专利名称：抑制艾滋病病毒感染的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制艾滋病病毒(即造成获得性人体免疫缺乏综合征的病毒)感染的药物组合物，所说的组合物包括D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物作为有效成分。本发明还涉及抑制人体T-细胞被造成获得性免疫缺乏综合征的病毒感染的方法，其中包括用D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物处置人体T-细胞。本发明也包括使用D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物制造抗AIDS病毒的抗病毒组合物。
据发现，获得性免疫缺乏综合征(有时只叫作艾滋病，“AIDS”)是因人体T-细胞被人体血液中的致病病毒感染而引起的疾病。这种导致获得性免疫缺乏综合征的病毒，通常叫作获得性免疫缺乏综合征病毒，常常简记作HIV或AIDS病毒。据报导，某些已知化合物可以用作使HIV灭活的药剂或抗HIV的抗病毒剂。但是，这些已知的化合物作为治疗艾滋病的有用治疗剂使用时，没有一种化合物是令人满意的。
艾滋病是一种给人类社会带来严重问题的重要疾病，因此人们强烈而迫切地要求开发和提供出一些新的高效药物，这些药不仅毒性低，而且对于抑制HIV感染具有高活性，希望将这些药作为治疗或预防性处置艾滋病病人的有用的药剂。
另一方面，D-β-赖氨酰甲二胺是具有抗革兰氏阳性细菌的低抗菌活性的一种已知的抗菌素，它利用一种微生物StreptomycesnashvillensisMD743-GF4生产(参见“JournalofAntibiotics”，Vol.39No.3，476-478页，1986年，和1987年5月26日公开的特开昭62-114947号日本专利申请的说明书)。D-β-赖氨酰甲二胺具有由下式(I)表示的独特结构
D-β-赖氨酰甲二胺半碳酸盐呈无色粉末状，它具有吸湿性而且没有可测量的确定的焙点，其比旋光度[α]26D为-7.4°(浓度0.5，水)。
我们发现，D-β-赖氨酰甲二胺，其盐或水合物对于人体T-细胞被HIV感染表现出高抑制活性，尤其是在将人体T-细胞用D-β-赖氨酰甲二胺或其盐或水合物处置后在培养基中培养过，再使之与HIV接触时，人体T-细胞被HIV的感染在D-β-赖氨酰甲二胺或其盐水或水合物盐作用下能够得到抑制。D-β-赖氨酰甲二胺、其盐和水合物对于抑制人体T-细胞被HIV感染来说具有很高活性，而且广而言之具有抗HIV的抗病毒活性。
因此，本发明首先提供一种抑制被造成获得性免疫缺乏综合征的病毒感染的药物组合物，其中包含作为活性成分的D-β-赖氨酰甲二胺(式I)、其盐或其水合物，
同时还包含所说活性成分的可药用载体。
其次，本发明包括一种抑制人体T-细胞被造成获得性免疫缺乏综合征的病毒感染的方法，包括使用抑制感染所说病毒有效量的、上面示出的D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物处置人体T-细胞。
此外，本发明还包括使用式(I)的D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物，制造用于抑制感染导致获得性免疫缺乏综合征的病毒用的药物组合物。
本发明也涉及制造抑制感染导致获得性免疫缺乏综合征的病毒用药物组合物的方法，其中包括D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物与可药用的载体混合。
用作活性成分或本发明化合物的D-β-赖氨酰甲二胺，是一种水溶性碱性物质，能够与酸(无机或有机酸)形成酸加成盐。适用于形成这样的酸加成盐的酸，包括可药用的无机酸，例如盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、硝酸等等，以及可药用的有机酸，例如乙酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲磺酸等等。
本发明使用的D-β-赖氨酰甲二胺，特征在于其对于哺乳动物的低毒性。例如，在评定此化合物的急性毒性试验中，给鼠静脉注射了D-β-赖氨酰甲二胺，结果发现接受D-β-赖氨酰甲二胺用药的鼠能耐受250mg/Kg的D-β-赖氨酰甲二胺而不致死。
本发明的药物组合物包含D-β-赖氨酰甲二胺、其酸加成盐或水合物作为活性成分，同时还包含所说活性成分的可药用的固体或液体载体;所说的组合物可以按常规方式制成传统剂型的药剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂、糖浆、注射剂等等口服或非肠道给药的剂型。
为了证明D-β-赖氨酰甲二胺对于抑制人体T-细胞感染HIV(即艾滋病病毒)具有很高活性，作为下列分析试验，其操作步骤如下试验例1按照与在“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，80，6061-6065(1983);“J.Antibiot.”，40，1077-1078(1987);“J，Antibiot”.，42，344-346(1989)和“J.Antibiot”，44，1228-1236(1991)中所述的试验方法相似的方式，测定了D-β-赖氨酰甲二胺抑制人体T细胞感染HIV的效果。
将处于磷酸盐缓冲的盐水中的MT-4细胞(人体T-细胞系)(1×105个细胞/毫升)接种到48孔的Costar板上，每孔接种0.5ml。在每个孔中加入0.05ml试验化合物(即D-β-赖氨酰甲二胺)溶液(在磷酸盐缓冲的盐水中溶解浓度为3、10、30和100μg/ml的试验化合物)。在5%CO2和37℃下培养2小时之后，使MT-4细胞感染0.05mlHIV(HTLV-IIIB菌株)，每个孔的多重感染(m.o.i.)量为0.025-0.05。在37℃和5%CO2下将试验板培养4天，以便使所说的T-细胞在不同浓度试验化化合物存在下得到处理。取出数份培养过的培养物，将所说的MT-4细胞涂抹在载玻片上，干燥后用丙酮固定之。利用间接免疫萤光分析法[参见Y.Himuna等，“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”，78，6476-6480(1981)和Y.Tackeuchi等，“Gann.”，78，11-15(1987)]检查存在的HIV抗原阳性的MT-4细胞。细胞涂斑在37℃下用在磷酸盐缓冲的盐水中稀释度为1∶10的艾滋病病人血浆处置30分钟后，作为第一抗体。用磷酸盐缓冲的盐水洗涤之后，将此MT-4细胞在37℃下用有萤光的结合有异硫代氰酸盐的免抗人体IgG血浆(美国宾西法尼亚州CochranvilleCappel实验室)处置30分钟作为第二抗体。细胞涂斑经磷酸盐缓冲的盐水洗涤后盖上盖玻片，在萤光显微镜下测定MT-4细胞。计算出病毒抗原阳性的MT-4细胞(即表示结合HIV的抗原的免疫萤光细胞)数在总细胞数中的百分数。
对照试验中，不加D-β-赖氨酰甲二胺的条件下重复上面的试验操作。
此外，D-β-赖氨酰甲二胺对MT-4细胞的细胞毒性是按下法评定的按照和上面提到过的用来试验D-β-赖氨酰甲二胺抑制T-细胞感染HIV活性所用试验操作相同的方法，采用与MT-4细胞培养相同的条件和相同的方式，在无HIV存在下，加入不同浓度的D-β-赖氨酰甲二胺培养MT-4细胞。下表1中，符号“-”表示未观察到所说的细胞毒性。
为了评定D-β-赖氨酰甲二胺抑制人体T-细胞(即MT-4细胞)感染HIV的活性，计算了T对C的百分数T/C%其中T是在上面提到的试验中即在试验化合物存在下培养MT-4细胞时测得的HIV抗原阳性细胞的数目;而C是在上面提到的对照试验中，即不加试验化合物培养MT-4细胞时测得的HIV抗原阳性细胞的数目。表1中列出了这种T/C值(%)的计算结果，用存在或产生HIV抗原阳性细胞的比例(%)表示。
表1试验化合物存在HIV抗原阳性细胞浓度细胞的比例毒性(μg/ml)(%)330-1015-3010-1005-上表1中试验结果清楚地说明，按本发明使用D-β-赖氨酰甲二胺证明没有细胞毒性，即使浓度为100μg/ml也是如此;而且在浓度不高于100μg/ml条件下能够显著地减少HIV抗原阳性细胞的数目;换句话说，能够显著地抑制HIV病毒抗原的存在。D-β-赖氨酰甲二胺抗HIV的50%有效浓度(ED50)为0.62μg/ml。
此事实表明由于D-β-赖氨酰甲二胺存在，HIV不能在MT-4细胞中增殖，从而使HIV病毒抗原在人体T-细胞中的发展能够得到抑制。
然而，人们通过近代实验发现，浓度为100μg/ml的D-β-赖氨酰甲二胺既未对HIV的逆转录酶表现出抑制活性，又未对HIV的蛋白酶表现出抑制活性。
因此，D-β-赖氨酰甲二胺能够有效地抑制人体T-细胞感染HIV显然是按迄今未知的机理作用的。
顺便指出，上面提到的试验同时还用DDI(即2′，3′-二脱氧肌苷)重复过，DDI是近来用于治疗艾滋病的药物;结果发现，DDI抗HIV的ED50值为0.46μg/ml，这说明DDI抑制人体T-细胞感染HIV的效果，与本发明的D-β-赖氨酰甲二胺的效果相当。
在实际给药时，一般情况下既可以以抑制感染HIV的抗病毒剂形式也可以以使HIV灭活的药剂形式经口或非肠道施用D-β-赖氨酰甲二胺。
按本发明使用的活性成分化合物(即D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物)以抑制感染HIV的或使HIV灭活的抗病毒剂给药时，可以单独地或者以制剂形式(如含有与赋形剂或载体混合态下之所说活性化合物的注射剂、口服制剂或栓剂等等)给药。可购买到的任何药用的赋形剂或载体都适于此目的。所用载体的性质和组成可以依给药途径和方式而变化。例如，作为液体载体可以使用水、乙醇、动物油或植物油(如豆油、芝麻油)或矿物油或合成油。适用的固体载体包括糖例如麦芽糖或蔗糖，氨基酸，羟丙基纤维素等纤维素衍生物，环糊精等多糖，硬脂酸镁等有机酸盐等等。
制备注射剂时，一般优选的液体介质包括生理盐水、各种缓冲溶液、糖(如葡萄糖、肌醇、甘露糖醇的水溶液，或二元醇如乙二醇或聚乙二醇。也可以制成冻干制剂，其中含D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物作为活性成分，并且还混合有赋形剂，例如糖(如肌醇、甘露醇、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖)或氨基酸(如苯基丙氨酸)。给药时，可以将这样的冻干制剂溶解于适当的注射用溶剂中，例如无菌水或静脉注射用液体(如生理盐水、葡萄糖水溶液、电解质水溶液或氨基酸水溶液)中。
D-β-赖氨酰甲二胺在所制成的组合物中存在的比例可以因制剂不同而有很大的变化，但是一般情况下该比例处于0.1～100重量%范围内，优选1-90重量%。制备注射剂时，例如一般情况下最好使可注射的溶液含有浓度为0.1-5重量%的D-β-赖氨酰甲二胺作为活性成分。对于口服给药来说，可以将作为活性成分的化合物与固体载体一起制成片剂、胶囊、粉剂或颗粒剂，或者可以与液体载体一起制成溶液或糖浆等等。在胶囊、片剂、颗粒剂或粉剂之中，其中作为活性成分存在的D-β-赖氨酰甲二胺的比例，一般处于大约3-100重量%范围内，优选5-90重量%，余量为载体。
D-β-赖氨酰甲二胺的剂量，可以根据病人的年令、体重和症状以及预期的治疗目的来适当确定。D-β-赖氨酰甲二胺的治疗(即有效)剂量，对于非肠道给药和口服来说，一般情况下分别为1-100和5-500mg/Kg/天。此剂量既可以连续地也可以间歇地给药，只要总剂量不超过由动物试验和各种因素确定的这种指定水平就行。
同样，为非肠道给药规定的所说总剂量，当然也可以根据给药方式，接受治疗的病人或动物的条件(如年令、体重、性别、敏感性、食物或饲料、给药时间、给药途径、同时服用的药物、以及病人和疾病的情况)作适当变化。在给定的条件下，D-β-赖氨酰甲二胺的适用剂量和给药频率，必须由专门医生根据确定最佳剂量的试验和按照上述指导确定。这些用药要求也应当适用于口服D-β-赖氨酰甲二胺。
以下参照下列实施例详细说明本发明，这些实施例说明本发明的抑制感染HIV用组合物的各种剂型。
实施例1向10克D-β-赖氨酰甲二胺盐酸盐中加入适量纯水。化合物在水中溶解之后，使之通过商品名为“MilliporeFilterGS)的微孔过滤器，用这种方法使所制备的溶液(100ml)无菌过滤。取出如此制得的1ml无菌滤液，各放入一个5ml小瓶中，然后冷冻干燥之，得到一种注射用的冻干制剂，每个小瓶中含100mgD-β-赖氨酰甲二胺盐酸盐。
实施例2将5克D-β-赖氨酰甲二胺盐酸盐、60克乳糖、33克结晶纤维素和2克羟丙基纤维素共同充分混合。形成的粉末混合物用辊型压力机(商标名RollerCompactor)压制后破碎形成的被压的固体。将如此破碎的物质过筛，收集粒度为16～60目的粒颗部分作为所需的颗粒型剂。
实施例3将3克D-β-赖氨酰甲二胺、12克结晶乳糖、5克结晶纤维素和0.3克硬脂酸镁共同在V型混合机中混合后压成片，每片含50mgD-β-赖氨酰甲二胺作为活性成分。
因为D-β-赖氨酰甲二胺是利用培养已知微生物(StreptomycesnashvillensisMD743-GF4菌株)的方法生产的，所以将所说的发酵法生产这种抗生素的方法说明如下。
可以按如下方法生产D-β-赖氨酰甲二胺在含能被一般微生物利用的营养源的培养基中接种所说的MD743-GF4菌株，然后在有氧条件下培养所说的菌株。D-β-赖氨酰甲二胺产自所说的培养肉汤中并于其中初步积聚，然后从所产生的培养物中，尤其是从所说的培养肉汤或其滤液中加以回收。
用于培养的培养基中适用的营养源，可以是可用来作为培养已知放线菌(Actinomycetes)菌株的营养源的任何传统的碳源和氮源。例如，可同化的氮源可以包括豆粉、花生粉、棉籽粉、干酵母、蛋白胨、肉汁、酪蛋白、玉米浆液、硝酸钠和硫酸铵，这些都能从市场上买到。可同化的碳源可以包括市售的碳水化合物如葡萄糖、半乳糖、淀粉、甘油、麦芽糖糊精、蔗糖、乳糖或豆油和脂肪。所说的培养基还可以含无机盐(如氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、氯化锰、硫酸铵和磷酸铵类，此外还可以包含各种氨基酸。适于培养已知放线菌的营养物质，都可以用来培养所说的MD743-GF4菌株，条件是这些物质能够被生产D-β-赖氨酰甲二胺的菌株所利用而且适于这种微生物生产D-β-赖氨酰甲二胺。
培养所说的MD743-GF4菌株时，优选采用有氧和搅动下的浸没液体培养法来工业化生产D-β-赖氨酰甲二胺。培养温度可以在产生D-β-赖氨酰甲二胺的菌株能够生长和产生所需的D-β-赖氨酰甲二胺的温度范围内选择。具体地讲，培养温度优选为25～30℃。MD743-GF4菌株的培养通常可以持续到在形成的培养物中产生和积累了足够量D-β-赖氨酰甲二胺时为止。一般来说，培养可以进行2-7天。
D-β-赖氨酰甲二胺、其酸加成盐和水合物易溶于水中，而且主要存在于产生D-β-赖氨酰甲二胺的菌株之培养物的液体部分之中。存在于培养物液体部分中的D-β-赖氨酰甲二胺基本上不能用丁醇、乙酸丁酯、氯仿和其它有机溶剂所萃取，因此必要时可以利用这些有机溶剂除去所不需要的化合物或共同存在的杂质。存在于培养肉汤或水溶液中的D-β-赖氨酰甲二胺，可以用各种吸附剂吸附法回收。用活性炭作吸附剂时，被吸附的抗生素，即D-β-赖氨酰甲二胺可以通过用弱酸性水或弱酸性的甲醇水溶液、丙醇水溶液或丙酮水溶液等等洗脱的方法从活性炭中解吸。
由于D-β-赖氨酰甲二胺呈碱性，所以此化合物能有效地被阳离子交换树脂吸附，并且用适当的洗脱剂从树脂中洗脱。适于此目的阳离子交换树脂包括含羧基宫能团的H-型、Na-型或NH4-型阳离子交换树脂，如Amberlite IRC-50 Amberlite CG-50(美国Rohm & Haas公司出品，商品名)、Lewatit CNP(商品名，德国Bayer公司出品)和CM-Sephadex(商品名，瑞典Pharmacia公司出品)，可单独或混合使用。用酸性水、稀氨水或无机盐的水溶液等等可以有效地从树脂中洗脱被树脂吸附的抗生素。通常可以使用0.1～1N盐酸和0.5-2N氨水制备所说的洗脱剂。D-β-赖氨酰甲二胺基本上不能被阴离子交换树脂吸附，此性质可以用于中和含所说化合物的酸性溶液或者从所说化合物中除去酸性杂质。
通过将上述的提取法和分离法适当组合或者重复使用一或多个这样的方法，可以获得纯净的D-β-赖氨酰甲二胺。
产生D-β-赖氨酰甲二胺的菌株StreptomycesnashvillensisMD743-GF4，其微生物学性质详细地记载于上面说到的日本专利申请特开昭62-114947的说明书中。这种MD743-GF4菌株的微生物学性质总结如下。
在显微镜下观察到MD743-GF4菌株具有需氧菌丝螺旋状从中发展的分支底物菌丝。无旋转物形成。成熟孢子的链是多于20个孢子的链，而且孢子的尺寸为0.6-0.7×1.4-1.7微米并具有光滑的表面。在各种培养基中，MD743-GF4菌株表现出从无色长成深黄棕色，或者随着白色至淡褐灰色的需氧菌丝的发展而形成淡褐色，而且几乎都不形成可溶性色素或形成极少的淡黄色可溶色素。以黑色素为特征的色素的形成呈阳性。MDF743-GF4菌株的蛋白质分解作用程度为中等，而且淀粉水解活性程度相当强。比较发现，MD743-GF4菌株与已知微生物StreptomycesnashvillensisIMCS-0342(ISP5314)相当一致(参见“InternationalJournalofSrstematicBacteriologr”，Vol.19，455页，1969年)，唯一的例外是MD743-GF4菌株未呈现利用D-木糖的作用，而IMCS-0342菌株(ISP5314)却表现出利用D-木糖的作用。
上述的StreptomycesnashvillensisMD743-GF4菌株于1985年9月7日保藏在(FERMP-8442)而且于1991年12月25日再次保藏在日本国际贸易和工业部工业科学技术办事处的日本主管保藏单位“发酵研究所”之中，自1991年12月25日起保藏号为“FERMP-12676”。这种MD743-GF4菌株现在按布达佩斯条约规定，以保藏号“FERMBP-4127”保藏在“发酵研究所”中，此所设在日本Ibaragi省筑波城中。
此外，发酵生产D-β-赖氨酰甲二胺的实例在下列参照例中加以说明。
参照例1将在斜面琼脂培养基中培养过的一定量Streptomycesnashvillensis.MD743-GF4菌株(FERMP-12676，但是按布达佩斯条约已转变成新保藏号“FERMBP-4127”)接种在一种液体培养基之中，该液体培养基含有2.0%半乳糖、2.0%糊精、1.0%胨(以商品名“Bacto-Soytone”出售的Difco公司产品)，0.5%玉米浆液(Ajinomoto公司出品)、0.2%硫酸铵和0.2%碳酸钙，该液体培养基处于数个500ml锥形瓶中110ml处。在旋转振摇(180转/分)下将接种的培养基在28℃下培养2天，以提供第一接种培养物。致此第一接种培养物各2ml接种到处于90个锥形瓶中的110ml组成如上的液体培养基中，在与上述同样的培养条件下将这90个锥形瓶中的已接种的培养基培养3天。
收集此法得到的培养肉汤后合并之，过滤得到9000ml培养肉汤滤液(pH6.0，其效力为80μg/ml)。使此滤液通过有550ml阳离子交换树脂AmberliteIRC-50(NH4型与H型的7∶3混合物)的柱，以便用树脂吸附D-β-赖氨酰甲二胺。树脂柱用1100ml水洗涤后，用1.2N氨水洗脱，收集洗脱液的活性馏份，合并(1370ml)后减压浓缩至干，得到636mg粗品粉末(效力为644μg/mg)。
将此粗品粉末溶解在10ml水中，使得到的水溶液通过有60mlAmberlite CG-50(NH4型)的柱，吸附所说的活性化合物。树脂柱用120ml水洗涤(按编号1～18收集柱流出液的诸馏份)后，用300ml0.6N氨水洗涤(收集的流出液按馏份19～60编号)。最后用300ml1.2N氨水洗脱树脂柱得到洗脱液的诸馏份61～101。
将馏份77～95合并，浓缩至干后进一步干燥产出D-β-赖氨酰甲二胺半碳酸盐，是一种吸湿性无色粉末状物质。产出量370mg(效力为1000μg/mg)，而且根据培养肉汤计算出的产率为50.8%。此物质的比旋光度值为[α]26D＝-7.4°(C0.5，水)。此物质吸附水后变成无色浆状。
权利要求
1.一种抑制感染导致获得性人体免疫缺乏综合征的病毒的药物组合物，其中包含式(Ⅰ)D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物作为活性成分，(R)
同时还包含所说活性成分的可药用的载体。
2.一种抑制人体T-细胞感染导致获得性人体免疫缺乏综合征的病毒的方法，其中包括用抑制感染所说病毒有效量的权利要求1所述的式(I)D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物处置人体T-细胞。
3.使用权利要求1所述的式(I)的D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物，制造抑制被导致获得性人体免疫缺乏综合征的病毒感染的药物组合物。
4.一种制造抑制感染导致获得性人体免疫缺乏综合征的病毒的药物组合物的方法，其中包括将权利要求1所述的D-β-赖氨酰甲二胺、其可药用盐或水合物与可药用的载体混合。
全文摘要
本发明提供了含D-β-赖氨酰甲二胺、其盐或水合物的药物组合物，该组合物可以用于抑制人体T—细胞感染HIV，即导致获得性人体免疫缺乏综合症(艾滋病)的病毒。因此，D-β-赖氨酰甲二胺及其盐或水合物可以用作抗HIV的抗病毒剂。
文档编号A61K31/16GK1092979SQ93103320
公开日1994年10月5日 申请日期1993年3月27日 优先权日1993年3月27日
发明者近藤信一, 池田洋子, 滨田雅, 竹内富雄, 星野洪郎 申请人:财团法人微生物化学研究会