治疗目的体内施用该重组细胞。在一种特定实施方式中，使用干细胞或始祖细胞。根据本发明的这一实施方式，可以使用任何可以体外分离并保持的干和/或始祖细胞。这样的干细胞包括但不陷于造血干细胞(HSC)，比如皮肤和内脏衬里这样的上皮组织的干细胞、胚胎心肌细胞、肝脏干细胞(参见，例如，WO94/08598)、和神经干细胞。
上皮干细胞(ESCs)或角质形成细胞可通过已知方法获自比如皮肤或内脏衬里这样的组织。在分层上皮组织例如皮肤中，通过生发层(与基底层最接近的一层)内干细胞的有丝分裂进行更新。内脏衬里中的干细胞使这一组织快速更新。获自患者或供体皮肤或内脏衬里的ESC或角质形成细胞可以在组织培养中培养。如果ESC由供体提供，还可以使用抑制宿主对移植物反应性的方法(例如，施用放射、药物或抗体来促进适当的免疫抑制)。
至于造血干细胞(HSC)，在本发明这一实施方式中可以使用任何分离、增殖、体外保持HSC的技术。可以完成这些的技术包括(a)从分离自未来宿主、或供体的骨髓细胞分离和建立HSC培养物，或(b)利用先前建立的长期HSC培养物，其可能是同种异体或异种的。非自体HSC优选与抑制未来宿主/患者的移植免疫反应的方法相结合。在本发明的一种特殊实施方式中，人骨髓细胞可通过针吸从后髂嵴获得(参见，例如，Kodo等人，1984，J.Clin.Invest.731377-1384)。可以以高度富集或基本纯的形式制备HSC。这种富集可以在长期培养之前、期间、或之后进行，并且可以用本领域中的任何技术完成。可以用，例如，改良Dexter细胞培养技术(Dexter等人，1977，J.CellPhysiol.91335)或Witlock-Witte培养技术(Witlock和Witte，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 793608-3612)建立并保持骨髓细胞的长期培养物。
特别将本说明书中所参考的所有专利、公开出版物、(包括已出版的专利申请)、和数据库登记号和保藏登记号完整地引入本文作为参考，仿佛这样的每个专利、公开出版物、(包括已出版的专利申请)、和数据库登记号和保藏登记号都特别地且单独地被指定引入本文作为参考。
然而，应当理解，本发明的范围不限于上述特定实施方式。可以用除具体描述的之外的其它方式来实施本发明，它们仍在本发明所附权利要求书范围内。
进一步的方面涉及内皮抑制素在制备用于治疗患有视网膜脱离或视网膜水肿的患者的药物中的用途，其中所述内皮抑制素特别地是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽，或其中所述内皮抑制素如整个本公开文本中所定义或描述的。
实施例1腺病毒载体的产生方法1用引物5′-ACT GGT GAC GCG GCC CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAGCC-3′(SEQ ID NO6)和5′-AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGGCCT AT-3′(SEQ ID NO7)从获自Genome Systems(St.Louis，MO)的小鼠胶原蛋白XVIII克隆ID 748987中经聚合酶链式反应(PCR)扩增出小鼠内皮抑制素(mEndo)cDNA(598-bp F1片段)。用引物5′-CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3′(SEQ ID NO8)和5′-CTG ATG AGTATG GGC CGC GTC ACC AGT GG-3′(SEQ ID NO9)从pSecTag2(InVitrogen，Carlsbad，CA)PCR扩增出小鼠免疫球蛋白k链引导序列(Ig-k leader)(147-bp F2片段)。PCR用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)在下列条件下完成35个循环95℃热起始3分钟，95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，和72℃延伸2分钟。DNA片段经凝胶纯化。以上述产生的F1和F2DNA片段为模板利用PCR拼接重叠延伸(splice overlap extension)装配小鼠Ig-k引导序列和鼠内皮抑制素cDNA从而产生sig-mEndo嵌合DNA(718bp)。PCR用引物5′-CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3′(SEQ ID NO8)和5′-AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT-3′(SEQ ID NO10)以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene)来完成。PCR在下列条件下运行35个循环95℃热起始3分钟，95℃变性1分钟，60℃退火1分钟，和72℃延伸2分钟。
将718-bp sig-mEndo嵌合DNA插入到腺病毒穿梭质粒pAvF91xr的Nhe1和Cla1位点间，处于Rous肉瘤病毒(RSV)启动子下游和猿病毒40(SV40)多聚腺苷酸信号上游，构建得到pAvmEndoLxr腺病毒穿梭质粒。pAvmEndoLxc中除用经Asc1和Nhe1消化的猿巨细胞病毒(sCMV)启动子片段替换RSV启动子之外，其它与pAvmEndoLxr相同。这两个穿梭质粒都含有用于Cre/lox-介导重组的LoxP位点。pAvmEndoLxr和pAvmEndoLxc腺病毒质粒中的转基因序列都经直接序列分析验证。
通过由Cre/lox-介导的两个质粒，pSQ3和pAvmEndoLxr，之间的重组来产生编码sig-mEndo嵌合体的重组Av3mEndo(缺失了E1、E2a、和E3)。该pSQ3质粒包含loxP位点、以及在该位点之后含有缺失了自左侧末端反向末端重复(ITR)至E1a末端这一区域的Av3基因组。pAvmEndoLxr和pSQ3各自首先用NotI和ClaI限制性酶线性化。用磷酸钙哺乳动物转染系统(Promega，Madison，WI)完成对293细胞的瞬间转染(六孔板各孔4×105个细胞)。用总体积为1.8ml的4.8mg线性化的pAvmEndoLxr、12mg线性化的pSQ3、6mg pcmvCre、和6mgpcmvE2a制备磷酸钙-DNA沉淀。向各孔中加入0.6-ml磷酸钙-DNA沉淀。将293细胞与磷酸钙-DNA沉淀于37℃下温育16小时。除去沉淀，细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。转染后十五天，观察细胞病变效果(CPE)。之后刮取收集细胞和培养基。经五个冻融循环制备粗病毒裂解物。
用0.3mM地塞米松在含有5％FBS的Richter’s CM上在S8细胞中再扩增Av3mEndo载体直到观察到CPE。如(Mittereder等人，1996)所述测定腺病毒载体滴度(粒子每毫升)和生物学滴度(噬斑形成单位[PFU]每毫升)。以同样的方式利用Cre/lox-介导的pSQ3和pAvmEndoLxc的重组产生由CMV启动子驱动的、包含sig-mEndo的重组Av3CsmEndo。通过限制性消化和DNA印迹分析来验证纯化的Av3mEndo、Av3CsmEndo、和对照Av3NulI的正确基因组结构。已证实Av3mEndo和Av3CsmEndo种子批对于复制型腺病毒(RCA)为阴性。
经Av3mEndo转化的S8细胞上清液中含有可以有效抑制由VEGF165诱导的HUVEC细胞迁移的20-kDa蛋白质，这一大小为预计的内皮抑制素大小，而且经ELISA证实106经Av3mEndo转导的Hep3B细胞每24小时分泌1-2μg鼠内皮抑制素。
腺病毒载体的产生方法2从骤冻的2周龄C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)肝脏分离RNA(RNeasy Mini试剂盒；Qiagen，Valencia，CA)并经Moloney鼠白血病(Moloney murine leukemia)病毒逆转录酶(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)处理得到鼠cDNA。用正义引物5′-GATCTCTAGACCACCATGCATACTCATCAGGACTT-3′(SEQ ID NO11)和反义引物5′-ACTGGAGAAAGAGGTTTATCTAGCTACTAG-3′(SEQ ID NO12)经PCR将鼠内皮抑制素基因克隆进TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用正义引物5′-GATCTCTAGACCACCATG AGGTACATGATTTTAGGCTTGCTCGCCCTTGCGGCAGTCTGCAGCGCGGCCCATACTCATACTCATCAGGACTTTCAG-3′(SEQ IDNO14)和反义引物(同上)经PCR将18氨基酸E3/19K信号序列MRYMILGLLALAAVCSAA(SEQ ID NO13)插入到内皮抑制素序列上游。质粒DNA在DH5细胞(Life Technologies)中扩增，并验证信号序列—鼠内皮抑制素(ss-mEndo)序列(ABI Prism 310自动测序仪；PEApplied Biosystems，Foster City，CA)。
ss-mEndo构建体经EcoR1消化并通过钝端连接克隆进腺病毒穿梭质粒pAd/CMV.1的多克隆位点。所得质粒与5型E1 A/B-缺失Ad2重组，并用于感染293细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。通过蛋白酶K消化、苯酚抽提、和乙醇沉淀提取噬斑DNA，并经PCR筛选ss-mEndo。在293细胞中扩增所得病毒，Ad-ss-mEndo。用相似的策略产生包含β-gal(Ad-β-gal)基因和萤火虫荧光素酶(Ad-luc)基因的对照重组病毒。用标准噬斑形成检测测定293细胞中的病毒滴度。细胞在由含有10％FCS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素、0.5μg/ml两性霉素B、和4mM谷氨酸的DMEM(Biofluids，Rockville，MD)组成的完全培养基中生长。用Ad-ss-mEndo、Ad-luc、或无病毒以MOI介于0.1至100(1.0ml完全培养基中每106个细胞，105至108个pfu)间感染细胞，并于37℃温育24小时。上清液2×g离心5分钟，并根据制造商说明用竞争性EIA(Cytimmune Sciences，College Park，MD)检测内皮抑制素。在纤维素柱(Centricon YM-10；Millipore，Bedford，MA)中将293细胞上清液浓缩10倍，并用570ng/ml兔抗鼠内皮抑制素多克隆IgG抗体(Cytimmune Sciences赠品)做蛋白质印迹分析(NuPAGE；Novex，San Diego，CA)。用EIA鼠内皮抑制素标准作为阳性对照。用上述Ad-β-gal感染细胞并在24小时后用染色试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)检测β-gal，由此测试鼠结肠腺癌细胞系MC38(由Surgery Branch，National CancerInstitute开发)对腺病毒感染的易感性。用鼠肝细胞系NMuLi(美国典型培养物保藏中心)对Ad-β-gal感染的易感性作为阳性对照。
腺病毒载体的产生方法3将来自BALB/c小鼠的肝脏组织匀浆，并抽提总RNA(Rneasy试剂盒；Qiagen，Chatsworth，CA)。用寡聚(dT)引物(SuperScript II；Life Technologies，Grand Island，NY)经反转录PCR扩增出第一链cDNA。经PCR(带有Cla1接头的正义引物，5′-ATCGATCATACTCATCAGGACTTTCAGCC-3′(SEQ ID NO15)；带有Not1接头的反义引物，5′-GCGGCCGCCTATTTGGAGAAAGAGGTCAT-3′(SEQ IDNO16))扩增出全长小鼠内皮抑制素cDNA用于亚克隆进pBluescript(Stratagene)。将编码大鼠胰岛素引导序列的合成寡核苷酸克隆在内皮抑制素基因前面。验证序列之后，将大鼠胰岛素引导序列-内皮抑制素cDNA克隆进如Bautista，D.S.等人，(1991)Virology 182，578-596所述用于拯救重组腺病毒的重组腺病毒(ADV)穿梭载体pADV.hEF1-α(人延长因子1-α)。通过吸光度(A260)测定病毒粒子，用标准琼脂糖覆层噬斑检测法测定293细胞的噬斑形成单位。对分离自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的RNA进行反转录-PCR获得用于构建ADV.hVEGF165的cDNA。JC和LLC细胞系获自美国典型培养物保藏中心。细胞在RPMI培养基1640(JC)和DMEM(LLC)中培养。所有培养基都补加了10％FBS、0.2mM谷氨酸盐、和1％青霉素/链霉素。室温下用IV型胶原蛋白酶(Sigma)灌注(0.2％，溶于Hanks平衡盐溶液中)20分钟从脐带分离得到HUVEC。之后在补加了20％FBS、0.2mM谷氨酸盐、1％青霉素/链霉素、和1ng/ml bFGF的M199培养基中在用胶原蛋白(1％，溶于PBS)包被的平板上培养细胞。
实施例2向小鼠的基因转移和CNV的诱导将病毒载体注射进成年C57BL/6小鼠的尾静脉。用2×1011粒子(particles)的Av3mEndo(n＝18)或Av3mNull(n＝17)或用6×1010粒子的Av3CsmEndo或Av3CsNull注射小鼠。注射病毒载体四天后，用盐酸氯胺酮(100mg/kg体重)麻痹小鼠，用1％托吡卡胺(tropicamide)使瞳孔放大，如Tobe等人，Am.J.Pathol.153，1641-1646(1998)先前所描述的用氪激光光凝固法使各小鼠每只眼睛的玻璃膜在三个位置破裂。简言之，用Coherent Model 920光凝固器的狭缝灯传递系统(slit lamp delivery system)和一块用作接触镜的手持盖玻片来进行氪激光凝固法(100μm点大小，0.1秒持续时间，120mW)。在离视觉神经2～3个视神经盘直径(disc diameter)的9、12、和3点钟的位置进行灼烧。激光照射时蒸发泡的产生，它表示玻璃膜的破裂，是获得CNV的重要因素，因此只有起泡的灼烧才包括在该项研究中。经Av3mEndo注射的小鼠有一次灼烧没有起泡，经Av3mNull注射的小鼠有三次灼烧没有起泡。有一只经Av3mEndo注射的小鼠有一只眼睛的角膜有一个妨碍激光使用的角膜疤，因此未曾使用该眼。
实施例3由激光诱导的CNV损伤大小的测定激光处理之后两周，利用两种不同的技术之一评估CNV损伤的大小，由Seo等人，Amer.J.Pathol.154，1743-1753(1999)先前报导的对连续切片上的CNV总和面积(integrated area)的测定或由Edelman等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41，S834(2000)描述的对脉络膜flat mounts中CNV面积的测定。对于用Av3mEndo注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技术评估以及8只用连续切片评估，对于用Av3mNull注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技术评估以及7只用连续切片评估。
如Tobe等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39，180-8(1998)先前所述，麻痹用于flat mount技术的小鼠并用含有50mg/ml经荧光素标记的右旋糖酐(2×106平均mw，Sigma，St.Louis，MO)的1ml磷酸缓冲盐水灌注。取出眼睛并在10％磷酸盐缓冲福尔马林中固定1小时。取出角膜和晶状体，从视杯中小心分离出完整视网膜。在视杯的边缘到中纬线做径向切割(4-7，平均为5个)，并在Aquamount中使巩膜向上、脉络膜向下将视杯水平安放(flat mounted)。用荧光显微镜检测Flat mounts，用3CCD彩色摄像仪和帧接收器(framegrabber)将图像数字化。用Image-Pro Plus测量与各次灼烧有关的超荧光总面积，其对应于总维管疤。
对于用Av3mEndo注射的小鼠，总计评估了19只眼(有一只眼睛没有进行激光处理就已经存在了角膜疤)而且由于有一次灼烧没有起泡，因此测定了56个损伤。对于用Av3mNull注射的小鼠，总计评估了20只眼，而且由于有3次灼烧没有起泡，因此测定了57个损伤。对每只眼睛内的面积取平均值，做log转换后，用广义估计方程(generalized estimating equations，GEE)完成回归分析。该分析调节每只小鼠右眼和左眼间的相关性。
用激光处理了两周后，将用于测定连续切片上的CNV总和面积的小鼠处死，将眼睛迅速取出并冷冻在适宜切割温度包埋化合物(OCT；Miles Diagnostics，Elkhart，IN)中。沿每个灼烧整个区域切割冷冻连续切片(10μm)，并用选择性地与血管细胞结合的生物素化griffonia simplicifolia lectin B4(GSA，Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行组织化学染色。4℃下将载玻片放在甲醇/H2O2中孵育10分钟，用0.05M Tris缓冲盐水洗涤，pH 7.6(TBS)，并在10％正常猪血清中孵育30分钟。室温下用生物素化的GSA孵育载玻片2小时，用0.05M TBS漂洗后，用与过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(Vector Laboratories)于室温孵育45分钟。用0.05M TBS洗涤10分钟后，用Histomark Red(Kirkegaard和Perry)孵育载玻片以产生能够与黑色素区分开的红色反应产物。用Contrast Blue(Kirkegaard和Perry)对一些载玻片进行复染色。
为了进行定量评估，用Axioskop显微镜检查经GSA染色的切片，并用3CCD彩色摄像机和帧接收器(frame grabber)使图像数字化。用Image-Pro Plus软件描绘并测定视网膜下空间中经GSA染色血管的面积。对于各损伤，对所有出现了损伤的切片做面积测量，并把它们加在一起以得出总和面积测量值。对每只眼睛中的测量值取平均值，并用GEE做回归分析。
在最初的实验中，将位于由激光诱导的玻璃膜破裂位点的CNV量与用Av3mEndo注射的小鼠和用Av3mNull注射的小鼠相比。用两种不同的技术估测CNV的量；对脉络膜flat mounts上用荧光标记的右旋糖酐灌注的CNV面积的测定，和对贯穿整个损伤的连续切片上CNV面积的测定。与未注射小鼠和用Av3Null注射的小鼠相比，用Av3mEndo注射的小鼠中，脉络膜flat mounts中的由激光诱导的CNV面积更少。由不知晓处理组的调查者完成的图像分析证实了由视觉比较所见的区别，这表明用Av3mEndo注射的小鼠中的灌注CNV损伤平均面积显著小于用Av3Null注射对照的(表1)。
表1脉络膜Flat Mounts上的灌注CNV面积
贯穿整个损伤的连续切片上的CNV总和面积
经CNV损伤的连续切片还显示，与用Av3Null注射的小鼠相比，在用Av3mEndo注射的小鼠中有较小的损伤。将各系列切片上的CNV面积相加得到的CNV总和面积——其估测了三维的大小，证实了与Av3Null注射小鼠相比用Av3mEndo注射的小鼠中在玻璃膜破裂位置处的CNV显著更小(表1)。由于两种测量技术给出了非常相似的信息，在后面的实验中只施用了脉络膜flat mounts。
内皮抑制素血清水平与CNV面积之间存在反相关性。用载体进行静脉内注射4～7天后内皮抑制素血清水平是最适宜的。用Av3mEndo、Av3CsmEndo、Av3Null、或Av3CsNull注射了一组小鼠。第四天进行激光处理，注射后七天获得血清。在调查者不知道载体组和内皮抑制素血清水平的情况下，激光光凝固法后14天测定了脉络膜flat mounts上的CNV面积。用Av3CsmEndo注射的小鼠看来比未注射小鼠或用Av3CsNull注射的小鼠的CNV更少。图像分析证实，与对照相比，用Av3CsmEndo或Av3mEndo注射的小鼠中的CNV损伤面积显著更少(表2)。
表2脉络膜Flat Mounts上的灌注CNV面积
*相对于无载体对照的差异；**相对于相应空载体对照的差异对每只小鼠中的CNV损伤平均面积vs内皮抑制素血清水平作图显示出强的负相关，r＝-0.66。
实施例4眼和肝脏中的内皮抑制素表达分析为确定全身性施用腺病毒载体是否会对眼睛产生显著的转导，用Av3nBg对一组小鼠进行了注射。该载体由RSV启动子表达β-半乳糖苷酶。五天后，处死这些小鼠，并用化学发光分析测定眼和肝脏匀浆中的β-半乳糖苷酶活性。将肝脏和眼从小鼠中取出后迅速冷冻。检测当天，在裂解缓冲液(40∶1 v/v 1×Reporter裂解缓冲液(Promega，Madison WI)Protease Inhibitor Cocktail(Sigma，St Louis MO))中将肝脏或眼匀浆。用Bradford Assay(Biorad，Hercules CA)测定蛋白质含量。用Galacto-Light system(Tropix，Bedford MA)测定β-半乳糖苷酶活性。
在接受了载体的小鼠的肝脏中，β-半乳糖苷酶活性水平比未注射对照高约1000倍，而在眼中，注射载体的动物和对照动物间的该酶活性水平相似。在给予了表达该酶的腺病毒之后的眼中未出现可检测的β-半乳糖苷酶活性，这意味着血管内注射内皮抑制素载体后的抗血管生成效应是由于内皮抑制素的全身性生成而非局部生成引起的。
实施例5用Av3mEndo注射的小鼠与用Av3CsmEndo注射的小鼠间的比较用2×1011粒子的Av3mEndo(n＝10)或Av3mNull(n＝9)对小鼠进行尾静脉注射，或用6×1010粒子的Av3CsmEndo(n＝11)或Av3CsmNull(n＝11)注射。还包括一个未注射对照组(n＝11)。注射后四天，如上所述用激光使各鼠各眼的玻璃膜发生三处破裂。注射后七天，从各鼠的尾静脉抽血，血清于-80℃保存以用于ELISA。注射后18天以及激光处理后14天，如上所述估计脉络膜flat mounts上的CNV面积。
用鼠内皮抑制素酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒(ACCUCYTE鼠内皮抑制素Cytlmmune Sciences，College Park，MD)根据制造商说明测定内皮抑制素血清水平。
第二个载体构建物Av3CsmEndo的表征证实，与用最大耐受剂量的Av3mEndo粒子(2×1011pfu)注射的小鼠中的水平相比，Av3CsmEndo的血管内注射产生高约10倍的最大内皮抑制素水平。用Av3mEndo和Av3CsmEndo注射的小鼠中的内皮抑制素血清水平显著高于未注射或注射了空载体的对照小鼠中的水平。小鼠中的基本内皮抑制素水平介于约30至150ng/ml血清之间。
因此，注射了由Rous肉瘤病毒启动子驱动sig-mEndo表达的构建体的小鼠具有适度高的内皮抑制素水平，并且在激光诱导的玻璃膜破裂位点比用空病毒注射的小鼠具有显著较小的CNV损伤。注射了由猿巨细胞病毒启动子驱动sig-mEndo的构建体的小鼠具有约10倍高的内皮抑制素血清水平并具有显著较小的CNV，几乎完全抑制。
实施例6编码人内皮抑制素的重组腺载体的制备从人α1(XVIII)胶原蛋白cDNA PCR扩增出人内皮抑制素cDNA。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人肝脏polyA RNA(Clonetech，Palo Alto，CA)产生人肝脏cDNA。用Perkin ElmerRT-PCR试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA)和引物5′-TTT TTT TTT CAG TGT AAA AGG TC-3′(SEQ ID NO17)在以下条件中进行1个循环完成反转录室温下10分钟，42℃反转录3分钟，99℃变性5分钟，5℃冷却5分钟，保持在4℃直到cDNA用乙醇沉淀并重悬。用引物5′-CAG ATG ACA TCC TGG CCA G-3′(SEQID NO18)和5′-CTA TAC AGG AAA GTA TGG CAG C-3′(SEQ ID NO19)从已经制备好的cDNA PCR扩增出790bp人内皮抑制素cDNA片段。在以下条件下完成35个循环95℃热起始3分钟，80℃3分钟，之后添加Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，以及72℃延伸3分钟。凝胶纯化出790bp人内皮抑制素cDNA片段经并如所述进行再扩增——除了使用58℃的退火温度。凝胶纯化790bp人内皮抑制素cDNA片段，并根据制造商说明用PCR-Script Cloning试剂盒(Stratagene)将其克隆进PCR-Script Amp SK+以产生pcrhend I。由Gene Therapy CoreTechnologies Molecular Core Laboratory at Genetic Therapy，Inc.Gaithersburg，MD经直接测序分析验证pcrhend I质粒的人内皮抑制素cDNA区域。
根据以下程序用人BM40基底蛋白质引导序列来组装人内皮抑制素cDNA片段。使两条合成寡核苷酸，5′-GCC AAG CTT CCA TGA GGGCCT GGA TCT TCT TTC TCC TTT GCC TGG CCG GGA GGG CTC TGG CAG CCCCTC AGC AAG AAG CGC TCG CTC ACA GCC ACC GCG ACT TCC AGC CGG TGCTCC A-3′(正义)(SEQ ID NO20)、和5′-CCA GGT GGA GCA CCGGCT GGA AGT CGC GGT GGC TGT GAG CGA GCG CTT CTT GCT GAG GGG CTGCCA GAG CCC TCC CGG CCA GGC AAA GGA GAA AGA AGA TCC AGG CCC TCATGG AAG CTT GGC-3′(反义)(SEQ ID NO21)，退火来产生BM40基底蛋白引导序列，之后用Hind III和Sex A1消化。将经过消化的BM40基底蛋白引导序列克隆进pcrhend I的Hind III和Sex A1位点以产生pBmpcrhen质粒。通过直接测序分析验证pBmpcrhen质粒的整个sig-hEndo区域。
在以下程序中，在pAvF9Lxr腺病毒穿梭质粒中将含有Factor IX(F9)的序列替换为含有sig-Endo的序列来产生腺病毒穿梭质粒pAV1bmhendlx。Sac1消化后经Klenow补齐和Sal I消化从pBmpcrhen产生含有sig-hEndo序列的800bp片段。pAvF9Lxr质粒用Barn HI限制酶消化，之后经Klenow补齐并用Sal I限制酶消化以除去含有F9的序列。凝胶纯化这两个片段，并使其连接以产生pAV1bmhendlx。
经RT-PCR从来自人肝脏poly A RNA的人α1(XVIII)胶原蛋白cDNA C-末端产生人内皮抑制素cDNA。从两条合成寡核苷酸产生人BM40基底蛋白引导序列。用退火后的人BM40基底蛋白引导序列与人内皮抑制素cDNA的5′克隆以形成用于分泌人内皮抑制素蛋白的sig-hEndo嵌合蛋白。将sig-hEndo嵌合DNA克隆进腺病毒穿梭质粒pAvF9lxr以产生pAV1bmhendlx(附

图12A)。通过自动测序分析验证整个sig-hEndo嵌合序列。
根据下列程序用“Quick Cre/Lox双质粒系统”产生编码sig-hEndo嵌合蛋白的重组Av3bmhendlx(带有E1、E2a、和E3-缺失)。首先用Not I和Cla I限制酶分别使质粒pAV1bmhendlx和pSQ3线性化。用0.3μM地塞米松预处理S8细胞24小时，之后用LipofectAMINE PLUSReagent(Life Technologies，Rockville，MD)在含有4×105 S8细胞每孔的6孔板上完成S8细胞瞬时转染。用1μg线性化的pSQ3、0.5μg pCre、和0.5μg线性化的pAV1bmhendlx、和6μl脂质转染胺根据制造商的方法(Life Technologies)制备脂质转染胺复合DNA(lipofectamine complexed DNA)。37℃下将S8细胞与脂质转染胺复合DNA温育4.5小时。除去脂质转染胺复合DNA，并用PBS洗涤细胞。37℃下用5％CO2培养转染的S8细胞直到观察到致细胞病变。刮取收集细胞和培养基。经五个冻融循环制备粗病毒裂解物。在含有5％FBS的Richter’s CM培养基中用0.3μM地塞米松使Av3bmhendlx在S8细胞中再扩增直到观察到致细胞病变。
Av3bmhendlx介导的人内皮抑制素表达和分泌在经载体转导的S8细胞中表征。经SDS-PAGE分析用Av3bmhendlx感染的细胞的上清蛋白质，也即，人内皮抑制素。在4至12％的线性梯度预制凝胶上分析每20μg上清蛋白质。将SDS-PAGE转移到聚偏二氟乙烯膜上。用考马斯蓝R-250对该膜染色。从膜印迹上切出对应于人内皮抑制素正确大小的20kDa蛋白条带，并对其做N-末端蛋白质测序分析。测定了三个主要分泌蛋白质的蛋白质序列，其中50％具有带附加氨基酸残基APQQEALA(SEQ ID NO5)的人内皮抑制素氨基酸序列，25％含有残基LA，以及25％不带有来自人BM40基底蛋白质信号肽的残基。在来自Av3Null细胞的上清蛋白质中未发现20kDa蛋白质。该结果证实，人内皮抑制素经过人BM40基底蛋白信号肽加工后，经Av3bmhendlx转导的S8细胞表达并分泌人内皮抑制素。
实施例7由BIV载体介导的抗血管生成基因表达对视网膜渗漏、增厚、脱离、和新生血管形成的体内抑制从三个组成系统产生编码eGFP的牛免疫缺陷病毒(BIV)载体(描述于已出版的国际专利公开号WO0144458中，将该公开文本全文引入本文作为参考)。根据Takahashi，K.等人Hum.Gene Ther.13，1305-1316(2002)，转移载体BIVendostain衍生自pBSV4MGpptGAG，一种基于BIV的、在MND U3启动子下编码eGFP的转移载体构建体。用鼠内皮抑制素(mEndo)替换了eGFP编码序列。特别的，为使eGFP从亲体质粒pBSV4MGpptGAG中缺失，通过PCR扩增了eGFP加上一些侧翼序列。所用引物为eGFP1FOR 5′-GCGCATGTCGACAGAATATGGGCCAAAC-3′，其在PCR产物5′末端掺入Sal1位点，和eGFP1REV 5′-GCGCTACTGCAGAGCTAATGAGCTACAC-3′，其在PCR产物3′末端掺入Pst1位点。用Sal1和Pst1切割该片段，并将其与已经事先用Sal1和Pst1消化的pBSII(KS+)连接，从而形成pBS2eGFP。用ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，LaJolla，CA)使eGFP从pBS2eGFP中缺失。把PCR引物设计成位于eGFP基因外部的两侧、并指向外部，从而使其能扩增包括整个侧翼序列和质粒、但除eGFP之外的一切。所用引物为DELeGFP1FOR5′-CCGGCTAGCTTAAGGGTGGCGACCGGT-3′，其加入了Nhe1和AfIII限制性位点，和DELeGFP1REV5′-GCTTCGAACGCGTAGCGGCCAACCCTC-3′，其加入了BstBI和Mlu1限制性位点。根据制造商的说明处理扩增子，并将其连接形成缺失了eGFP、但带有从其亲本质粒的侧翼序列的pBS2deleGFP。该策略还在中间形成了四个新的限制性位点。对该片段进行测序以确定未引入突变。根据Mori，K.等人Amer.J.Pathol.159，313-320(2001)从腺病毒穿梭质粒，pAVmEndolxr制备mEndo基因插入物。用Nhe1和Cla1消化该质粒以释放mEndo片段。将该片段与已经事先用Nhe1和BstBI(末端与Cla1相容)消化的pBS2deleGFP相连，由此产生pBS2deleGFPmEndo。将Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)插入mEndo下游的Mlu1位点，由此形成pBS2deleGFPmEndoPRE。最后，用Bsu36I和BbvCI消化质粒pBS2deleGFPmEndoPRE以释放mEndo编码序列和原始eGFP侧翼序列，将该片段与已经事先用Bsu36I和BbvCl消化的pBS4MGpptGAG相连，由此产生pBvMNDmEndoPRE。还产生了空BIV载体pBvMNDPRE，并将其用作阴性对照载体。除了不含mEndo编码序列，PBvMNDPRE与pBvMNDmEndPRE相同。
简言之，为产生编码mEndo的BIV载体粒子(BIVendostatin)，在150mm培养皿(2×107细胞/皿)中用45μg pBvMNDmEndoPRE、45μg基于BIV的包装构建体pBIVminipack、和13.5μg假型化包膜表达构建体pVSV-G转染293T细胞。为产生BIV空载体(BIVNuII)，用pBvMNDPRE构建体替代pBvMNDmEndoPRE。转染后四十八小时，收集载体并经0.45μm滤膜过滤。之后用超离心浓缩载体上清液。将浓缩的载体等分并保存于-80℃直至使用。
检测浓缩载体的反转录酶(RT)活性，这是对载体粒子的一种测定。BIVendostatin和BIVNull载体的RT活性都约为15μg/m l。我们之前已经用基于BIV的编码eGFP的载体显示了1ng RT约等于1×105转导单位(T.U.)。因此，所估测的BIVendostatin载体滴度为1.5×109T.U./ml。为检测BIVendostatin载体是否能够介导mEndo的有效产生，用1μl(15ng RT当量载体粒子)BIVNull载体或等量的BIVendostatin载体在六孔板(4×105细胞/孔)中转导Cf2Th细胞。转导后四十八小时，根据制造商的指导(Cytimmune Sciences Inc.，College Park，MD)用商业内皮抑制素检测试剂盒，Accucyte小鼠内皮抑制素检测系统，检测细胞上清液中的内皮抑制素表达。经BIVendostatin载体转导的细胞产生412ng/ml内皮抑制素，而BIVNull载体未显示可检测的内皮抑制素水平。
经视网膜下注射向单转基因小鼠(IRBP/rtTA-TRE/VEGF tg小鼠)(该转基因小鼠在强力霉素诱导下从小鼠感光细胞表达血管内皮生长因子)，施用根据O’Reilly等人，Gell；88(2)277-85(1997)制备的编码鼠内皮抑制素的BIV载体。向小鼠右眼中注射BIV载体，而用左眼作为不注射载体的对照。注射后三周，在转基因小鼠的引用水中加入0.5mg/ml强力霉素。通过荧光血管造影检查发现，由强力霉素诱导的VEGF表达导致转基因小鼠左眼上产生严重的新生血管形成。由BIV载体介导的内皮抑制素表达完全阻断同一小鼠右眼中由VEGF诱导的新生血管形成。
经免疫组织化学染色的眼冷冻切片(这些切片来自右眼视网膜下接受了1.5×106转导单位(TU)的BIVendostatin注射且左眼接受了1.5×106TU BIVNull注射、并且在注射载体四周后安乐死的成年C57BL/6小鼠的眼睛)显示，经BIVendostatin注射的眼睛表现出RPE细胞中以及整个内核层的内皮抑制素强染色，一些血管壁细胞带有密集染色。内网层中线性染色结构是Muller细胞突起典型的。用BIVNull注射的眼睛沿内界膜和玻璃膜出现反应产物，这可能是由于与胶原蛋白XVIII交叉反应导致的。
右眼接受了1.5×106转导单位(TU)的BIVendostatin、且左眼接受了1.5×106TU BIVNull的视网膜下注射的成年双重转基因rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠在注射四周后开始在其饮用水中加入2mg/ml强力霉素，使用强力霉素3天后用[3H]甘露醇测定这些小鼠的视网膜血管渗透性。与用空载体注射的伴眼相比，在表达内皮抑制素的眼中视网膜至肺(retina to lung(RLLR))被显著降低，这表明用两个不同载体系统之中任一个表达内皮抑制素都导致对由VEGF诱导的视网膜血管渗透性的抑制。
成年rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠(其右眼接受了1.5×106TUBIVendostatin且左眼接受了1.5×106TU BIVNull视网膜下注射、并在注射载体四周后其饮用水中添加了0.5mg/ml强力霉素)在开始使用强力霉素四天后接受荧光血管造影。用BIVendostatin注射的小鼠在用BIVendostatin注射的眼中表现为出现正常的带有清晰壁的视网膜血管，这表明极少或几乎没有荧光素渗透，而用BIVNull注射的眼在整个视网膜都显示弥散荧光，这表示广泛的荧光素外溢。开始使用强力霉素七天后，与用BIVNull注射的眼相比仍几乎没有迹象显示在用BIVendostatin注射的眼中有荧光素外漏。当视网膜血管渗透性提高时，视网膜中积累了导致视网膜变厚的液体。黄斑变厚称为黄斑水肿，异常变厚量与视敏度呈反向相关。因此，视网膜变厚是欲评估的生理学相关变量，并适于用比如光学相干X射线断层摄影术(OCT)或视网膜变厚分析(RTA)这样的体内成像技术对其进行精确的定量。在饮用水中开始使用0.5mg/ml强力霉素以诱导VEGF表达七天后，用BIVendostatin注射的眼冷冻切片比用BIVNull注射的眼表现更少的视网膜增厚。用八只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠定量评估内皮抑制素对用VEGF诱导的视网膜厚度的影响。
用1.5×106TU BIVendostatin视网膜下注射右眼、用1.5×106TUBIVNull视网膜下注射左眼四周后，开始在小鼠饮用水中使用0.5mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素七天后，通过离各视神经边缘300μm沿水平子午线的成像分析测定视网膜厚度，并取平均值以得出各眼的单实验值。用BIVNull注射的眼中的平均视网膜厚度显著大于用BIVendostatin注射眼的平均视网膜厚度。
用1.5×106TU BIVendostatin视网膜下注射右眼、用1.5×106TUBIVNull视网膜下注射左眼四周后，开始在小鼠饮用水中使用0.5mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素七天后，与用BIVendostatin注射的眼相比，用BIVNull注射的眼中的视网膜新生血管形成量显著更大。
当在rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠的饮用水中给以2mg/ml强力霉素5天或更久时，这些小鼠表达高水平的VEGF并发生出严重的新生血管形成和视网膜脱离。用十一只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠评估BIV载有的内皮抑制素对由视网膜VEGF导致的这一严重表型的影响。用1.5×106TU BIVendostatin视网膜下注射右眼、用1.5×106TU BIVNull视网膜下注射左眼四周后，开始在小鼠饮用水中使用2mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素七天后，使小鼠安乐死，将眼在2％多聚甲醛中固定。做总体病理检查后，把它们在OCT中冷冻并切片。用苏木精和曙红对连续切片染色。由对载体组未知的观察者检查各眼是否出现总体、部分、或无视网膜脱离。用BIVendostatin注射的眼中总体视网膜脱离显著少于用BIVNuII注射的眼中的总体视网膜脱离。与仅一只用BIVNuII注射的眼没有视网膜脱离相比，有四只用BIVendostatin注射的眼没有视网膜脱离。
实施例8眼内注射为进行利用腺病毒载体的研究，在成年小鼠一只眼中视网膜下注射6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物，另一只眼中视网膜下注射6×107粒子的AGVnull。为进行利用慢病毒载体的研究，小鼠一只眼中接受5×106转导单位(TU)的BIVendostatin，另一只眼接受5×106TU的BIVNuI1。校准拉伸式玻璃微量移液管以通过压下脚踏开关吸取1μl载体。用聚光透镜系统在解剖显微镜和接触透镜上完成注射，这可以使视网膜在注射过程中可视化。麻醉小鼠，使其瞳孔放大，并在解剖显微镜下将尖的微量移液管头穿透巩膜至其后缘并定位在刚好视网膜上方。按压脚踏开关使注射液喷射刺穿视网膜。由于出现小视网膜脱离(bleb(小泡))，因此这一技术的创伤极小，而且直接可视化保证了注射的成功。小泡的大小十分一致，而且这些小泡涉及约小于一半的视网膜面积。
实施例9由无病毒基因的腺病毒载体介导的眼中的受控内皮抑制素表达根据Xu等人，Molecular Therapy；3262(2001)描述的方法完成利用腺病毒载体运输系统的内皮抑制素体内受控表达。分别从质粒pAGVas521和pAGVC7mEndo产生编码可由三苯氧胺诱导的嵌合转录因子的AGV载体AGVas521、和可调控内皮抑制素转基因AGVC7mEndo。根据Reddy，P.S.等人，Molec.Ther.5，63-73(2002)，该AGV质粒除含有转基因表达盒(参见下述)外还含有侧翼为独特Pac I位点的左和右ITRs、Ad5包装信号、以及作为DNA“填充物”的约25kb的人αsynuclein内含子区域。质粒pAGVas521含有可由三苯氧胺诱导的嵌合转录因子，它由单一锌指DNA结合结构域、以人雌激素受体为基础的经修饰的配体结合结构域、和衍生自VP16的由CMV启动子驱动的反式激活区域组成。为构建pAGVas521，用Nru I和Bam HI消化pAvCv-C7LBD分离出该嵌合转录因子表达盒，并将其插入pBLSV2。质粒pBLSV2衍生自pBluescript(Strategene，La Jolla，CA)，含有两个多克隆位点多接头。用Bspe I消化所得质粒pBLSV2as521，并与用Xma I消化的pGTI.24aPL2连接形成pGTI24as521。pGTI24aPL2含有一个侧翼为人synuclein填充DNA的多克隆位点多接头。接下来，用Pac I消化pGT124as521以释放质粒骨架，并根据Toietta，G.等人，Mot.Ther.5，204-210(2002)所述通过在BJ5138大肠杆菌中的同源重组与经Pme I-Mlu I消化的pBV2结合以产生pAGVas521。质粒pBV2含有26625bp的人synuclein填充DNA。
质粒pAGVC7mEndo含有驱动鼠内皮抑制素表达的、配体可诱导转录因子调控的启动子。为构建pAGVC7mEndo，用AscI(钝端)和BamHI消化pav-6X2C7tatamendo并将其插入pBLSV2C7endo。用Bam HI和Eco RI消化质粒pBLSV2C7endo，末端补齐并与用Sma I消化的pGTI245.aPL2连接以产生pGTI24C7endo。最后，用Pac I消化pGTI245.aPL2以释放质粒骨架，并根据上述Toietta的方法通过在BJ5138大肠杆菌中的同源重组与经Pme I和Mlu I消化的pBV4结合以产生pAGVC7mEndo。质粒pBV4含有27191bp的人synuclein填充DNA。
根据Reddy等人的描述完成无病毒基因的载体的产生、大规模制备和纯化。通过光学密度检测测量粒子滴度。通过限制性酶消化验证载体完整性来分析从CsCI-纯化载体提取的DNA。用一种基于六邻体(hexon)的定量PCR检测方法确定AGV制品中的辅助病毒污染水平。本研究中所使用的AGVNuII、AGVas521、和AGVC7mEndo制品的辅助病毒污染水平分别为0.09％、1.9％、和1.4％。
对C57BL/6小鼠全身性施用编码可诱导转录因子、或可调控内皮抑制素转基因的早期世代的E1/E2a/E3缺陷型载体之后，这一三苯氧胺-可诱导系统在C57BL/6小鼠血清中显示出高水平的可诱导内皮抑制素表达。
该调控系统由两个构件组成，一个可诱导的转录因子、和一个驱动内皮抑制素表达的应答启动子。该转录因子由一个经过修饰的对三苯氧胺产生应答的人雌激素配体结合结构域、一个独特的半胱氨酸2-组氨酸2锌指DNA结合基序、和一个来自VP16的最小反式激活结构域组成。该应答启动子由被转录因子DNA结合结构域(DBD)识别的DNA序列六个重复、和一个编码内皮抑制素的DNA组成。在三苯氧胺存在下，该转录因子激活从与最小启动子连接的独特靶核酸序列的转录。当用荧光素酶进行体外评估时，三苯氧胺诱导高至250倍的表达。该系统整合到两个无病毒基因的腺病毒载体中，它们都不含全部的病毒编码区域。一个载体编码转录因子，第二个编码驱动编码内皮抑制素的核酸的靶启动子。将这两种载体注射进小鼠，其导致有效的肝转导。向小鼠施用三苯氧胺导致可诱导的内皮抑制素表达，由此产生高至20μg/ml的极高血浆水平。两个月中完成了四次三苯氧胺诱导。在不存在三苯氧胺时，观察到了背景水平的内皮抑制素。
用三苯氧胺处理接受了构成可诱导系统的AGVC7mEndo和AGVas521载体对注射的小鼠表现出整个视网膜的内皮抑制素强染色，这证实了内皮抑制素表达在视网膜中的强烈诱导。
用[3H]甘露醇作为追踪剂测定成年IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠中视网膜血管渗透性，这些小鼠右眼接受了6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物视网膜下注射且左眼接受了6×107粒子的AGVNuII视网膜下注射、以及之后用三苯氧胺处理六天以诱导内皮抑制素表达，其中最后三天这些小鼠还接受了强力霉素以诱导VEGF表达。与仅诱导了VEGF表达的伴眼相比，在同时诱导了内皮抑制素和VEGF表达的眼中视网膜至肺(RLLR)和视网膜至肾渗漏比(RRLR)都被显著降低。这证实，内皮抑制素抑制VEGF-诱导的视网膜血管渗透性提高。
实施例10转基因小鼠和试验方法本研究中使用了由Ohno-Matsui，K.等人Am.J.Pathol.160，711-719(2002)产生的两个双重转基因小鼠系，这两个小鼠系都带有在视网膜中可诱导的VEGF表达。在其中的一个小鼠系中，光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)启动子与反向的四环素反式激活子(rtTA)系统结合以指导光感受器中VEGF的强力霉素-可诱导表达。这些小鼠称为IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠。在双重转基因小鼠中第二个小鼠系中，视紫质启动子而非IRBP启动子与反向的四环素反式激活子(rtTA)系统结合以指导光感受器中VEGF的强力霉素-可诱导表达。这些小鼠称为rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠。
1)内皮抑制素的免疫组织化学将眼刺穿并置于4％多聚甲醛/5％蔗糖中，之后在0.1M、pH 7.4的磷酸缓冲液中4℃孵育过夜1.5小时。之后漂洗该眼并迅速冷冻于0.1M磷酸缓冲液/溶于OCT的20％蔗糖的2∶1混合物中。使十微米冷冻切片干燥，之后在冰冷的4％多聚甲醛中固定30分钟。漂洗后，用含有6.25％H2O2的冰冷甲醇对玻片阻断15分钟，之后再用Tris-缓冲盐溶液中的(TBS)2％脱脂牛奶于室温下阻断30分钟。于室温下将玻片在溶于2％牛奶/TBS中的1.5μg/ml多克隆山羊抗小鼠内皮抑制素IgG(R&D Systems，Minneapolis，MN)中孵育1小时。在0.1％牛奶/TBS中洗涤10分钟后，室温下将玻片在溶于2％牛奶/TBS中的2μg/ml生物素缀合的抗山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)中孵育30分钟。在0.1％牛奶/TBS中洗涤10分钟后，室温下将玻片在链酶抗生物素蛋白-磷酸酯酶(Kirkegaard和Perry，Cabin John，MD)孵育30分钟。在0.05M Tris HCI中洗涤五分钟后，用HistoMark Red(Kirkegaard和Perry)使玻片显色并固定。
2)用[3H]甘露醇作为追踪剂对视网膜血管渗透性的测定对成年双重转基因IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠(n＝11)右眼视网膜下注射6×107粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1∶1混合物和左眼视网膜下注射6×107粒子的AGVNuII。第二天开始每天对小鼠施以腹膜下注射500μg溶于5％DMSO葵花子油中的三苯氧胺，三天后，对在它们的饮用水中给以2mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素后三天，用[3H]甘露醇测定视网膜血管渗透性。简言之，对小鼠腹膜内注射1μCi/克体重[3H]甘露醇(New England Nuclear，Boston，MA)。一小时后，杀死该小鼠并取出眼睛。取出角膜和晶状体，仔细地从视杯中分离出完整视网膜并将其置于预先称重的闪烁瓶(scintillationvials)中。打开胸腔，取出左上肺叶并将其置于另一个预先称重的闪烁瓶中。做左背部切口，进入腹膜后隙而不进入腹膜腔。用镊子夹住肾血管，取出左肾，清除全部脂肪并将其放到一个预先称重的闪烁瓶中。除去瓶中的所有液体，并使瓶中的残余液体蒸发20分钟。给小瓶称重，记录组织重量。向各小瓶中加入一毫升NCSII溶解液(Amersham，Chicago，IL)，将小瓶在50℃水浴中孵育过夜。将溶解了的组织恢复至室温，并用溶于甲苯中的20％苯甲酰过氧化物使其在50℃水浴中脱色。将小瓶恢复至室温，加入五毫升Cytoscint ES(ICN，Aurora，OH)和30μl冰乙酸。4℃将小瓶在黑暗中保存数小时以除去化学发光。用Wallac 1409液体闪烁计数器(Gaithersburg，MD)对放射活性进行计数。
3)用荧光素泄漏估测视网膜血管渗透性对成年rho/rtTA-TRE/VEGF双重转基因小鼠右眼视网膜下注射1.5×106转导单位(TU)的BIVendostatin以及左眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVNuII。注射载体四周后，开始在小鼠的饮用水中加入0.5mg/ml强力霉素。四或七天后，对小鼠腹膜内注射12μl/g体重的1％荧光素钠(Alcon，Fort Worth，Texas)，一分钟后用体内荧光显微镜对各眼拍照。引发VEGF表达七天后，使另一只小鼠安乐死，在各眼中相同的位置沿与视神经相邻的视网膜后部做视网膜冷冻切片。切片用Griffonia simplicifolia lectin，苏木精、和曙红染色。用BIVNull注射的眼(F和H)中的视网膜比用BIVendostatin注射的眼(E和G)中的视网膜厚得多。
4)视网膜厚的测量对成年rho/rtTA-TRE/VEGF双重转基因小鼠右眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin和左眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVNull。注射载体四周后，开始在小鼠的饮用水中加入0.5mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素七天后，使小鼠安乐死，在各眼中相同的位置沿与视神经相邻的视网膜后部做10μm视网膜冷冻切片。切片用生物素化的Griffonia simplicifolia lectin B4(GSA，VectorLaboratories，Burlingame，CA)染色，该染料选择性结合于血管细胞22。将玻片在甲醇/H2O2中4℃孵育十分钟，用0.05M、pH7.6(TBS)Tris-缓冲盐溶液洗涤，并在10％正常猪血清中孵育30分钟。室温下将玻片与生物素化的GSA孵育2小时，用0.05M TBS漂洗后，将它们与缀合了过氧化物酶的抗生物素蛋白(Vector Laboratories)于室温下孵育45分钟。用HistoMark Red(Kirkegaard和Perry)使玻片显色以产生红色反应产物，并用苏木精和曙红复染。通过对离视神经各边缘300μm的图像做分析测定视网膜厚度，求平均值以得出单个实验值。
5)双重转基因小鼠中的视网膜新生血管形成的评估使用了三只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠评估内皮抑制素对由VEGF-诱导的视网膜新生血管形成的效果。右眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin以及左眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVNull四周后，开始在小鼠饮用水中加入0.5mg/ml强力霉素。开始使用强力霉素七天后，使小鼠安乐死，对各眼从虹膜外周边缘至相隔180°的另一边缘做切片(10μm切片)。切片用Griffonia simplicifolia lectin(GSA)、苏木精、和曙红染色。
光感受器层中的GSA染色面积是新生血管形成的指征，在虹膜的一条边缘至另一边缘100μm的切片(一般每只眼睛13张切片)上测定该面积。这13个测定值的平均值构成单个实验值，即每张切片的新生血管形成面积。
6)双重转基因小鼠中视网膜脱离的评估对十一只成年rho/rtTA-TRE/VEGF双重转基因小鼠右眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVendostatin以及左眼视网膜下注射1.5×106TU的BIVNuII。注射载体后四周，开始在小鼠饮用水中加入2mg/ml强力霉素。四天后，使小鼠安乐死，放大瞳孔，并由两位观察者独立对各眼做眼底镜检查，观察是否存在完全或部分视网膜脱离、或者没有脱离。
序列表<110>Novartis AG<120>眼的基因治疗<130>4-32625<160>21<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>183<212>PRT<213>人<400>1His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180<210>2<211>551<212>DNA<213>人<400>2acagccaccg cgacttccag ccggtgctcc acctggttgc gctcaacagc cccctgtcag 60gcggcatgcg gggcatccgc ggggccgact tccagtgctt ccagcaggcg cgggccgtgg120ggctggcggg caccttccgc gccttcctgt cctcgcgcct gcaggacctg tacagcatcg180tgcgccgtgc cgaccgcgca gccgtgccca tcgtcaacct caaggacgag ctgctgtttc240ccagctggga ggctctgttc tcaggctctg agggtccgct gaagcccggg gcacgcatct300tctcctttga cggcaaggac gtcctgaggc accccacctg gccccagaag agcgtgtggc360atggctcgga ccccaacggg cgcaggctga ccgagagcta ctgtgagacg tggcggacgg420aggctccctc ggccacgggc caggcctcct cgctgctggg gggcaggctc ctggggcaga480gtgccgcgag ctgccatcac gcctacatcg tgctctgcat tgagaacagc ttcatgactg540cctccaagta g 551<210>3
<211>207<212>PRT<213>小鼠<400>3Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro15 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val20 25 30Leu His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly35 40 45Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly50 55 60Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu65 70 75 80Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Gly Ser Val Pro Ile Val Asn85 90 95Leu Lys Asp Glu Val Leu Ser Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe Ser Gly100 105 110Ser Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly115 120 125Arg Asp Val Leu Arg His Pro Ala Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His130 135 140Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg Arg Leu Met Glu Ser Tyr Cys Glu Thr145 150 155 160Trp Arg Thr Glu Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu165 170 175Ser Gly Arg Leu Leu Glu Gln Lys Ala Ala Ser Cys His Asn Ser Tyr180 185 190Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ser Phe Ser Lys195 200 205<210>4<211>624<212>DNA<213>小鼠<400>4atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgcggccc atactcatca ggactttcag ccagtgctcc acctggtggc actgaacacc120cccctgtctg gaggcatgcg tggtatccgt ggagcagatt tccagtgctt ccagcaagcc180cgagccgtgg ggctgtcggg caccttccgg gctttcctgt cctctaggct gcaggatctc240tatagcatcg tgcgccgtgc tgaccggggg tctgtgccca tcgtcaacct gaaggacgag300gtgctatctc ccagctggga ctccctgttt tctggctccc agggtcaagt gcaacccggg360gcccgcatct tttcttttga cggcagagat gtcctgagac acccagcctg gccgcagaag420agcgtatggc acggctcgga ccccagtggg cggaggctga tggagagtta ctgtgagaca480tggcgaactg aaactactgg ggctacaggt caggcctcct ccctgctgtc aggcaggctc540ctggaacaga aagctgcgag ctgccacaac agctacatcg tcctgtgcat tgagaatagc600ttcatgacct ctttctccaa atag 624<210>5<211>8<212>PRT<213>人<400>5Ala Pro Gln Gln Glu Ala Leu Ala1 5<210>6
<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6actggtgacg cggcccatac tcatcaggac tttcagcc 38<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR 引物<400>11gatctctaga ccaccatgca tactcatcag gactt 35<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>12actggagaaa gaggtttatc tagctactag 30<210>13<211>18<212>PRT<213>腺病毒<400>13Met Arg Tyr Met Ile Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ala Val Cys Ser1 5 10 15Ala Ala<210>14<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>14gatctctaga ccaccatgag gtacatgatt ttaggcttgc tcgcccttgc ggcagtctgc 60agcgcggccc atactcatac tcatcaggac tttcag 96<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>15atcgatcata ctcatcagga ctttcagcc 29<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>16gcggccgcct atttggagaa agaggtcat 29<210>17
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR 引物<400>19ctatacagga aagtatggca gc 22<210>20<211>118<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>20gccaagcttc catgagggcc tggatcttct ttctcctttg cctggccggg agggctctgg60cagcccctca gcaagaagcg ctcgctcaca gccaccgcga cttccagccg gtgctcca 118<210>21<211>123<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR 引物<400>21ccaggtggag caccggctgg aagtcgcggt ggctgtgagc gagcgcttct tgctgagggg 60ctgccagagc cctcccggcc aggcaaagga gaaagaagat ccaggccctc atggaagctt120ggc 12权利要求
1.治疗患有视网膜脱离或视网膜水肿的个体的视网膜脱离或视网膜水肿的方法，包括使患有视网膜脱离或视网膜水肿的个体眼组织中的内皮抑制素量提高至抑制视网膜脱离或视网膜水肿的有效量。
2.权利要求1的方法，其中内皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。
3.权利要求1的方法，其中内皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的变体。
4.权利要求1的方法，其中所述提高是通过向个体施用外源内皮抑制素来实现的。
5.权利要求1的方法，其中所述提高是通过使个体内产生内皮抑制素来实现的。
6.权利要求5的方法，其中所述提高是通过向个体施用有效量的含有内皮抑制素编码核酸的病毒载体来实现的。
7.权利要求6的方法，其中该病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、和慢病毒。
8.权利要求7的方法，其中该病毒载体是腺病毒载体。
9.权利要求5的方法，其中所述提高是通过向个体内植入至少一个微囊来实现的，其中该微囊含有分泌内皮抑制素的细胞。
10.权利要求9的方法，其中该微囊含有藻酸盐。
11.权利要求10的方法，其中该微囊含有藻酸钠。
12.权利要求11的方法，其中该微囊含有藻酸钙。
13.权利要求12的方法，其中该微囊含有多聚L-赖氨酸。
14.权利要求9的方法，其中该细胞含有外源内皮抑制素编码核酸。
15.权利要求9的方法，其中该细胞过表达内源内皮抑制素编码基因。
16.权利要求4的方法，其中向个体施用约2.5mg/kg每天至约20mg/kg每天的内皮抑制素。
17.权利要求8的方法，其中以有效量施用腺病毒载体以使该个体表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生不超过1 000 000ng/ml的内皮抑制素浓度。
18.权利要求8的方法，其中以有效量施用腺病毒载体以使该个体表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生至少约300ng/ml的内皮抑制素浓度。
19.权利要求18的方法，其中内皮抑制素在个体中以有效量表达从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约3000ng/ml的内皮抑制素浓度。
20.权利要求19的方法，其中内皮抑制素在个体中以有效量表达从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约1500ng/ml的内皮抑制素浓度。
21.权利要求6的方法，其中载体以约108噬斑形成单位至约1014噬斑形成单位的量施用。
22.权利要求8的方法，其中载体以约108噬斑形成单位至约1014噬斑形成单位的量施用。
23.权利要求9的方法，其中微囊以有效量植入以使细胞表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生不超过1 000 000ng/ml的内皮抑制素浓度。
24.权利要求8的方法，其中微囊以有效量植入以使个体表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生至少约300ng/ml的内皮抑制素浓度。
25.权利要求18的方法，其中微囊以有效量植入个体从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约3000ng/ml的内皮抑制素浓度。
26.权利要求19的方法，其中微囊以有效量植入个体从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约1500ng/ml的内皮抑制素浓度。
27.权利要求6的方法，其中内皮抑制素编码核酸具有SEQ IDNO2所示的序列。
28.根据权利要求6的方法，其中病毒载体经眼内施用。
29.根据权利要求28的方法，其中病毒载体经视网膜下施用。
30.根据权利要求28的方法，其中病毒载体经玻璃体内施用。
31.根据权利要求7的方法，其中病毒载体为慢病毒载体。
32.权利要求33的方法，其中以有效量施用慢病毒载体以使该个体表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生不超过1 000 000ng/ml的内皮抑制素浓度。
33.权利要求32的方法，其中以有效量施用慢病毒载体以使该个体表达内皮抑制素从而在该个体血清中产生至少约300ng/ml的内皮抑制素浓度。
34.权利要求33的方法，其中内皮抑制素在个体中以有效量表达从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约3000ng/ml的内皮抑制素浓度。
35.权利要求34的方法，其中内皮抑制素在个体中以有效量表达从而在该个体血清中产生约300ng/ml至约1500ng/ml的内皮抑制素浓度。
36.权利要求31的方法，其中慢病毒载体为牛免疫缺陷病毒载体。
37.权利要求36的方法，其中牛免疫缺陷病毒载体经眼内施用。
38.权利要求37的方法，其中牛免疫缺陷病毒载体经视网膜下施用。
39.权利要求48的方法，其中牛免疫缺陷病毒载体经玻璃体内施用。
40.权利要求6的方法，其中的提高是通过向个体施用病毒载体而可诱导地实现的，所述病毒载体能够使得在个体内产生将诱导内皮抑制素编码核酸表达的物质。
41.权利要求36的方法，其中牛免疫缺陷病毒载体经眼周施用。
42.权利要求6的方法，其中病毒载体经眼周施用。
43.内皮抑制素在生产用于治疗患有视网膜脱离或视网膜水肿的个体中的视网膜脱离或视网膜水肿的药物中的用途，其中所述内皮抑制素特别是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽。
44.权利要求43的用途，其中内皮抑制素是具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的变体。
45.权利要求43的用途，其中在眼组织中引起内皮抑制素量提高。
46.权利要求45的用途，其中所述提高是通过施用有效量含有内皮抑制素编码核酸的病毒实现的。
47.权利要求46的用途，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、和慢病毒。
48.权利要求46的用途，其中所述提高是通过在患有视网膜脱离或视网膜水肿的个体中植入至少一个微囊实现的，其中该微囊含有分泌内皮抑制素的细胞。
全文摘要
提供了通过提高患有VEGF－诱导的视网膜脱离或视网膜水肿的个体的眼组织中体内内皮抑制素蛋白浓度至抑制视网膜脱离或视网膜水肿有效量来治疗VEGF－诱导的视网膜脱离或视网膜水肿的方法。
文档编号A61K38/39GK1708513SQ03823134
公开日2005年12月14日 申请日期2003年8月27日 优先权日2002年8月28日
发明者P·A·坎普契亚罗, M·卡莱克 申请人:诺瓦提斯公司