专利名称：具有抑制转录因子klf5的活化作用的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有非环式聚异戊二烯基类化合物作为有效成分，具有抑制转录因子KLF5活化作用的药物。
背景技术：
近年来，以动脉硬化为代表的血管疾病剧增，在即将迎来老年化社会的我国，开发出预防或治疗血管疾病的药物是非常重要的课题。血管平滑肌增殖和作为治疗动脉硬化以及虚血性心脏疾病的冠状动脉血液循环重建手术后的再次狭窄产生症密切相关。然而，对损伤的血管的平滑肌的性质和个体产生的过程所具有的血管特征、性质还不完全了解。担负平滑肌的分化和产生的分子结构的解明可能成为以动脉硬化为代表的和平滑肌相关的血管疾病的预防药、治疗药的突破口。另外，平滑肌细胞具有显示出性质可塑性的特征。在正常的血管中，可以认为是分化的收缩型性质的细胞，相对于此，在血管病变时，认为性质改变为具有增殖能力的脱分化平滑肌细胞。理解平滑肌细胞的脱分化的机理，可以成为了解血管疾病的病理，进一步开发出新的治疗方法的突破口。
本发明人通过对脱分化平滑肌的特异地显现出的平滑肌肌凝蛋白重链基因的表达控制进行研究，成功地分离出起到该基因的表达控制的转录调节因子KLF5(Kruppel-like factor5)/BTEB2/IKLF(以下，在本说明书中，也简称为“KLF5”)(Circulation Research，85，pp.182-191，1999)。KLF5在胎儿和新生儿期在血管中出现，在成体中出现的少，但是在动脉硬化等血管病变中会被诱导显示。抑制KLF5出现的反义(antisense)实验中由于可以抑制平滑肌的特异增殖，所以可以认为KLF5是起到平滑肌增殖的重要因子。因此，开发出具有抑制KLF5活性作用的药物，可以用作预防和治疗血管疾病的新药物。
本发明人发现结合到使动脉硬化恶化的蛋白质的启动子上，诱导高的表达活性，利用KLF5的这种性质，控制平滑肌细胞的性质转换的物质评价方法以及提供评价方法使用的宿主细胞的方法(特开平11-318450号公报)。此外，本发明人还成功地制造KLF5的基因敲除小鼠(Nature Medicine，8，pp.856-863，2002)。对于基因敲除小鼠来说，同种接合体是胎儿致死性，而且杂合体的幼鼠一切正常，但是对血管障碍的内膜形成反应显著降低，血管紧张肽II引起的心脏肥大和纤维化显著降低。此外，对于杂合体来说，来自血小板的增殖因子(PDGF)降低到野生类型的一半左右，可以判明PDGF是控制KLF5的转录的目标基因。另外，维生素A酸衍生物(维生素A酸激动剂Am80)在使用细胞的普特分析中，抑制KLF5引起的PDGF-A转录，另外，投入到野生的老鼠中可以抑制堵塞血管形成新生内膜。另一方面，维生素A酸拮抗剂促进PDGF-A转录，在投入到野生老鼠时，促进堵塞血管的新生内膜的形成(Nature Medicine，8，pp.856-863，2002)。
另一方面，非环式聚异戊二烯基化合物的一种是(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸(以下，在本说明书中，也将该物质称作“NIK-333”)，已知该物质对维生素A酸结合蛋白和维生素A酸受体显示出亲和性，对肝细胞癌具有分化诱导作用和凋亡诱导作用。在临床中，长期给药1年时间的NIK-333可以有效抑制肝癌根治治疗后的复发，教导了该物质具有抑制肝癌复发的作用。此外，NIK-333几乎没有肝功能障碍以及其他的类视色素(retinoid)所确认的副作用，可以作为安全性高的药品使用(N.Eng.J.Med.，334，pp.1561-1567，1996)。然而，到目前为止还不知道非环式聚异戊二烯基化合物可以抑制作为转录因子的KLF5的活化，此外，也不知道该物质具有抑制血管重建作用和抑制动脉硬化作用。
发明内容
本发明的课题在于提供具有抑制转录调节因子KLF5的活化作用的药物。另外，本发明的课题还提供具有抑制转录调节因子KLF5的作用，且具有抑制血管重建和动脉硬化作用的药物。
本发明人为了解决上述课题，对具有抑制转录调节因子KLF5活化作用的化合物进行认真的研究。结果发现，NIK-333等非环式聚异戊二烯基化合物具有抑制转录调节因子KLF5的活化的作用，以及该非环式聚异戊二烯基化合物具有抑制血管重建和动脉硬化作用。本发明是基于上述认识完成的。
也就是，根据本发明可以提供一种具有抑制转录因子KLF5的活化作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分。另外，根据本发明可以提供一种具有抑制血管重建作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分；本发明还提供一种具有抑制动脉硬化作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分。
根据上述发明的优选方案，可以提供非环式聚异戊二烯基化合物为聚异戊二烯羧酸的上述药物，非环式聚异戊二烯基化合物为3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸的上述药物以及非环式聚异戊二烯基化合物为(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸的上述药物。进一步的，根据优选的方案，还提供含有有效成分非环式聚异戊二烯基化合物和药学上所允许的制剂添加剂的药物组合物形式的上述药物，以及口服给药方式的上述药物。
基于另外的观点，还提供用于制造上述药物的非环式聚异戊二烯基化合物的应用；在哺乳动物(包括人类)的体内，抑制转录因子KLF5的活化的方法，该方法包括将有效量的非环式聚异戊二烯基化合物投入到哺乳动物(包括人类)的工序；抑制血管重建的方法，该方法包括将有效量的非环式聚异戊二烯基化合物投入到哺乳动物(包括人类)的工序；以及预防动脉硬化的方法，该方法包括将有效量的非环式聚异戊二烯基化合物投入到哺乳动物(包括人类)的工序。
发明效果本发明的药物具有抑制转录因子KLF5的活化作用，所以可以用于抑制血管重建和抑制动脉硬化。
图1是表示将KLF5和RARα共同转染到COS1细胞上，搭载NIK-333，进行荧光素酶分析的结果。
图2是表示将KLF5和RARα共同转染到COS1细胞上，搭载NIK-333和ATRA，进行荧光素酶分析的结果。
图3是表示将KLF5和RARβ、γ共同转染到COS1细胞上，搭载NIK-333和ATRA，进行荧光素酶分析的结果。
图4是表示在3T3细胞上搭载NIK-333或ATRA，计测24、36和48小时后的活细胞的数量的结果。
图5是表示在3T3-KLF5细胞和对照细胞上搭载NIK-333或ATRA，测定活细胞数的结果。
图1中的纵座标为PDGF-A启动子的活性(PDGF-Aプロモ-ダ-活性)。
图2中的纵座标为PDGF-A启动子的活性。
图3中的纵座标为PDGF-A启动子的活性。
图4中的纵座标为活细胞数；横座标为对照二甲基亚砜(DMSO)的浓度，图中黑色表示采用ATRA，空白表示NIK-333。在三幅小图中分别表示不同的计测时间。
图5中的纵座标为活细胞百分率。
具体实施例方式
作为本发明的药物的有效成分使用的非环式聚异戊二烯基化合物是含有几个直链异戊二烯单元的化合物。非环式聚异戊二烯基化合物的末端的官能团种类没有限定。可以列举出例如末端具有伯烯丙基羟基的聚异戊二烯醇(聚普楞醇)、聚普楞醇末端羟基和有机酸形成酯的化合物、末端具有羧基的聚异戊二烯羧酸等，但是并不限于此。优选使用聚异戊二烯羧酸。作为非环式聚异戊二烯基化合物可以使用纯的形态的任意的几何异构体或几何异构体的任意的混合物。适用于本发明的非环式聚异戊二烯基化合物是3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸，特别合适的是使用(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸。这些化合物是特公昭63-32058号公报和J.Chem.Soc.(c)，2154，1966中记载的公知的物质，可以通过上述刊物中记载的方法容易地制造。另外，参照上述刊物中记载的方法，本领域技术人员也可以容易地制造其他的非环式聚异戊二烯基化合物。
作为本发明的药物可以直接将非环式异戊二烯基化合物给药，但是通常希望和1或者2种以上的制剂添加物一起制备药物组合物后给药。本发明的药物的给药途径没有特别的限定，可以选择口服给药或非口服给药的任何一种给药途径。作为适合口服给药的药物组合物可以列举出例如片剂(素片剂或糖衣片剂等)、颗粒剂、细粒剂、散剂、糖浆、溶液剂、胶囊剂(硬胶囊或软胶囊等)或悬浮剂等。作为合适非口服的制剂的例子，可以列举出例如注射剂、点滴剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。
作为制剂添加剂可以列举出例如稳定剂、表面活性剂、增塑剂、润滑剂、增溶剂、缓冲剂、甜味剂、基质、吸附剂、矫味剂、结合剂、悬浮剂、增亮剂、编码剂、增香剂·香料、润湿剂、润湿调节剂、填充剂、除泡剂、咀嚼剂、清亮剂、着色剂、糖衣剂、等渗化剂、pH调节剂、软化剂、乳化剂、粘合剂、增粘剂、粘稠剂、粘稠化剂、发泡剂、赋形剂、分散剂、喷射剂、崩解剂、崩解助剂、芳香剂、防湿剂、防腐剂、保藏剂、止痛剂、溶剂、溶解剂、溶解助剂、流化剂等，也可以将它们的2种或以上组合使用。这些制剂添加物的具体例子，例如如药品添加剂事典(日本药品添加剂协会编，药事日报社发行)所说明，本领域技术人员可以根据药物组合物的形态，选择适当的制剂添加剂，根据本领域常用的方法，制造所希望形态的药物组合物。例如，作为制剂添加剂可以使用纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇或生物学地调制的溶剂等。另外，在PCT/JP/03/10440号说明书中公开了包含3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸的软胶囊，该软胶囊可以作为本发明的药物使用。
本发明的药物在哺乳动物(包括人类)中具有抑制转录因子KLF5的活化的作用。通过本说明书的实施例的具体说明，本领域技术人员可以容易地确认本发明的药物的上述作用。另外，本发明的药物基于上述抑制转录因子KLF5的活化作用，具有抑制血管重建和/或动脉硬化的作用。和进行动脉硬化相关的高血压等疾病已知血管在各种负担下反应，血管壁的细胞结构变化，产生血管重建。所述的血管重建是由于血流量变化和血管壁张力变化等血流动态变化导致的血管结构的变化。通过本发明的实施例具体例示的方法(例如，对纤维母细胞的细胞增殖的抑制作用和使用封套阻碍模式的评价等)，本领域技术人员可以容易地确认本发明的药物对血管重建和/或动脉硬化的抑制作用。
本发明的药物的给药量和给药次数没有特别的限定，通常作为有效成分重量，可以选择一天给药0.001mg～1,200mg左右，典型地，成人每天是100mg～1,000mg左右。上述给药量希望根据患者的年龄和体重等条件、疾病的种类等适当增减。另外，上述的一天给药量也可以分几次给药。
实施例以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但是本发明的范围并不限于下述实施例。
例1-1对转录因子KLF5的活化的效果以5×104个/孔的比例在24孔板上放置COS1细胞，在37℃的5％CO2的细菌培养器中培养12小时。转染使用TransFast(登记商标，プロメガ社制造)转染试剂，根据其原始记录进行。也就是，添加pCAG/KLF5或其空的载体(pCAG)、pCMX/RARα或其空的载体(pCMX)和PDGF-A启动子(-900)-荧光素酶(Luciferase)，在37℃的5％CO2的细菌培养器中培养48小时。NIK-333溶于二甲基亚砜(DMSO)添加到为10-7～10-5M。之后，使用Dual Luciferase Reporter AssaySystem(プロメガ社制造)，进行荧光素酶分析。结果如图1所示。对KLF5的空的载体和RARα的空的载体(Lane1)、引入只有KLF5的基因(Lane2)以及引入只有RARα的基因(Lane3)进行比较，通过引入KLF5和RARα的基因，确认PDGF-A启动子的活化(Lane4)。该RARα的强表达下，依赖KLF5的PDGF-A启动子活化作用受到NIK-333抑制(Lane5、6、7)。此外，NIK-333的作用从10-7M起确认有浓度依赖性。因此，可以知道NIK-333具有抑制转录因子KLF5活化作用。
例1-2对转录因子KLF5的活化的效果以5×104个/孔的比例在24孔板上放置COS1细胞，在37℃的5％CO2的细菌培养器中培养过夜。转染使用TransFast(登记商标，プロメガ社制造)转染试剂，根据其原始记录进行。也就是，添加pCAG/KLF5或其空的载体(pCAG)、pRSh/RARα，β，γ或其空的载体(pRS-RSV)和PDGF-A启动子(-900)-荧光素酶(Luciferase)，在37℃的5％CO2的细菌培养器中培养48小时。NIK-333溶于二甲基亚砜(DMSO)添加到为10-12～10-5M。之后，使用Dual Luciferase ReporterAssay System(プロメガ社制造)，进行荧光素酶分析。结果如图2、3所示。对KLF5的空的载体和RARα的空的载体(Lane1)、引入只有RARα的基因(Lane2)以及引入只有KLF5的基因(Lane3)进行比较，通过引入KLF5和RARα的基因(Lane4)，确认PDGF-A启动子的活化。该RARα的强表达下，依赖KLF5的PDGF-A启动子活化作用受到NIK-333抑制(Lane5～12)。此外，NIK-333的作用从10-10起确认有效地、浓度依赖地抑制，作用比全-反-维生素A酸(オ-ル-トランス-レチノイン酸)(ATRA)更强。同样的，在该RARγ的强表达下，依赖KLF5的PDGF-A启动子活化作用受到NIK-333抑制，作用比ATRA更强。另一方面，可以认为在该RARβ的强表达下，依赖KLF5的PDGF-A启动子活化作用不受到NIK-333抑制。NIK-333在RAR(α，γ)的强表达下抑制KLF5的PDGF-A启动子活化作用，该作用比ATRA更强。因此，可以知道NIK-333具有抑制转录因子KLF5的活化作用。
例2纤维母细胞3T3细胞增殖的效果以1×106个/孔的比例在24孔板上放置来自纤维母细胞的3T3细胞，放置12小时。添加NIK-333和ATRA为10-7～10-4M，计测24、36和48小时后活的细胞数。NIK-333和ATRA溶于DMSO。结果可以确认，NIK-333从10-7M起浓度依赖性地抑制细胞增殖，起作用比ATRA更强(图4)。因此，可以认为NIK-333具有抑制成为动脉硬化的原因的纤维母细胞的增殖，抑制动脉硬化的作用。
例3-1老鼠的封套阻碍模型效果使用封套阻碍模型，进行血管重建分析。已经公开了该模型对血管重建是有用的(Physiol.Genomics.，2，pp.13-30，2000；Circulation，104，pp.2716-2721，2001；Circulation，106，pp.847-853，2002)。实验中使用8周大的雄性C57BL6/N老鼠(10只/群)。从进行封套阻碍处理(用聚乙烯管包住血管外侧的处理)7天前到杀死的前一天，1天1次连续口服给药50mg/kg溶于大豆油的NIK-333。同样地只喂食大豆油作为对照。在前次给药7天后，在右大腿大动脉覆盖作为封套的PE50(聚乙烯管50)。5周后，杀掉，取血，通过左心室穿刺灌注固定，提起封套。使用苏木素·伊红(HE)染色进行病理评价。结果可以认为对于封套导致的血管损伤会产生血管内膜增生来说，NIK-333给药群和对照群相比，I/M(内膜/中膜)比减少。
例3-2老鼠的封套阻碍模型效果使用封套阻碍模型，进行血管重建分析。已经公开了该模型对血管重建是有用的(Physiol.Genomics.，2，pp.13-30，2000；Circulation，104，pp.2716-2721，2001；Circulation，106，pp.847-853，2002)。实验中使用8周大的雄性C57BL6/N老鼠(10只/群)。从进行封套阻碍处理(用聚乙烯管包住血管外侧的处理)7天前到杀死的前一天，1天1次连续口服给药悬浮于大豆油的100、200mg/kg NIK-333或5、10mg/kgATRA。同样地只喂食大豆油作为对照。在前次给药7天后，在右大腿大动脉覆盖作为封套的PE50(聚乙烯管50，外径0.965mm，长度约为1.5mm)。5周后，杀掉，取血，通过左心室穿刺灌注固定，提起封套。使用ElasticaVan Gieson(EVG)染色进行病理评价。结果可以认为对于封套导致的血管损伤会产生血管内膜增生来说，NIK-333给药群和对照群相比，I/M(内膜/中膜)比减少。另外，确认ATRA和对照群没有差异。
例4对老鼠精囊重量的影响使用8周大的雄性C57BL6/N老鼠(10只/群)。1天1次连续口服给药溶解于大豆油的50mg/kg和100mg/kg NIK-333共5周。同样地只喂食大豆油作为对照。测定5周后的体重，杀死后肉眼观察精囊和测定精囊重量。结果认为NIK-333的5周的给药群(50和100mg/kg)和对照群相比，体重和精囊重量没有变化。另外，肉眼观察精囊也没有发现异常。
例5对KLF5稳定细胞增殖的影响将KLF5稳定地表达的细胞＜3T3-KLF5细胞＞(将KLF5的cDNA亚克隆在3×FLAG-KLF5的表达载体上，制造3×FLAG-KLF5的构成物，将该构成物转染到3T3细胞上后，在G418的存在下培养2周，克隆G418抵抗性细胞。将不含KLF5、同样制造的对照群细胞称作3T3-mock细胞)1×105个/孔(6孔板)地播种到含10％FBS、青霉素G/链霉素(penicillin G/streptomycin)的DMEM培养基中，在37℃的5％CO2的细菌培养器中培养一夜后，交换到含青霉素G/链霉素(penicillin G/streptomycin)的DMEM培养基(不含血清)中，2小时后，添加溶解到DMSO中的NIK-333，培养24小时后，计测细胞数。结果如图5所示。在3T3-mock细胞和3T3-KLF5细胞中添加NIK-333、ATRA以使浓度为10-8～10-5M，则可以认为两细胞都会由于添加了NIK-333和ATRA，活细胞数浓度依赖性地减少。在对3T3-mock细胞、3T3-KLF5细胞的作用方面，NIK-333比ATRA更强。如果对添加NIK-333的3T3-mock细胞和3T3-KLF5进行比较，则3T3-KLF5细胞的细胞存活率高。因此，在NIK-333的存在下，有无KLF5，会产生细胞存活率的差异，因此，表示NIK-333的作用和KLF5的作用相关。
工业实用性本发明的药物具有抑制转录因子KLF5的活性的作用，可以用于抑制血管重建和抑制动脉硬化等。
权利要求
1.一种具有抑制转录因子KLF5的活化作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分。
2.一种具有抑制血管重建作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分。
3.一种具有抑制动脉硬化作用的药物，该药物包含非环式聚异戊二烯基化合物作为有效成分。
4.根据权利要求1～3任一项所记载的药物，其中非环式聚异戊二烯基化合物是聚异戊二烯基羧酸。
5.根据权利要求1～3任一项所记载的药物，其中非环式聚异戊二烯基化合物是3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸。
6.根据权利要求1～3任一项所记载的药物，其中非环式聚异戊二烯基化合物是(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六烷五烯酸。
7.根据权利要求1～6任一项所记载的药物，该药物是含有作为有效成分的非环式聚异戊二烯基化合物和药学上所允许的制剂添加剂的药物组合物的形态。
8.根据权利要求1～7任一项所记载的药物，该药物是口服给药的药物组合物的形态。
全文摘要
本发明提供具有抑制转录因子KLF5活化、抑制血管重建和动脉硬化作用的药物，其包含非环式聚异戊二烯基化合物(例如，3，7，11，15－四甲基－2，4，6，10，14－十六烷五烯酸等聚异戊二烯基羧酸等)为有效成分。
文档编号A61P9/10GK1956716SQ200580005218
公开日2007年5月2日 申请日期2005年2月24日 优先权日2004年2月25日
发明者永井良三, 铃木亨 申请人:国立大学法人东京大学, 兴和创药株式会社