抑制新生淋巴管生成的方法和药物的制作方法

抑制新生淋巴管生成的方法和药物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抑制受试者中新生淋巴管生成的方法，包括：给予受试者治疗有效量的CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂。本发明还提供了一种抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的方法，包括：联合给予受试者(a)治疗有效量的CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及(b)治疗有效量的VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂。
【专利说明】抑制新生淋巴管生成的方法和药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，更具体地说，涉及抑制新生淋巴管生成的方法和药物。【背景技术】
[0002]在体内，血管负责运输氧气、营养等物质到各个组织，并由毛细血管与周围组织进行物质交换，血压的存在导致血浆连续不断的从毛细血管渗漏到组织间隙，称为组织间液。淋巴管的主要功能就是收集这些富含蛋白质的液体回流到血液循环。淋巴管盲端的毛细淋巴管(Lymphatic Capillary)可以吸收水分、大分子和细胞,形成淋巴液,淋巴液通过收集淋巴管(Collecting Lymphatic Vessel)最后在淋巴管与静脉的交接处回流到血液,从而维持体液平衡。在这过程中，淋巴液会在淋巴结(Lymph Node)中被过滤，在淋巴结中外源物质能被抗原递呈细胞所识别引发特异的免疫反应。在小肠绒毛内乳中的淋巴管还能能吸收食物中的脂肪形成乳糜颗粒。毛细淋巴管存在于皮肤和大部分内脏器官，除了中枢神经系统、骨髓以及无脉管的组织，如软骨、角膜、表皮[1]。
[0003]早在17世纪初淋巴管就被描述了，但由于缺少可以区分血管和淋巴管的特异标志物，关于淋巴管的生成和功能的深入研究还不到20年。目前，已有一些淋巴管特异的标志物被发现，比如:1) 一种名为Prox-1 (Prospero Homeobox Proteinl)的转录因子，对发育过程中淋巴管的生成至关重要，在人的组织中可以作为淋巴内皮细胞的标志物[2]; 2)Podoplanin，是淋巴内皮细胞表达的一种肾小球足膜粘蛋白[3]，对于淋巴管发育也是必需的，尽管在一些非内皮细胞上也有表达，Podoplanin在血管上却不表达可以作为毛细淋巴管的标志物；3)淋巴管透明质酸受体I (LymphaticVessel Endothelial HyaluronanReceptorl, LYVE-1)，是⑶44蛋白的同源物，在胚胎和成体的淋巴管上都有表达[4]，尽管在肝脏和脾脏的血窦以及巨噬细胞上有表达，LYVE-1是识别人以及小鼠淋巴管的一个标志物；4)血管内皮生长因子受体 3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3,VEGFR-3)，是细胞膜表面的酪氨酸激酶受体，是新生淋巴管生成的信号通路，主要表达在成体的淋巴内皮细胞上，但在一些血管表面也表达[5]，血管内皮生长因子受体VEGFR-3在肿瘤的淋巴管中不能作为标志物，因为一些肿瘤的血管表面会上调表达VEGFR-3。这些淋巴管特异的分子标志物的发现，使我们可以鉴定组织中的淋巴管，研究病理条件下淋巴管生长的调控机制。
[0004]在成人体内，通常成熟的淋巴管处于静息状态，在一些生理和病理条件下，会发生新生淋巴管生成(Lymphangiogenesis),即从原有的淋巴管长出新的淋巴管。生理条件下，黄体的发育以及伤口的愈合，都会引发新生淋巴管生成[1]。在一些病理条件下，包括肿瘤生长与转移、炎症和移植排斥反应，也会引发淋巴管生长[6]。尽管有少量报道称，骨髓来源的细胞包括巨噬细胞，可以分化成淋巴内皮细胞，但是成体的新生淋巴管生成主要通过从已有的淋巴管出芽长出新的淋巴管的方式发生[7]。
[0005]肿瘤转移是癌症致死的最主要原因，肿瘤细胞可以通过多种途径发生转移，其中就包括淋巴管。肿瘤细胞利用淋巴管转移到淋巴结以及远端器官，肿瘤淋巴转移往往是癌细胞扩散的第一步，可以作为恶性肿瘤进展的一个主要诊断指标[8]。研究发现，肿瘤组织能激活淋巴内皮细胞诱导形成新的淋巴管，即肿瘤新生淋巴管生成，在动物肿瘤转移模型中，肿瘤新生淋巴管生成能促进淋巴结转移[9]。越来越多的临床数据也显示，在多种肿瘤类型中，肿瘤新生淋巴管生成与肿瘤进一步转移正相关[1°]。
[0006]关于新生淋巴管生成是如何被调控的，目前已发现一系列的生长因子能诱发新生淋巴管生成。其中，血管内皮生长因子C(Vascular Endothelial Growth Factor C，VEGF-C)和血管内皮生长因子D(VEGF-D)是最主要的淋巴管生成促进因子，它们都是糖蛋白，可以激活血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)[11’12]。血管内皮生长因子受体3 (VEGFR-3)特异表达在成体的淋巴管内皮细胞上。激活血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)能体外诱导淋巴内皮细胞增殖并在体内诱发新生淋巴管生成[13’14]。反过来，在一些人遗传性的淋巴水肿病人中，血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)发生错义突变，酪氨酸激酶结构域不能被激活从而影响了信号通路[15]。类似的，如果人为的表达可溶性的血管内皮生长因子受体3 (VEGFR-3)片段可以拮抗血管内皮生长因子C(VEGF-C)和血管内皮生长因子D (VEGF-D)，从而抑制转基因小鼠中的淋巴管生成并导致淋巴水肿[13]。全长的血管内皮生长因子C(VEGF-C)和血管内皮生长因子D(VEGF-D)特异作用于新生淋巴管生成[16，17]，而成熟形式的片段可以同时诱导血管和淋巴管的生长[18’19]。
[0007]最近，一系列其它新生淋巴管生成相关的生长因子被报道。比如:(1)血管内皮生长因子A(VEGF-A)，Cueni研究组报道血管内皮生长因子A(VEGF-A)能通过血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)通路在新生淋巴管生成中起作用[2°]。(2)促血管生成素(Angiopoietin)，促血管生成素的酪氨酸激酶受体Tie-2特异表达在内皮细胞上，促血管生成素I (Angiopoietin-1)过量表达在小鼠角膜模型中能诱导新生淋巴管生成[21]。小鼠中同时处理可溶性的血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)片段能抑制促血管生成素I的功能，表明促血管生成素I是通过血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)通路间接起作用的[21]。另外，促血管生成素2(Angi0p0ietin-2)是淋巴管发育中必需的因子，缺陷促血管生成素2的小鼠缺少正常的淋巴管组织[22]。(3)肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)，是最近发现的一个有效的淋巴管生成促进因子，转基因小鼠过量表达肝细胞生长因子或者皮内给药都能促进淋巴管增生，并且抗内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)的抗体并不能抑制肝细胞生长因子的活性，表明肝细胞生长因子可以直接促进新生淋巴管生成
[23]ο (4)碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF),在小鼠角膜模型中，碱性成纤维细胞生长因子也能促进淋巴管的生长，可能通过促进血管内皮细胞分泌血管内皮生长因子C(VEGF-C)的方式[24]。(5)血小板衍生因子BB (Platelet-DerivedGrowth Factor-BB, PDGF-BB), Cao研究组报道血小板衍生因子BB体外能促进淋巴内皮细胞的运动能力，在体内小鼠角膜模型中能诱导新生淋巴管生成，并且通过血小板衍生因子受体(TOGFR)发挥作用。血小板衍生因子BB诱导的淋巴管生成也能被内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)的拮抗剂所抑制，表明血小板衍生因子BB可以直接和间接作用于淋巴管
[25]ο (6)膜岛素样生长因子 1/2 (Insulin-like Growth Factor-1/2, IGF-1/2), Bjorndahl研究组报道胰岛素样生长因子1/2能在体内诱导新生淋巴管生成[26]。
[0008]人趋化因子家族目前包含40个趋化因子(Chemokine)和18个趋化因子受体(Chemokine Receptor)。趋化因子是具有化学趋化作用的,约8_15千道尔顿的小分子细胞因子，根据氨基酸序列氮端保守半胱氨酸的排列位置，分为4个亚类:CXC，CC, CX3C和C[27]。趋化因子能激活细胞表面的趋化因子受体，发挥趋化作用，诱导细胞沿着沿着趋化因子浓度梯度高的方向迁移运动。趋化因子受体通常是细胞膜表面的七次跨膜G蛋白偶联受体。趋化因子受体最初在免疫细胞表面被发现，介导免疫细胞进入炎症部位，后来发现在很多血源性细胞和非血源性细胞表面都发现有表达，表达在不同组织微环境中的趋化因子受体与相应的趋化因子相互作用，通过趋化作用负责帮助协调转运和组织细胞到各种组织部位[28’29]。在肿瘤组织中，趋化因子能通过影响新生血管生成、肿瘤细胞-炎症细胞间的作用、以及直接影响肿瘤的转化、生长、侵袭和转移等方式调控肿瘤进展。[0009]趋化因子CXCL12，又称为基质细胞衍生因子I a (Stromal-Derived Factor-1 α，SDF-1 α )，能结合趋化因子受体CXCR4[3°]。趋化因子CXCL12是一个高度保守的趋化因子，在人和小鼠中有99 %的同源性，使得趋化因子CXCL12能跨种属作用，趋化因子CXCL12-趋化因子受体CXCR4通路在进化过程中可以在不同物种间作用，如斑马鱼和小鼠。趋化因子受体CXCR4是一个含352个氨基酸的视紫红质样G蛋白偶联受体[31]。最初的研究发现趋化因子受体CXCR4在艾滋病毒感染过程中发挥作用，趋化因子受体CXCR4是某种艾滋病毒进入⑶4阳性的T细胞的共同受体[32]，从而引起了广泛的研究。
[0010]趋化因子CXCL12-趋化因子受体CXCR4在肿瘤发生过程中也起着明显作用，它们介导了肿瘤细胞转移到特定的组织器官[33]。趋化因子CXCL12-趋化因子受体CXCR4能促进肿瘤新生血管生成，帮助肿瘤细胞转移到特定的器官，这在多种肿瘤类型中都有报道，如:乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和神经胶质瘤[34_39]。表达趋化因子受体CXCR4的肿瘤细胞倾向于转移到高表达趋化因子CXCL12的组织，如肺、肝脏、淋巴结和骨髓等组织。在乳腺癌中，肿瘤相关的成纤维细胞能分泌大量的趋化因子CXCL12，分泌的趋化因子CXCL12既可以直接促进乳腺癌细胞的生长，又可以促进新生血管生成刺激肿瘤生长。另外，缺氧环境是改变肿瘤转移行为的一个重要调控机制，随着肿瘤组织氧浓度降低，缺氧环境能通过缺氧诱导因子I a (Hypoxia-1nducible Factor-1 a ,HIF-1 α )上调肿瘤细胞趋化因子受体CXCR4的表达[4°],而在正常生理条件下,肿瘤抑制蛋白Von Hippel-Lindau能通过降解缺氧诱导因子Ia下调趋化因子受体CXCR4的表达[41]。同时，缺氧环境也能增加肿瘤组织中趋化因子CXCL12的分泌，帮助肿瘤细胞存活。趋化因子CXCL12也参与肿瘤细胞的侵袭，通过上调基质金属蛋白酶13 (MMP13)，趋化因子CXCL12促进人基底细胞癌细胞的侵袭[42]。鉴于趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR4在肿瘤中的重要作用，它们很有可能是抗肿瘤治疗的重要靶点。
[0011]趋化因子和趋化因子受体在肿瘤发生、生长和转移过程中发挥着至关重要的作用，因而趋化因子家族可以作为治疗肿瘤的潜在靶点。有些趋化因子能促进肿瘤生长和转移，有些趋化因子能抑制肿瘤进展，我们可以通过调控特定的趋化因子或趋化因子受体对肿瘤生长、侵袭和转移过程进行干预。
[0012]综上所述，在肿瘤微环境中，肿瘤组织会激活淋巴内皮细胞和淋巴管，诱发原有的淋巴管长出新的淋巴管，我们称之为肿瘤新生淋巴管生成(Tumor Lymphangiogenesis)。肿瘤新生淋巴管生成与淋巴转移密切相关，新生淋巴管为肿瘤细胞提供了一条便捷的转移途径，肿瘤细胞可以通过淋巴管转移到淋巴结以及远端器官。动物实验和临床数据都证实在很多肿瘤类型中，肿瘤新生淋巴管生成可以作为淋巴结转移的指针。但是，肿瘤组织是如何诱发新生淋巴管生成的，其调控机理目前还未完全研究清楚。目前已经发现一系列的生长因子，被肿瘤组织分泌后，能激活淋巴内皮细胞，促进新生淋巴管生成，其中就包括血管内皮生长因子C(VEGF-C)，是最主要的淋巴管生成促进因子。这些生长因子激活淋巴内皮细胞，促进其增殖和迁移能力，但是这些被激活的淋巴内皮细胞是如何被招募到肿瘤组织的目前还不明确。趋化因子家族包含多个趋化因子以及趋化因子受体，趋化因子通过激活表达在特定细胞表面的趋化因子受体，行使趋化功能，促进细胞向趋化因子浓度梯度高的地方迁移运动，从而招募细胞到特定的组织部位。趋化因子家族在肿瘤组织中也大量存在，其中就有一些能促进肿瘤的生长和转移。在肿瘤组织尤其是缺氧条件下大量表达的趋化因子，是否能招募被生长因子激活的淋巴内皮细胞，从而参与调控肿瘤新生淋巴管生成，目前还不明确。

【发明内容】

[0013]在本发明中，发明人完成了以下研究:
[0014]筛选了趋化因子家族中表达在淋巴内皮细胞表面的趋化因子受体，并证明血管内皮生长因子VEGF-C激活的淋巴内皮细胞特异上调表达趋化因子受体CXCR4 ；
[0015]证明CXCR4的配体趋化因子CXCL12是一个新的淋巴管生成促进因子，通过趋化因子受体CXCR4能直接作用于淋巴内皮细胞，体外招募淋巴内皮细胞，体内促进新生淋巴管生成；
[0016]证明了趋化因子CXCL12促进新生淋巴管生成是直接起作用的，不依赖于血管内皮生长因子VEGF-C信号通路；
[0017]发现同时抑制趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C通路的联合多靶点治疗可以更有效的抑制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴转移。
[0018]这些工作表明趋化因子家族直接参与肿瘤新生淋巴管生成的调控，证明了趋化因子CXCL12是一个新的淋巴管生成促进因子，并发现同时封闭趋化因子和生长因子通路的联合多靶点治疗将更有效的抑制淋巴转移，可成为临床上控制肿瘤淋巴转移的一个新策略。
[0019]基于这些发现，本发明提供了一种抑制受试者中新生淋巴管生成的方法，包括:给予受试者治疗有效量的CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂。所述受试者可以患有肿瘤、炎症和/或移植排斥反应等。所述CXCR4抑制剂和CXCL12抑制剂可以单独给予，也可以同时给予。
[0020]本发明还提供了一种抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的方法，包括:给予受试者治疗有效量的CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂。
[0021]本发明还提供了一种抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的方法，包括:联合给予受试者(a)治疗有效量的CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及(b)治疗有效量的VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂。
[0022]在该方法中，(a)CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂用于阻断CXCL12通路，(b)VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂用于阻断VEGFR-3通路，这两类物质的联合给药可以更有效的控制肿瘤淋巴转移。
[0023] 值得注意的是，在该方法中，(b)中提到的VEGF-C抑制剂、VEGF-D抑制剂和VEGFR-3抑制剂可以各自单独给药，也可以两种或三种组合在一起联合给药。
[0024]在本发明的一个【具体实施方式】中，抗趋化因子CXCL12中和抗体和抗生长因子VEGF-C中和抗体通过腹腔注射给予小鼠，可以有效抑制肿瘤新生淋巴管生成和肿瘤淋巴转移。
[0025]另一方面，本发明提供了 CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂在制备用于抑制受试者中新生淋巴管生成的制剂中的用途。
[0026]本发明还提供了 CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂在制备用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物中的用途。
[0027]本发明还提供了(a)CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及(b)VEGF_C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂在制备用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物中的用途。
[0028]本发明还提供了用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物组合物，包括:作为活性成分的:(a) CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，和(b) VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂，以及任选的可药用载体。
[0029]本发明还提供了用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药盒，包括:(a)CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及(b) VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂。
[0030]所述的药盒中还可以包括使用说明书以及用于辅助患者用药的器具，例如注射器。
[0031]上文所述肿瘤的包括但不限于:脑星形细胞瘤、食道鳞状细胞癌、胃腺癌、肝细胞性肝癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肺鳞状细胞癌、膀胱秘尿上皮癌、心脏粘液瘤、肾透明细胞癌、甲状腺乳头状癌、胰腺癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺非特殊性浸润性导管癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌和睾丸精原细胞瘤。
【专利附图】

【附图说明】
[0032]图1.1显示了反转录PCR检测小鼠淋巴内皮细胞中趋化因子受体表达的结果。提取小鼠淋巴内皮细胞的总RNA后，反转录PCR检测趋化因子家族受体的mRNA水平。如图所示PCR产物电泳图，趋化因子家族受体包括趋化因子受体CCR1-10，CXCR1-7，CX3CR1，GAPDH为阳性对照。M为DNA标志物，C为未加反转录酶的阴性对照，T为靶基因，bp为DNA分子量单位。结果显示正常培养的小鼠淋巴内皮细胞表达多个趋化因子受体，其中，趋化因子受体 CCR5、CCR9、CXCR4、CXCR6 和 CXCR7 高表达。
[0033]图2.1显示了 qRT-PCR检测VEGF-C激活的淋巴内皮细胞表达趋化因子受体的结果。VEGF-C刺激的淋巴内皮细胞与未刺激的相比，荧光定量实时PCR检测在小鼠淋巴内皮细胞中表达的趋化因子受体mRNA水平的变化情况，包括CCR4-6，CCR8-10, CXCR3-4，CXCR6-7，CX3CR1。结果显示，VEGF-C激活的小鼠淋巴内皮细胞特异性的上调表达趋化因子受体CXCR4。
[0034]图2.2显示了流式细胞检测VEGF-C上调CXCR4的表达的结果。流式细胞方法检测血清饥饿的细胞和VEGF-C刺激的细胞膜表面趋化因子受体CXCR4的表达。VEGF-C刺激上调淋巴内皮细胞表面CXCR4的表达。[0035]图2.3显示了免疫印迹检测VEGF-C上调CXCR4的表达的结果。用血管内皮生长因子VEGF-C刺激小鼠淋巴内皮细胞，处理相应时间后，免疫印迹方法检测细胞中趋化因子受体CXCR4、缺氧诱导因子(HIF-1a)和对照核纤层蛋白(Lamin B)的蛋白表达情况。结果显示VEGF-C能上调CXCR4和HIF-1 α的表达。
[0036]图2.4显示了小RNA干扰HIF-1 α对CXCR4的影响。用小RNA敲低小鼠淋巴内皮细胞中缺氧诱导因子(HIF-1a)的表达，血管内皮生长因子VEGF-C分别刺激转染了阴性对照小RNA (N.C.)或HIF-1 α小RNA的细胞后，免疫印迹检测细胞中趋化因子受体CXCR4、缺氧诱导因子(HIF-1a)以及对照肌动蛋白(Actin)的表达情况。结果表明HIF-1 α介导了VEGF-C 上调 CXCR4。
[0037]图3.1显示了趋化因子受体CXCR4在体内分布的情况。激光共聚焦显微镜观察正常小鼠的结肠组织和淋巴结组织、黑色素瘤荷瘤小鼠的肿瘤组织和肿瘤相关淋巴结组织中淋巴管(Podoplanin，红色)上趋化因子受体CXCR4 (绿色)的表达情况，DAPI染色细胞核(蓝色)，标尺为20 μ m。结果显示趋化因子受体在肿瘤相关的新生淋巴管上高表达。
[0038]图3.2显示了趋化因子受体CXCR4在体内分布的情况。激光共聚焦显微镜观察正常人的结肠癌组织、直肠癌组织和皮肤鳞状上皮细胞癌组织中，肿瘤新生淋巴管上趋化因子受体CXCR4的表达情况。淋巴管(Podoplanin，红色)，趋化因子受体CXCR4 (绿色)，DAPI染色细胞核(蓝色)，标尺为200μπι。结果显示趋化因子受体在肿瘤相关的新生淋巴管上闻表达。
[0039]图4.1显示了趋化因子CXCL12促进淋巴内皮细胞迁移能力。如图显示细胞趋化实验，趋化因子CXCL12诱导小鼠淋巴内皮细胞的迁移，成浓度依赖性，VEGF-C(100ng/mL)为阳性对照，***代表P < 0.001。
[0040]图4.2显示了趋化因子CXCL12促进淋巴内皮细胞成管能力。如图显示细胞成管实验，趋化因子CXCL12诱导小鼠淋巴内皮细胞的迁移，成浓度依赖性，VEGF-C(100ng/mL)为阳性对照，***代表P < 0.001。
[0041]图4.3显示了趋化因子CXCL12促进新生淋巴管生成。如图显示体内基质胶栓塞实验，不同浓度的趋化因子CXCL12混入基质胶，皮下接种小鼠，取出后检测基质胶中的新生淋巴管情况，Podoplanin代表淋巴管(红色)，DAPI为细胞核染色(蓝色)。趋化因子CXCL12在小鼠体内能诱促进新生淋巴管生成，成浓度依赖性，血管内皮生长因子VEGF-C为阳性对照。(图4.3上)为激光共聚焦结果，标尺为100 μ m，(图4.3下)为统计结果，***代表 P < 0.001。
[0042]图5.1显示了趋化因子受体CXCR4的抗体对淋巴内皮细胞内信号通路的影响。如图显示抗趋化因子受体CXCR4抗体对趋化因子CXCL12激活蛋白激酶B (Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)的影响，在同时有抗趋化因子受体CXCR4抗体(5 μ g/mL)或同种免疫球蛋白对照(IgGAyg/mL)存在时，用趋化因子CXCL12 (100ng/mL)处理小鼠淋巴内皮细胞，免疫印迹检测蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)的蛋白水平，以及他们的磷酸化水平(p-Akt, p-Erk)。
[0043] 图5.2显示了 Erk和Akt的拮抗剂对CXCL12招募淋巴内皮细胞的影响。在体外细胞趋化实验中，用Akt通路的拮抗剂(LY294002)和Erk通路的拮抗剂(U0126)处理小鼠淋巴内皮细胞，检测这些拮抗剂对趋化因子CXCL12(100ng/mL)招募淋巴内皮细胞功能的影响。(图5.2上)紫色的为迁移的小鼠淋巴淋巴内皮细胞，标尺为100 μ m，(图5.2下)为迁移的细胞统计后的结果，***代表P < 0.001。
[0044]图6.1显示了人肿瘤组织芯片检测趋化因子CXCL12表达的结果。如图所示，人肿瘤组织芯片包含多种肿瘤类型，共54个样本，组织免疫荧光检测趋化因子CXCL12表达水平和淋巴管密度(LV)，根据它们的信号强弱将样本分成4组，统计各组的样本数。(图6.1左)为激光共聚焦结果代表图，DAPI为细胞核染色(蓝色)，CXCL12染绿色，Podoplanin代表淋巴管(红色)，共定位为各荧光的叠加，标尺为50 μ m。(图6.1右)为统计结果，CXCL12(高)代表趋化因子CXCL12高表达，CXCL12 (低)代表趋化因子CXCL12低表达，LV (高)代表淋巴管密度高，LV(低)代表淋巴管密度低。
[0045]图7.1显示了抑制CXCR4对趋化因子CXCL12的影响。如图所示细胞趋化实验，用抗CXCR4抗体和CXCR4拮抗剂(AMD3100)处理细胞，趋化因子CXCL12的活性被抑制，VEGF-C的活性不受影响。细胞因子为只含趋化因子CXCL12或VEGF-C的对照，IgG为同种免疫球蛋白对照。(图7.1上)为细胞迁移结果,标尺为100 μ m,(图7.1下)显示统计结果,***代表 P < 0.001。
[0046]图7.2显示了抑制VEGFR-3对趋化因子CXCL12的影响。如图所示细胞趋化实验，用抗血管内皮生长因子受体-3抗体(VEGFR-3Ab)处理细胞，趋化因子CXCL12的促进细胞迁移的活性不受影响，VEGF-C的活性被抑制，IgG为同种免疫球蛋白对照，***代表P< 0.001。
[0047]图7.3显示 了体内基质胶栓塞实验验证CXCL12和VEGF-C的关系。如图所示基质胶栓塞实验，基质胶中混入相应药物，皮下接种小鼠，组织免疫荧光检测基质胶中的新生淋巴管情况。AMD3100为CXCR4拮抗剂，细胞因子为只含趋化因子CXCL12或VEGF-C的对照，IgG为同种免疫球蛋白对照，DAPI为细胞核染色(蓝色)，Podoplanin代表淋巴管(红色)。(图7.3上)显示激光共聚焦结果，标尺为50 μ m，(图7.3下)为统计结果，***代表 P〈 0.01 。
[0048]图8.1显示了细胞趋化实验检测CXCL12与VEGF-C的加和作用。如图所示细胞趋化实验，用趋化因子CXCL12和血管内皮生长因子VEGF-C单独或同时处理小鼠淋巴内皮细胞细胞，检测细胞迁移能力，PBS为对照组。(图8.1上)显示细胞迁移结果，标尺为100 μ m，(图8.I下)显示统计结果，*林代表P < 0.001。用趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C一起比单独使用更能有效促进淋巴内皮细胞迁移能力。
[0049]图8.2显示了细胞趋化实验检测CXCL12与VEGF-C的加和作用。如图所示基质胶栓塞实验，用趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C —起比单独使用更能有效促进体内新生淋巴管生成。
[0050]图9.1显示了人乳腺癌裸鼠模型肿瘤组织中淋巴管密度。如图所示在构建的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标记的人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠模型中，用抗趋化因子CXCL12抗体和抗VEGF-C抗体单独或联合处理小鼠，组织免疫荧光检测肿瘤组织中的新生淋巴管情况。IgG为同种免疫球蛋白对照，***代表P <0.001。结果显示联合封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C，比单独封闭一种因子能更好的抑制肿瘤组织的新生淋巴管生成。
[0051]图10.1显示了人乳腺癌荷瘤裸鼠淋巴结。如图所示人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠的淋巴结组织，每组6只裸鼠，用抗趋化因子CXCL12抗体和抗VEGF-C抗体单独或联合处理小鼠，IgG为同种免疫球蛋白对照，分离近瘤旁的腹股沟淋巴结，标尺为2cm。可见药物处理组的小鼠淋巴结的肿大情况明显好于对照组的小鼠淋巴结。
[0052]图10.2显示了人乳腺癌细胞淋巴结转移情况。人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)是用增强型绿色荧光蛋白(eGFP)标记的细胞株(MDA-MB-231/eGFP)，用激光共聚焦显微镜可以直接观察淋巴结组织中的人乳腺癌细胞。(图10.2左)为激光共聚焦结果示意图，DAPI为细胞核染色，231/eGFP为绿色荧光蛋白标记的人乳腺癌细胞MDA-MB-231/eGFP，标尺为50 μ m，局部放大图，标尺为20 μ m。(图10.2右)为统计结果，*林代表P < 0.001。结果显示联合封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C，能更有效的抑制肿瘤淋巴结转移。
【具体实施方式】
[0053]本文中使用的术语“受试者”，指任意哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、牛，特别是灵长类动物，如人。“受试者”可以指患病的哺乳动物，例如患有癌症的哺乳动物，特别是人；也可以指未患病的健康的哺乳动物。在本发明的某些优选实施方式中，“受试者”是人。
[0054]本文所用的术语“任选”(optional)表示“可有可无”或“非必需”等含义。例如，“任选的可药用载体”是指可以含有该可药用载体，也可以不含有该可药用载体。这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。
[0055]本文所用的术语“治疗有效量”指的是足以在动物或人体内引起兽医或临床医师所寻找的生物或医学反应的活性化合物的量。应当意识到给药剂量将随着所用的化合物、给药方式、所需的治疗和病情等因素而变化。有待治疗的哺乳动物接受的典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至IOOmg活性成分,例如lmg/kg或2 mg/kg。如果需要的话,该日剂量可以以分割剂量的形式给药。根据本领域众所周知的原则，所给予的活性成分的精确数量和给药途径取决于被治疗受试者的体重、年龄、性别以及被治疗的特定状况。
[0056]本发明的活性化合物可以通过本领域技术人员熟知的方式方便地给予受试者，例如口服、静脉注射、腹腔注射或者肌肉注射。
[0057]本发明还提供了制备本发明药物组合物的方法，其包括将活性成分与任选的可药用载体进行混合。本发明的组合物可以用现有技术中众所周知的常规载体通过常规方法获得。因此，用于口服应用的组合物可包含例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。
[0058]本文中使用的术语“CXCR4”指的是趋化因子受体CXCR4，是一个含352个氨基酸的视紫红质样G蛋白偶联受体。
[0059]本文中使用的术语“CXCL12”指的是趋化因子CXCL12，又称为基质细胞衍生因子I a (Stromal-Derived Factor-1 α , SDF-1 α ),能结合趋化因子受体CXCR4。趋化因子CXCL12是一个高度保守的趋化因子，在人和小鼠中有99%的同源性，使得趋化因子CXCL12能跨种属作用。
[0060]本文中使用的术语“ VEGFR-3 ”指的是血管内皮生长因子受体3 (VascularEndothelial Growth Factor Receptor-3,简称VEGFR-3),是细胞膜表面的酪氨酸激酶受体。[0061]本文中使用的术语“VEGF-C”指的是血管内皮生长因子C(Vascular EndothelialGrowth Factor C，简称VEGF-C)，是最主要的淋巴管生成促进因子，可以激活血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)。
[0062]本文中使用的术语“VEGF-D”指的是血管内皮生长因子D。[0063]本文中使用的术语“CXCR4抑制剂”指的是能够特异结合CXCR4并抑制其生物学功能的试剂，例如抗CXCR4抗体或其活性片段、CXCR4拮抗剂例如AMD3100。
[0064]本文中使用的术语“抗体”可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
[0065]本文中使用的术语抗体的“活性片段”是指具有该抗体的结合特异性的片段。本领域技术人员可以容易地制备出抗体的活性片段。
[0066]本文中使用的术语“CXCL12抑制剂”指的是能够特异结合CXCL12并抑制其生物学功能的试剂，例如抗CXCL12抗体或CXCL12拮抗剂或能竞争性结合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
[0067]本文中使用的术语“VEGFR-3抑制剂”指的是能够特异结合VEGFR-3并抑制其生物学功能的试剂，例如抗VEGFR-3抗体，或抑制VEGFR-3酪氨酸激酶活性的拮抗剂，例如SAR131675、MA751、BAY57-9352、Vandetanib (凡德他尼)等。
[0068]本文中使用的术语“VEGF-C抑制剂”指的是能够特异结合VEGF-C并抑制其生物学功能的试剂，例如抗VEGF-C抗体或VEGF-C拮抗剂或能竞争性结合VEGF-C的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段。
[0069]本文中使用的术语“VEGF-D抑制剂”指的是能够特异结合VEGF-D并抑制其生物学功能的试剂，例如抗VEGF-D抗体或VEGF-D拮抗剂或能竞争性结合VEGF-D的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段。
[0070]为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。
[0071]实施例1
[0072]淋巴内皮细胞表达多种趋化因子受体
[0073]实验方法
[0074]1、细胞总RNA提取和RT-PCR检测淋巴内皮细胞上趋化因子受体的表达
[0075]细胞总RNA的分离提取利用TRIZOL试剂(购自Invitrogen),并按照试剂说明书的标准操作进行。往离心收集的原代淋巴内皮细胞(约IXlO6)中加入lmLTRIZOL，用枪头反复吹吸30次，室温放置5分钟。10000g，4°C离心10分钟，轻轻吸取上清。加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15秒左右，室温静置3分钟。10000g，4°C离心15分钟，样品分成三层:黄色的有机相、中间层和无色的水相，水相包含我们所要的RNA，体积约为所用TRIzol试剂的60%。把水相转移到新管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温静置10分钟。10000g，4°C离心
10分钟，吸除上清，在管侧和管底可见透明胶状沉淀。加入lmL75%乙醇洗涤沉淀，乙醇用DEPC处理过的水配制。7500g，4°C离心5分钟，弃上清。沉淀在室温晾干，溶于50 μ LDEPC水备用。
[0076]合成第一链互补DNA 用 Fermentas 试剂盒(RevertAid? First Strand cDNASynthesis Kits)，反应按照说明书标准进行。取RNAl μ g，反应体系为20 μ L，引物用试剂盒自带的Oligo(ClT)15，运行程序:42°C，50分钟；95°C，5分钟；4°C，10分钟。反转录产物用于后续的PCR和荧光定量RT-PCR，剩余的产物可放置于_80°C冰箱保存。
[0077]PCR检测淋巴内皮细胞中趋化因子受体的表达谱，PCR运行程序:95°C变性，30秒；56°C退火，30秒；72°C延伸，40秒，反应体系为20 μ L，反应循环数40个循环，最后是72°C保持5分钟。内参为GAPDH。PCR产物跑DNA电泳胶观察。反应引物如下:
[0078]CCRl 正向引物(5，-3，):CACCATCTTCCAGGAGCG
[0079]CCRl 反向引物(5，-3’):CAGTGAGCTTCCCGTTCAG
[0080]CCR2 正向引物(5，-3，):GAGCCTGATCCTGCCTCTACTTG
[0081]CCR2 反向引物(5，-3’):CCTGCATGGCCTGGTCTAAGTGC
[0082]CCR3 正向引物(5，-3，):GCTTTGAGACCACACCCTATG
[0083]CCR3 反向引物(5 ’ -3 ’): TTCAGGCAATGCTGCCAGTCC
[0084]CCR4 正向引物(5 ’ -3 ’): CCAAAGATGAATGCCACAGAG
[0085]CCR4 反向引物(5 ’ -3 ’): CGAACAGCAAATCCGAGATG
[0086]CCR5 正向引物(5，-3，):GCTGAAGAGCGTGACTGAT
[0087]CCR5 反向引物(5，_3’):GAGGACTGCATGTATAATG
[0088]CCR6 正向引物(5，-3，):GTGCCAATTGCCTACTCC [0089]CCR6 反向引物(5，-3，):GGCTCACAGACATCACGATC
[0090]CCR7 正向引物(5，-3，): TTCCAGCTGCCCTACAATGG
[0091]CCR7 反向引物(5，-3’):GAAGGTTGTGGTGGTCTCCG
[0092]CCR8 正向引物(5 ’ -3 ’): CAGGACCAGAGCCATCAAG
[0093]CCR8 反向引物(5，_3’):GATGTCATCCAGGGTGGAAG
[0094]CCR9 正向引物(5，-3’):GCTGATCTGCTCTTTCTTG
[0095]CCR9 反向引物(5，-3，):GTGCTTGGATGACTTCTTGG
[0096]CCRlO 正向引物(5，-3，):GTACGATGAGGAGGCCTATTC
[0097]CCRlO 反向引物(5，-3’):CGTGCGATGGCCACATAG
[0098]CXCRl 正向引物(5，-3，):CGTCATGGATGTCTACGTGC
[0099]CXCRl 反向引物(5，-3，):GTAGCAGACCAGCATAGTG
[0100]CXCR2 正向引物(5，-3’):AACAGTTATGCTGTGGTTGTA
[0101]CXCR2 反向引物(5，-3’):CAAACGGGATGTATTGTTACC
[0102]CXCR3 正向引物(5，-3，):GAACGTCAAGTGCTAGATGCCTCG
[0103]CXCR3 反向引物(5，-3’):GTACACGCAGAGCAGTGCG
[0104]CXCR4 正向引物(5，-3，): CTGTAGAGCGAGTGTTGC
[0105]CXCR4 反向引物(5，-3’):GTAGAGGTTGACAGTGTAG
[0106]CXCR5 正向引物(5 ’ -3 ’): CGAAGCGGAAACTAGAGCC
[0107]CXCR5 反向引物(5，-3，): CCAGCTTGGTCAGAAGC
[0108]CXCR6 正向引物(5 ’ -3 ’): CAGCTCTGTACGATGGGCAC
[0109]CXCR6 反向引物(5 ’ -3 ’): CGGTTGAAGGCCTTGGTAGC
[0110]CXCR7 正向引物(5，-3，):GACTATGCAGAGCCTGGC
[0111]CXCR7 反向引物(5 ’ -3 ’): CTTATAGCTGGAGGTGCC
[0112]CX3CR1 正向引物(5，-3’):GACGATTCTGCTGAGGCCTG[0113]CX3CR1 反向引物(5，-3’):GCCCAGACTAATGGTGAC
[0114]GAPDH 正向引物(5 ’ _3 ’): CAAGGTCATCCATGACAACTTTG
[0115]GAPDH 反向引物(5，_3，):GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG
[0116]实验结果
[0117]为了研究趋化因子家族在新生淋巴管生成中的作用，首先，我们需筛选淋巴内皮细胞上表达了哪些趋化因子受体。趋化因子受体是表达在特定细胞表面的G蛋白偶联受体，通过与细胞外配体趋化因子结合，产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到特定部位。目前已发现的趋化因子受体主要包括:CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CXCR8、CXCR9、CXCRlO ;CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7 ;CX3CR1。利用半定量反转录PCR的方法，我们检测了正常培养的小鼠原代淋巴内皮细胞内这些趋化因子受体信使RNA(messenger RNA, mRNA)水平的情况。PCR的结果显示小鼠淋巴内皮细胞高表达趋化因子受体 CCR5、CCR9、CXCR4、CXCR6 和 CXCR7，低表达趋化因子受体 CCR4、CCR6、CCR8、CCR10、CXCR3和CX3CR1，而不表达其他的趋化因子受体(图1.1)。说明淋巴内皮细胞确实也表达趋化因子受体，趋化因子家族有可能参与调控淋巴内皮细胞的细胞活性。
[0118]实施例2
[0119]趋化因子受体CXCR4在VEGF-C激活的淋巴内皮细胞上特异高表达
[0120]实验方法
[0121]1、RT-PCR检测淋巴内皮细胞上趋化因子受体的表达
[0122]突光定量Real-Time PCR 使用 Stratagene 试剂盒(Brilliant II SYBR?GreenQRT-PCR Master Mix)，荧光定量 PCR 仪器为 MX3000P (购自 Stratagene)，荧光染料为 SYBRGreen,反应体系为20 μ L，反应循环数为40个。内参为GAPDH，根据仪器给出的荧光图得到Δ Ct值，计算出相对Δ (ΔCt)值，从而计算相应基因水平的相对变化。
[0123]2、流式细胞法验证血管内皮生长因子C(VEGF-C)诱导淋巴内皮细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达
[0124]选取第2-3代状态良好的小鼠原代淋巴内皮细胞，种植到4个6cm的培养皿中。两组细胞正常培养，另两组细胞当长到80%的密度时，换成无血清无生长因子培养基，饥饿过夜，其中一组细胞换成含有100ng/mL VEGF-C的无血清培养基，培养24小时。这四组细胞进一步流式细胞技术检测细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达水平，其中正常培养的一组细胞用作阴性对照。
[0125]用0.25 % 的乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacetic Acid DisodiumSalt，EDTA)处理细胞，用预冷的PBS清洗细胞。悬浮细胞并低速离心(600g，3分钟，该实验低速离心均指该 速度和时间)，将细胞用1uL含10%山羊血清的PBS重悬，孵育15分钟。
[0126]低速离心，用1mL含2%山羊血清的PBS重悬各组细胞，阴性对照组细胞中加入对照抗体，其他三组细胞中加入1μ g的CXCR4抗体(购自Abeam)。孵育30分钟。低速离心细胞，用1mL的PBS重悬细胞并重复一次该操作，清洗未结合的抗体。
[0127]将每组细胞用ImL含2%山羊血清的PBS重悬，分别加入1ug荧光素标记的二抗。低速离心细胞，用ImL的PBS重悬细胞并重复一次该操作，清洗未结合的二抗。最后用500 μ L PBS 重悬。利用流式细胞仪(FACS Calibur Flow Cytometry System,购自 BectonDickinson)分析表面CXCR4的表达情况。[0128]3、免疫印迹法(Immuno-blotting，IB)检测VEGF-C诱导淋巴内皮细胞表面趋化因子受体CXCR4的表达
[0129]选取第2-3代状态良好的小鼠原代淋巴内皮细胞，换成无血清无生长因子的新鲜培养基后，饥饿过夜。换成含100ng/mL VEGF-C的培养基，分别处理6小时、12小时和24小时后，胰酶消化离心收集细胞，用于免疫印迹检测细胞中趋化因子受体CXCR4的表达水平。
[0130]将样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为15% )，利用电转仪将蛋白条带转印至PVDF膜(购自Millipore)上，电转仪置于冰浴中，于IOOmA转膜3小时。配制TBST缓冲液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.1% Tween-20)，用于配制封闭液、一抗溶液和二抗溶液。PVDF膜进一步在用含有5%脱脂牛奶的封闭液中室温孵育I小时，轻轻摇动，然后用TBST洗膜5次，每次5分钟。
[0131]根据一抗说明书将一抗稀释成一抗稀释液(含有1%脱脂牛奶的TBST)，一抗包括抗 CXCR4 抗体(购自 Abeam)、抗缺氧诱导因子 I a (Hypoxia-1nducible TranscriptionFactorl α , HIF-1 α )抗体(购自 Santa Cruz Biotechnology)、抗 Lamin B 抗体(购自Santa Cruz Biotechnology)和抗 Actin 抗体(购自 Santa Cruz Biotechnology),与 PVDF膜孵育，轻轻摇动，4°C过夜，TBST室温洗膜5次，每次5分钟。
[0132]根据说明书，将对应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释成二抗稀释液(含有
I%脱脂牛奶的TBST)，加入PVDF膜孵育，室温轻轻摇动I小时，然后用TBST洗膜5次，每次5分钟。
[0133]成像利用ECL 检测试剂盒(SuperSignal West Pico/Femto ChemiluminescentSubstrate,购自Thermo Scientific),在暗室中，用X光胶片(购自Kodak)进行曝光、显影和定影，扫描结果保存。
[0134]4、RNA干扰缺氧诱导因子HIF-1 α验证HIF-1 α参与VEGF-C诱导的CXCR4上调表达
[0135]用于干扰HIF-1a化学合成的小RNA购自Santa Cruz Biotechnology,阴性对照的小RNA购自上海GenePharma公司，RNA干扰所用的转染试剂为Lipofectamine2000 (购自Invitrogen) 0转染过程按照转染试剂说明书进行。选取第2_3代状态良好的小鼠原代淋巴内皮细胞种植于6孔板中，培养24小时，密度达到40-50%，转染前30分钟换成无血清培养基ECM(购自Sciencell)。然后配置转染溶液:将IOOnM的小RNA加入到100 μ L的ECM中，轻轻混匀，室温静置5分钟，将8 μ L的Lipofectamine2000稀释到100 μ L的ECM中，轻轻混匀，室温静置5分钟，将小RNA稀释液逐滴缓慢的加入转染试剂稀释液中，轻轻混匀，室温静置15分钟。将配制好的小RNA转染溶液逐滴缓慢的加到6孔板中，边加边轻轻晃动6孔板，使其均匀分布。在细胞培养箱中正常培养6小时后，加入等量的无血清培养基，在细胞培养箱中正常培养过夜后，将培养基换成含10%胎牛血清的正常ECM培养基，继续培养36-48小时，免疫印迹检测HIF-1 α干扰效率。
[0136]将分别转染了 HIF-1 α小RNA和阴性对照小RNA的小鼠原代淋巴内皮细胞，换成无血清培养基ECM饥饿过夜后，再次换成只含100ng/mL VEGF-C的无血清培养基ECM和不含VEGF-C的无血清培养基ECM，细胞培养箱中处理6小时。收集细胞进行免疫印迹检测CXCR4和HIF-1a的表达情况。
[0137]实验结果[0138]由于肿瘤组织会分泌很多的生长因子激活淋巴内皮细胞，促进其增殖和迁移以及新生淋巴管生成，那么被生长因子激活的淋巴内皮细胞是否会表达异常的趋化因子受体呢？淋巴内皮细胞处于激活状态时趋化因子受体的表达谱又是怎样的呢。血管内皮生长因子C(Vascular Endothelial Cell Growth Factor C,VEGF-C)是肿瘤组织中目前已发现的最主要的新生淋巴管生成促进因子。我们用VEGF-C处理小鼠淋巴内皮细胞，用荧光定量实时PCR (qRT-PCR)的方法检测能在淋巴内皮细胞表达的趋化因子受体的mRNA水平的变化情况。与未处理的细胞相比，荧光定量实时PCR结果显示当小鼠淋巴内皮细胞被VEGF-C激活时，只有趋化因子受体CXCR4的mRNA水平明显上调3倍左右，其他趋化因子受体没有变化(图 2.1)。
[0139]荧光定量实时PCR结果表明在mRNA水平上，VEGF-C能特异上调趋化因子受体CXCR4水平。我们进一步从蛋白水平来证明该结果。小鼠原代淋巴内皮细胞被饥饿过夜后，用VEGF-C处理，利用流式细胞方法检测细胞表面CXCR4的蛋白水平。结果显示VEGF-C处理确实能上调小鼠淋巴内皮细胞中趋化因子受体CXCR4的表达水平(图2.2)。免疫印迹实验也得到了相似的结果，CXCR4处理小鼠淋巴内皮细胞能上调CXCR4的表达水平(图2.3)。那么VEGF-C是如何上调CXCR4的表达水平呢？作为细胞外生长因子有可能通过调控相应转录因子来调控趋化因子受体CXCR4的表达。已有报道表明趋化因子受体CXCR4是缺氧诱导因子 I a (Hypoxia-1nducible Transcription Factorl a ,HIF-1 α )的革巴基因[41]。我们的免疫印迹实验表明血管内皮生长因子VEGF-C确实能上调小鼠淋巴内皮细胞内缺氧诱导因子HIF-1 α的表达水平(图2.3)。
[0140]为了进一步验证缺氧诱导因子HIF-1a参与血管内皮生长因子VEGF-C上调淋巴内皮细胞中趋化因子受体CXCR4的表达，我们用RNA干扰的方法敲低小鼠淋巴内皮细胞中缺氧诱导因子HIF-1a的水平。免疫印迹结果显示，血管内皮生长因子VEGF-C能诱导转染了阴性对照小RNA的小鼠淋巴内皮细胞中的趋化因子受体CXCR4的表达，当细胞中缺氧诱导因子HIF-1 α被RNA干扰后，血管内皮生长因子VEGF-C的刺激不能再诱导趋化因子受体CXCR4的表达(图2.4)。结果表明，缺氧诱导因子HIF-1 α参与了血管内皮生长因子VEGF-C上调小鼠淋巴内皮细胞中趋化因子受体CXCR4的表达。
[0141]实施例3
[0142]CXCR4在体内新生淋巴管表面特异高表达
[0143]实验方法
[0144]1、组织免疫荧光法检测趋化因子CXCR4在体内淋巴管上的分布情况
[0145]取8只健康状况良好的C57BL/6小鼠(6-8周龄，雌性，购自北京维通利华公司)，分为两组，一组为正常饲养的小鼠3只，一组为皮内接种5X106B16/F10小鼠黑色素瘤细胞(American Type Culture Collection,ATCC)的荷瘤小鼠5只。接种14天后,取出荷瘤小鼠的肿瘤组织和瘤旁腋窝淋巴结组织，以及正常小鼠的结肠和淋巴结组织。
[0146]固定包埋。将取出的组织用4%的甲醛溶液固定过夜，然后用自来水将组织清洗过夜，洗净甲醛(可以用纱布将组织块包裹后，放于烧杯中，置于自来水龙头下滴水清洗过夜)；取清洗过夜的组织进行酒精浓度梯度脱水，酒精浓度梯度分别为:50%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，以上各步骤各一次，每次2小时，之后在100%乙醇中脱水2次，每次I小时，然后在二甲苯中2次，每次I小时，在液态石蜡(60°C )中2次，每次30分钟；将脱水后的组织块进行石蜡包埋，包埋后可以放置于室温长久保存；利用切片机将石蜡组织块切成8μπι厚的切片，在37°C水中展平后，平铺在防脱载玻片(中杉金桥公司)上，在干燥环境下55°C烤片2小时，或37°C烤片过夜。
[0147]组织复水和抗原修复。将经过烤片的切片进行脱蜡复水，顺序为:二甲苯2次，每次3分钟；100 %乙醇2次，每次2分钟；95 %乙醇，90 %乙醇，80 %乙醇，70 %乙醇，各I次，每次2分钟。在PBS中清洗后，进行柠檬酸钠热修复。将组织切片放在切片架上并置于大烧杯中，大烧杯中装有IOmM柠檬酸钠修复液(pH = 6.0)约I升，液面至少没过组织切片2cm。在微波炉中加热至刚好沸腾，注意不能剧烈沸腾防止组织脱片，然后调至微波炉“解冻”状态即水温在90-95°C之间保温15分钟，取出烧杯缓慢冷却至室温(约I小时降温时间)，用PBS清洗一下。
[0148]组织免疫荧光染色。取经过抗原修复的组织切片，用封闭液在湿盒中室温封闭I小时，封闭液为含10%正常山羊血清的PBS。吸除封闭液。按照抗体说明书，直接加抗Podoplanin 一抗和抗趋化因子受体CXCR4—抗(购自Abeam)，抗体稀释液为含1%正常山羊血清的PBS，在湿盒中室温孵育I小时。吸除一抗液体，用PBS清洗5次，每次5分钟。按抗体说明书，加荧光素标记的二抗，抗体稀释液为含I %正常山羊血清的PBS，湿盒中室温孵育I小时。吸除二抗液体，用PBS清洗3次，每次5分钟。用DAPI染核。用PBS清洗2次，每次5分钟。用水溶性封片剂(Clearmount,北京中杉金桥公司)封片。通过激光共聚焦显微镜(Nikon Al)观察并成像，成像软件为NIS-Elements AR3.0。
[0149]人肿瘤组织的免疫荧光染色方法同上。
[0150]实验结果
[0151]以上结果表明，小鼠淋巴内皮细胞被生长因子VEGF-C激活时能特异上调趋化因子受体CXCR-4的表达。我们进一步检测趋化因子受体CXCR4在体内淋巴管上的分布情况，尤其是正常成熟淋巴管和新生淋巴管上的表达差异。组织免疫荧光结果显示小鼠的正常组织如结肠组织和淋巴结组织中的成熟淋巴管上没有趋化因子受体CXCR4的表达，而小鼠黑色素瘤肿瘤组织和荷瘤小鼠的前哨淋巴结组织中的肿瘤相关淋巴管高表达趋化因子受体CXCR4(图3.1)。当我们检测人的肿瘤组织，包括人结肠癌组织、直肠癌组织和皮肤鳞状上皮细胞癌组织，也同样发现肿瘤相关的新生淋巴管高表达趋化因子受体CXCR4(图3.2)。有可能肿瘤激活的新生淋巴管上调表达趋化因子受体CXCR4，与我们的体外结果一致，说明趋化因子受体CXCR4在新生淋巴管上被上调表达。
[0152]实施例4
[0153]趋化因子CXCL12是一个新的淋巴管生成促进因子
[0154]实验方法
[0155]1、细胞趋化实验
[0156]检测小鼠淋巴内皮细胞的迁移能力使用8 μ m孔径的Transwell吊篮(购自Costar)。吊篮放入24孔板中。选取状态良好的第2_3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs)，分为5组，每组4个平行，每个平行样品约2 X IO4细胞，用胰酶将细胞消化下来，后用200 μ L无血清新鲜内皮细胞培养基(Endothelial Cell Culture Medium, ECM,购自 Sciencell)重悬，后接种到Transwell内侧小室中。外侧小室中各添加800 μ L无血清内皮细胞培养基，外侧小室的培养基中分别混有lng/mL、20ng/mL、100ng/mL的趋化因子CXCL12 (购自R&DSystems)，lOOng/mL的VEGF-C (购自R&DSystems)，以及PBS对照。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。
[0157]取出培养板，将Transwell放入4%多聚甲醒溶液中固定15分钟。取出Transwell在PBS中润洗两次后，用0.1 %结晶紫溶液染色30分钟，再用PBS洗净非特异结合的结晶紫溶液。用医用棉签轻轻擦拭掉Transwell膜内侧的细胞，注意膜的边缘也要擦拭干净，以防影响细胞计数。将Transwell吊篮放至显微镜(Olympus 1X71显微镜)下,镜检观察外侧膜上迁出的细胞，每组随机拍摄8个视野并计数细胞数。
[0158]2、细胞成管实验
[0159]提前在24孔细胞培养板中均匀的铺一层无生长因子基质胶(Matrigel，购自Becton-Dickinson Biosciences，货号:354230)，每孔约 150 μ L, 37°C放置 30 分钟，待基质胶凝结。选取状态良好的第2-3代小鼠原代淋巴内皮细胞，接种到铺有基质胶的24孔培养板中，每孔约2 X IO4细胞，共5组，每组3个平行。培养基为含有无血清新鲜ECM培养基，每组分别含有 lng/mL、20ng/mL、100ng/mL 的趋化因子 CXCL12 (购自 R&D Systems)，IOOng/mL的VEGF-C (购自R&D Systems)以及PBS对照。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。在有细胞外基质存在情况下，内皮细胞之间会自动连接形成管腔状结构。用奥林巴斯显微镜(Olympus 1X71显微镜)观察小鼠淋巴内皮细胞形成的网状结构，用NIH Image J软件统计内皮细胞形成的网状结构的长短[43]，代表小鼠淋巴内皮细胞形成管腔状结构的能力。
[0160]3、体内基质胶栓塞实验
[0161]基质胶栓塞实验根据之前的报道进行[44]。准备BABL/c小鼠(5周龄，雌性，购自北京维通利华公司)，共5组，每组5只小鼠。无生长因子基质胶(Matrigel，9-10mg/mL，购自 Becton-Dickinson Biosciences)中分别混有 20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL 的趋化因子CXCL12 (购自 R&D Systems)，500ng/mL 的 VEGF-C (购自 R&D Systems)，以及 PBS 对照。将基质胶沿着小鼠腹膜中线皮下注射入BABL/c小鼠，基质胶在小鼠体内成固态形成栓塞，药物从基质胶中缓慢释放出来刺激小鼠新生淋巴管生成并长入基质胶。8天后，小心取出基质胶。
[0162]基质胶在PBS中清洗后，在30%蔗糖溶液中4°C固定过夜。进行冰冻切片，切片厚度约为1(^111，切片保存在-20°(:。冰冻切片用封闭液在湿盒中室温封闭I小时,封闭液为含10%正常山羊血清的PBS。吸除封闭液后，按照抗体说明书，直接加抗Podoplanin —抗(购自Santa Cruz Biotechnology),抗体稀释液为含1%正常山羊血清的PBS,在湿盒中室温孵育I小时。吸除一抗液体，用PBS清洗5次，每次5分钟。按照抗体说明书，加荧光素标记的二抗,抗体稀释液为含1%正常山羊血清的PBS，湿盒中室温孵育I小时。吸除二抗液体，用PBS清洗3次，每次5分钟。用DAPI染核。之后再用PBS清洗2次，每次5分钟。用水溶性封片剂(Clearmount，北京中杉金桥公司)封片。通过激光共聚焦显微镜(NikonAl)观察并成像，成像软件为NIS-Elements AR3.0。
[0163]实验结果
[0164]前面的结果表明小鼠淋巴内皮细胞表面高表达趋化因子受体CXCR4，并且在血管内皮生长因子C(VEGF-C)激活时CXCR4表达上调，我们推断CXCR4的配体趋化因子CXCL12能直接作用于小鼠淋巴内皮细胞，促进其运动迁移。于是，我们构建了淋巴内皮细胞的体外趋化模型。Transwell?实验结果显示不同浓度的趋化因子CXCL12均可以明显促进小鼠淋巴内皮细胞的迁移(图4.1)。
[0165]在新生淋巴管生成过程中，新生淋巴管从原有淋巴管“出芽”增生，迁移出来的以及新增殖的淋巴内皮细胞之间建立连接形成淋巴管的管腔。体外形成管腔状结构是内皮细胞的一个重要特点，也是新生淋巴管生成的重要一步。我们从管腔状结构形成能力的角度，体外研究趋化因子CXCL12对于新生淋巴管生成的影响。结果显示(图4.2)，在铺有基质胶(Matrigel)的培养皿中，趋化因子CXCL12能显著促进小鼠淋巴内皮细胞形成规则的管腔结构，并且成浓度依赖性。[0166]体外实验验证了趋化因子CXCL12能直接作用于小鼠淋巴内皮细胞，促进淋巴内皮细胞的迁移能力和成管能力，这两面都是新生淋巴管生成的重要步骤。那么在体内，趋化因子CXCL12是否能促进新生淋巴管生成呢？我们构建了基质胶栓塞实验，将混有趋化因子CXCL12的基质胶皮下注射入小鼠体内，让其诱导新生淋巴管生成，一段时间后，取出基质胶栓塞，检测基质胶中新生淋巴管的情况。免疫荧光结果显示基质胶中混有趋化因子CXCL12时，能招募更多的小鼠淋巴内皮细胞，形成明显的管腔结构，并且成浓度依赖性(图
4.3)，统计结果也证明了趋化因子CXCL12可以有效的诱导新生淋巴管生成。
[0167]实施例5
[0168]CXCL12激活淋巴内皮细胞内相关信号通路
[0169]实验方法
[0170]1、抗体封闭CXCR4对趋化因子CXCL12信号通路的影响
[0171]选取状态良好的第2-3代小鼠原代淋巴内皮细胞,分为4组,处理前一晚换成无血清ECM培养基，饥饿过夜。其中I组作为对照组一直都是无血清ECM培养，另外3组分别换成含抗CXCR4中和抗体(5 μ g/mL,购自北京Bioss公司)，同种IgG对照(5 μ g/mL,实验室制备)或PBS对照的无血清ECM培养基，预处理30分钟。这3个处理组细胞中加入IOOng/mL的CXCL12(购自R&D Systems)处理10分钟。收集细胞用于免疫印迹检测细胞中蛋白激酶B (Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)的磷酸化水平。
[0172]2、抑制信号通路对趋化因子CXCL12功能的影响
[0173]检测小鼠淋巴内皮细胞的迁移能力使用8 μ m孔径的Transwell吊篮(购自Costar)。吊篮放入24孔板中。选取状态良好的第2_3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs)，分为6组每组4个平行，每个平行样品约2 X IO4细胞，用胰酶将细胞消化下来，后用200 μ L无血清新鲜内皮细胞培养基(Endothelial Cell Culture Medium, ECM,购自 Sciencell)重悬。分别用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMS0)对照、蛋白激酶B (Akt)拮抗剂LY294002(10yM，购自 Sigma-AIdrich)和胞外信号调节激酶(Erk)拮抗剂 U0126 (10 μ M，购自Sigma-Aldrich)预处理30分钟，后接种到Transwell内侧小室中。外侧小室中各添加800 μ L无血清内皮细胞培养基ECM，外侧小室的培养基中分别混有二甲基亚砜(DMSO)对照、蛋白激酶B(Akt)拮抗剂LY294002 (10 μ Μ)和胞外信号调节激酶(Erk)拮抗剂U0126(10yM)，又分别有一组细胞同时加入100ng/mL的趋化因子CXCL12 (购自R&DSystems)。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。染色并计数迁移的细胞数。
[0174]实验结果[0175]体外实验证明了趋化因子CXCL12能招募淋巴内皮细胞，促进淋巴内皮细胞的成管能力，体内实验证明了趋化因子CXCL12能促进新生淋巴管生成，我们进一步检测小鼠淋巴内皮细胞内相关信号通路。Hu研究组在心肌细胞中发现趋化因子CXCL12能激活细胞中蛋白激酶 B(Akt)和胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase, Erk)磷酸化[45]。在我们的小鼠淋巴内皮细胞模型中，免疫印迹结果也得到了一致的结果，趋化因子CXCL12刺激能激活小鼠淋巴内皮细胞中的蛋白激酶B (Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)，但并不影响它们的蛋白水平(图)。那么趋化因子CXCL12激活小鼠淋巴内皮细胞中的蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)通路，是通过趋化因子受体CXCR4介导的么？我们用抗CXCR4中和抗体封闭趋化因子受体CXCR4，再用趋化因子CXCL12刺激小鼠淋巴内皮细胞，免疫印迹结果显示抗CXCR4中和抗体同时也抑制了趋化因子CXCL12的活性，蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)通路不能被趋化因子CXCL12激活，在同种免疫球蛋白IgG对照组中，趋化因子CXCL12依然能刺激蛋白激酶B (Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)的磷酸化(图5.1)。 [0176]前面的结果表明趋化因子CXCL12能激活小鼠淋巴内皮细胞内的蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)通路，那么蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)是否介导了趋化因子CXCL12促进淋巴内皮细胞的迁移运动。在趋化实验中，我们分别用蛋白激酶B (Akt)通路的拮抗剂LY294002和胞外信号调节激酶(Erk)的拮抗剂U0126处理细胞，这两个拮抗剂也同时抑制了趋化因子CXCL12诱导的淋巴内皮细胞的迁移(图5.2)。结果表明蛋白激酶B(Akt)和胞外信号调节激酶(Erk)通路参与了趋化因子CXCL12促进新生淋巴管生成。
[0177]实施例6
[0178]CXCL12表达水平与人肿瘤组织新生淋巴管生成正相关
[0179]实验方法
[0180]1、组织免疫荧光检测人肿瘤组织芯片中CXCL12表达水平和淋巴管密度
[0181]人多肿瘤组织芯片购自西安奥美公司，包含54个临床样本，平均年龄为55.6岁，年龄范围为15岁到81岁，男女比例为31: 23。肿瘤类型包括:脑星形细胞瘤、食道鳞状细胞癌、胃腺癌、肝细胞性肝癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肺鳞状细胞癌、膀胱泌尿上皮癌、心脏粘液瘤、肾透明细胞癌、甲状腺乳头状癌、胰腺癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺非特殊性浸润性导管癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌和睾丸精原细胞瘤，每种肿瘤类型包含3个临床样本。
[0182]将人肿瘤组织芯片进行组织复水和抗原修复，用于组织免疫荧光染色，使用抗趋化因子CXCL12 —抗(购自北京Bioss公司)和抗Podoplanin —抗(购自Biolegend公司)分别检测组织中CXCL12的表达水平和淋巴管的密度。通过激光共聚焦显微镜(NikonAl)观察并成像，成像和统计软件为NIS-ElementsAR3.0。
[0183]实验结果
[0184]前面的研究结果表明趋化因子CXCL12是一个新生淋巴管生成促进因子，那么在临床上，肿瘤组织中的趋化因子CXCL12水平也应该和新生淋巴管相关。我们使用人多肿瘤组织芯片，包含脑星形细胞瘤、食道鳞状细胞癌、胃腺癌、肝细胞性肝癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肺鳞状细胞癌、膀胱秘尿上皮癌、心脏粘液瘤、肾透明细胞癌、甲状腺乳头状癌、胰腺癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺非特殊性浸润性导管癌、卵巢透明细胞癌、前列腺癌和睾丸精原细胞瘤等18种肿瘤组织，共54个临床样本，组织免疫荧光检测趋化因子CXCL12水平和淋巴管密度，淋巴管用抗人Podoplanin抗体识别。然后根据结果将这些临床样本分为4组:
[0185]趋化因子CXCL12高表达和淋巴管密度高
[0186]趋化因子CXCL12低表达和淋巴管密度低
[0187]趋化因子CXCL12高表达和淋巴管密度低
[0188]趋化因子CXCL12低表达和淋巴管密度高
[0189]分别统计各组的临床样本数。结果显示在54个临床样本中，各组样本数为:
[0190]趋化因子CXCL12高表达和淋巴管密度高(21/54，占38.9% )
[0191]趋化因子CXCL12低表达和淋巴管密度低(29/54，占53.7% ) [0192]趋化因子CXCL12高表达和淋巴管密度低(2/54，占3.7% )
[0193]趋化因子CXCL12低表达和淋巴管密度高(2/54，占3.7% )
[0194]结果表明，54个临床样本中，有超过92%的病人肿瘤组织中趋化因子CXCL12水平与新生淋巴管密度正相关(图6.1)，并且这一结果在多种肿瘤类型中具有普遍意义。与我们的体外和体内结果一致。
[0195]实施例7
[0196]趋化因子CXCL12/CXCR4促进新生淋巴管生成的活性不依赖于生长因子VEGF-C/VEGFR-3 通路
[0197]实验方法
[0198]1、抗体封闭CXCR4对趋化因子CXCL12趋化活性的影响
[0199]检测小鼠淋巴内皮细胞的迁移能力使用8 μ m孔径的Transwell吊篮(购自Costar)。吊篮放入24孔板中。选取状态良好的第2_3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs)，分为10组每组4个平行，每个平行样品约2 X 104细胞，用胰酶将细胞消化下来，后用200 μ L无血清新鲜内皮细胞培养基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,购自Sciencell)重悬。实验分组为:
[0200]无任何处理的对照组X2;
[0201]100ng/mL的趋化因子CXCL12处理组；
[0202]同时有同种免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)对照(5 μ g/mL)；
[0203]同时有抗CXCR4中和抗体(5 μ g/mL)；
[0204]同时有CXCR4 拮抗剂 AMD3100 (25 μ g/mL)；
[0205]100ng/mL的生长因子VEGF-C处理组；
[0206]同时有同种免疫球蛋白(IgG)对照(5 μ g/mL)；
[0207]同时有抗CXCR4中和抗体(5 μ g/mL)；
[0208]同时有CXCR4 拮抗剂 AMD3100 (25 μ g/mL)。
[0209]其中有CXCR4中和抗体组、同种免疫球蛋白组和AMD3100处理组均提前30分钟预处理。预处理方法为:将细胞分别用抗CXCR4中和抗体(5 μ g/mL,购自北京Bioss公司)、同种免疫球蛋白(IgG)对照(5μ g/mL，实验室制备)和CXCR4拮抗剂AMD3100(25y g/mL，购自Sigma-Aldrich)孵育30分钟,孵育后接种到Transwell内侧小室中。外侧小室中各添加800 μ L无血清内皮细胞培养基ECM，外侧小室的培养基按照实验设计添加相应的药物。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。染色并计数。
[0210]2、抗体封闭VEGFR-3对趋化因子CXCL12趋化活性的影响
[0211]检测小鼠淋巴内皮细胞的迁移能力使用8 μ m孔径的Transwell吊篮(购自Costar)。吊篮放入24孔板中。选取状态良好的第2_3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs)，分为7组每组4个平行，每个平行样品约2 X IO4细胞，用胰酶将细胞消化下来，后用200 μ L无血清新鲜内皮细胞培养基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,购自Sciencell)重悬。实验分组为:
[0212]无任何处理的对照组；
[0213]100ng/mL的趋化因子CXCL12处理组；
[0214]同时有同种免疫球蛋白(Immunoglobulin G, IgG)对照(5yg/mL)；
[0215]同时有抗VEGFR-3中和抗体(5 μ g/mL)；
[0216]100ng/mL的生长因子VEGF-C处理组；
[0217]同时有同种免疫球蛋白(IgG)对照(5 μ g/mL)；
[0218]同时有抗VEGFR-3中和抗体(5 μ g/mL)；
[0219]其中有VEGFR-3中和抗体组、同种免疫球蛋白组提前30分钟预处理。处理方法为:将细胞分别 用抗VEGFR-3中和抗体(5μ g/mL，购自北京Bioss公司)、同种免疫球蛋白(IgG)对照(5yg/mL，实验室制备)孵育30分钟，孵育后接种到Transwell内侧小室中。外侧小室中各添加800 μ L无血清内皮细胞培养基ECM，外侧小室的培养基按照实验设计添加相应的药物。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。染色并计数。
[0220]3、基质胶栓塞实验验证VEGFR-3通路对趋化因子CXCL12的影响
[0221 ] 在基质胶栓塞实验中，准备BABL/c小鼠(5周龄，雌性，购自北京维通利华公司)，共12组，每组5只小鼠。实验分组为
[0222]PBS 对照组 X2;
[0223]500ng/mL 的趋化因子 CXCL12 组(购自 R&D Systems)；
[0224]同时有同种免疫球蛋白(ImmunoglobulinG, IgG)对照(10yg/mL)；
[0225]同时有抗CXCR4中和抗体(10 μ g/mL)；
[0226]同时有抗VEGFR-3中和抗体(10 μ g/mL)；
[0227]同时有CXCR4 拮抗剂 AMD3100 (50 μ g/mL)；
[0228]500ng/mL 的生长因子 VEGF-C 组(购自 R&D Systems)；
[0229]同时有同种免疫球蛋白(IgG)对照(10 μ g/mL)；
[0230]同时有抗CXCR4中和抗体(10 μ g/mL)；
[0231]同时有抗VEGFR-3中和抗体(10 μ g/mL)；
[0232]同时有CXCR4 拮抗剂 AMD3100 (50 μ g/mL)。
[0233] 按照实验设计，无生长因子基质胶(Matrigel,9-10mg/mL,购自Becton-DickinsonBiosciences)中分别均匀混入相应的药物。将基质胶沿着小鼠腹膜中线皮下注射入BABL/c小鼠，基质胶在小鼠体内成固态形成栓塞，药物从基质胶中缓慢释放刺激小鼠新生淋巴管生成并长入基质胶。8天后小心取出基质胶。[0234]免疫荧光检测基质胶中的新生淋巴管情况。通过激光共聚焦显微镜(NikonAl)观察并成像，成像和统计软件为NIS-Elements AR3.0。
[0235]实验结果
[0236]前面的结果证明了趋化因子CXCL12是一个新的淋巴管生成促进因子，能招募淋巴内皮细胞。那么趋化因子CXCL12是通过趋化因子受体CXCR4直接发挥作用还是也通过其他通路间接发挥作用呢？首先，体外细胞趋化实验证明了趋化因子CXCR4通路能介导趋化因子CXCL12招募小鼠淋巴内皮细胞，用趋化因子CXCR4中和抗体或者拮抗剂AMD3100能抑制趋化因子CXCL12诱导的小鼠淋巴内皮细胞的迁移，但并不影响生长因子VEGF-C的活性(图7.1)。
[0237]目前已报道的新生淋巴管生成促进因子中，生长因子VEGF-C/D是最特异和最主要的淋巴管生成促进因子，他们通过结合到受体VEGFR-3发挥作用。而且，VEGFR-3也能介导其他的淋巴管生成促进因子如碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast GrowthFactor, bFGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)的功能。那么，趋化因子CXCL12是否也会通过VEGFR-3通路间接发挥作用呢？在这里，我们检测封闭VEGFR-3通路是否也影响趋化因子CXCL12的活性。在趋化实验中，同时用抗VEGFR-3中和抗体处理小鼠淋巴内皮细胞，VEGF-C的活性被明显抑制，但是并不影响趋化因子CXCL12招募小鼠淋巴内皮细胞(图7.2)。
[0238]为了进一步证明这一点，我们构建了体内的基质胶栓塞实验，免疫荧光检测基质胶中的淋巴管密度得到了与体外趋化实验类似的结果，抗VEGFR-3中和抗体也不能抑制趋化因子CXCL12诱导的新生淋 巴管生成，而CXCR4中和抗体或者拮抗剂AMD3100能明显降低趋化因子CXCL12的活性(图7.3)。以上结果说明趋化因子CXCL12促进新生淋巴管生成的活性不依赖于VEGF-C通路，而通过趋化因子受体CXCR4直接作用于淋巴内皮细胞。
[0239]实施例8
[0240]CXCL12与VEGF-C促进新生淋巴管生成具有加和作用
[0241]实验方法
[0242]1、细胞趋化实验检测CXCL12与VEGF-C的联合作用
[0243]检测小鼠淋巴内皮细胞的迁移能力使用8 μ m孔径的Transwell吊篮(购自Costar)。吊篮放入24孔板中。选取状态良好的第2_3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs)，分为4组每组4个平行，每个平行样品约2 X IO4细胞，用胰酶将细胞消化下来，后用200 μ L无血清新鲜内皮细胞培养基(Endothelial Cell Culture Medium,ECM,购自Sciencell)重悬，后接种到Transwell内侧小室中。外侧小室中各添加800 μ L无血清内皮细胞培养基，外侧小室的培养基中分别混有100ng/mL的趋化因子CXCL12 (购自R&D Systems)，100ng/mL的VEGF-C (购自R&D Systems)，或同时加入趋化因子CXCL12和VEGF-C，以及PBS对照。将培养板放入细胞培养箱，5%二氧化碳，37°C正常培养6小时。染色并计数。
[0244]2、基质胶栓塞实验检测CXCL12与VEGF-C的联合作用
[0245]在基质胶栓塞实验中。准备BABL/c小鼠(5周龄，雌性，购自北京维通利华公司)，共12组，每组5只小鼠。实验分组为
[0246]PBS 对照组 X2;
[0247]500ng/mL 的 CXCL12 组(购自 R&D Systems)；[0248]500ng/mL 的生长因子 VEGF-C 组(购自 R&D Systems)；
[0249]同时有500ng/mL 的 CXCL12 和 500ng/mL 的生长因子 VEGF-C 组
[0250]按照实验设计,无生长因子基质胶(Matrigel,9-10mg/mL,购自Becton-DickinsonBiosciences)中分别均匀混入相应的药物。将基质胶沿着小鼠腹膜中线皮下注射入BABL/c小鼠，基质胶在小鼠体内成固态形成栓塞，药物从基质胶中缓慢释放刺激小鼠新生淋巴管生成并长入基质胶。8天后小心取出基质胶。
[0251]免疫荧光检测基质胶中的新生淋巴管情况。通过激光共聚焦显微镜(NikonAl)观察并成像，成像和统计软件为NIS-Elements AR3.0。
[0252]实验结果
[0253]既然趋化因子CXCL12是一个新生淋巴管生成促进因子，并且临床结果也表明趋化因子CXCL12的表达量与肿瘤新生淋巴管密度正相关(图6.1)，提示趋化因子CXCL12有可能是一个很好的靶点，用于抑制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴转移。考虑到趋化因子CXCL12与生长因子VEGF- C是两个独立淋巴管生成促进因子，有可能他们主要扮演着不同的角色，肿瘤组织分泌生长因子VEGF-C来激活正常的淋巴内皮细胞，而肿瘤组织中大量存在的趋化因子CXCL12可以招募这些激活的淋巴内皮细胞，促进其往肿瘤组织迁移运动。我们推测趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C在促进新生淋巴管生成方面具有加和作用。
[0254]为了研究这一点，我们首先在体外验证趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C同时存在具有加和作用或是协同作用。细胞趋化实验结果证实了趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C分别都可以促进小鼠淋巴内皮的迁移，而同时用趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C处理能取得更好的效果，约是单个因子作用效果的2倍(图8.1)。我们又在体内新生淋巴管生成的基质胶栓塞实验中，分别将CXCL12和VEGF-C单独或者同时混入基质胶中，检测基质胶中新生淋巴管生成的情况。与体外细胞迁移结果一致，趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C —起作用能更明显的促进新生淋巴管生成(图8.2)。
[0255]实施例9
[0256]同时封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C能更有效抑制肿瘤新生淋巴管生成
[0257]实验方法
[0258]1、人乳腺癌裸鼠原位瘤模型
[0259]人乳腺癌细胞株为MDA-MB-231 (购自 American Type Culture Collection,ATCC),利用增强型绿色突光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)慢病毒试剂盒(购自上海Gen印harma公司)构建稳定的增强型绿色荧光蛋白标记的MDA-MB-231细胞株(MDA-MB-231/eGFP)，构建方法按试剂盒说明书进行。
[0260]以24孔板为例,选取状态良好的第2-3代小鼠原代淋巴内皮细胞(mLECs),每孔加入细胞5 X IO4个，0.5mL正常的含胎牛血清的ECM培养基，在细胞培养箱37°C、5%二氧化碳培养过夜。配备病毒稀释液:含10%胎牛血清、终浓度5 μ g/mL的聚凝胺(Polybrene，可有效提高转染效率)、ECM培养基，将提前确定好滴度的慢病毒10 μ L按10倍稀释3-5个梯度。移去过夜的细胞培养液，加入配备好的病毒稀释液0.5mL，放入细胞培养箱37°C、5%二氧化碳培养，8-12小时以后观察细胞状态，若与对照组无明显差异，表明毒性作用低，可不换液，继续培养24小时后，再次将细胞培养基换成ImL正常的含胎牛血清ECM培养基，放入细胞培养箱37°C、5%二氧化碳培养。由于是原代细胞，可在转染4天后观察绿色荧光蛋白GFP荧光，连续培养细胞I周以上适时的换液和传代，保证细胞状态良好，最后即可得到稳定的增强型绿色荧光蛋白标记的MDA-MB-231细胞株(MDA_MB_231/eGFP)。
[0261]准备健康良好的裸鼠(Nude Mice,购自北京维通利华公司)，雌性、6_8周龄。收集增强型绿色荧光蛋白标记MDA-MB-231细胞株(MDA_MB_231/eGFP)，与基质胶(Matrigel，购自Becton-Dickinson Biosciences)等比例混合均匀，按照每只裸鼠接种3X IO6细胞悬液IOOyL,皮下接种到小鼠靠近腹股沟的乳房脂肪垫。分为4组，每组6只小鼠，实验分组为:
[0262]同种免疫球蛋白(IgG)对照组(2mg/kg)；
[0263]抗趋化因子CXCL12中和抗体组(2mg/kg)；
[0264]抗生长因子VEGF-C中和抗体组(2mg/kg)；
[0265]同时含抗趋化因子CXCL12中和抗体(lmg/kg)和抗生长因子VEGF-C中和抗体(lmg/kg)组。
[0266]按照实验分组，每天给裸鼠腹腔注射相应药物。3周后，取出肿瘤组织和近瘤旁的腹股沟淋巴结，拍片。
[0267]将取出的肿瘤和淋巴结组织，固定包埋，组织复水和抗原修复。
[0268]组织免疫荧光染色。取经过抗原修复的肿瘤组织切片，组织免疫荧光染色抗Podoplanin 一抗(购自 Santa Cruz Biotechnology),通过激光共聚焦显微镜(NikonAl)观察并成像，成像和统计软件为NIS-Elements AR3.0。
[0269]实验结果
[0270]既然趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C是两种独立的作用机制，都参与调控新生淋巴管生成，并且联合使用在促进新生淋巴管生成方面具有加和作用，我们尝试用抗体同时封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C，希望能有效抑制肿瘤新生淋巴管生成，从而治疗肿瘤转移。我们构建了人乳腺癌裸鼠原位模型，来研究联合阻断趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C控制肿瘤新生淋巴管生成和淋巴转移的情况。先利用慢病毒构建了稳定的增强型绿色突光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)标记的 MDA-MB-231细胞株(MDA-MB-231/eGFP)，可用于体内观察乳腺癌细胞转移情况。裸鼠乳房脂肪垫接种肿瘤后，小鼠腹腔给药，注射抗趋化因子CXCL12中和抗体和抗生长因子VEGF-C中和抗体。分离小鼠肿瘤组织，组织免疫荧光检测肿瘤淋巴管密度情况，激光共聚焦的统计结果显示抗趋化因子CXCL12中和抗体能明显降低乳腺癌肿瘤组织中新生淋巴管密度，而同时封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C可以比它们单独封闭能更好的抑制肿瘤新生淋巴管生成(图 9.1)。
[0271]实施例10
[0272]同时封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C能更有效抑制肿瘤淋巴转移
[0273]实验方法
[0274]人乳腺癌裸鼠原位瘤模型中，淋巴结组织切片，可用于直接观察转移到淋巴结中的带强型绿色荧光蛋白标记MDA-MB-231乳腺癌细胞。不需要经过免疫荧光染色，直接用DAPI染核，用PBS清洗5次，每次5分钟。用水溶性封片剂(Clearmount，北京中杉金桥公司)封片。通过激光共聚焦显微镜(Nikon Al)观察并成像，成像和统计软件为NIS-ElementsAR3.0。[0275]实验结果
[0276]在人乳腺癌裸鼠原位模型中，我们取出荷瘤小鼠的癌旁腹股沟淋巴结，分析乳腺癌淋巴结转移情况。观察荷瘤小鼠的癌旁淋巴结，抗体处理组小鼠的腹股沟淋巴结的肿大情况要明显好与同种免疫球蛋白(IgG)对照组的小鼠(图10.1)。
[0277]因为乳腺癌细胞株是绿色荧光蛋白标记的，可以在共聚焦显微镜下直接观察淋巴结的转移肿瘤细胞。进一步观察显示同时封闭趋化因子CXCL12和生长因子VEGF-C组的小鼠淋巴结几乎没有转移的乳腺癌细胞(图10.2)。该结果证实了我们的设想，一方面封闭趋化因子CXCL12能抑制乳腺癌细胞的淋巴转移，另外，同时阻断趋化因子CXCL12通路和生长因子VEGF-C通路的抗体联合多靶点治疗可以更有效的控制肿瘤淋巴转移。
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【权利要求】
1.CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂在制备用于抑制受试者中新生淋巴管生成的制剂中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述CXCR4抑制剂选自:抗CXCR4抗体或其活性片段、CXCR4拮抗剂AMD3100， 所述CXCL12抑制剂选自:抗CXCL12抗体、CXCL12拮抗剂和竞争性结合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
3.权利要求1或2的用途，其中所述受试者患有肿瘤、炎症和/或移植排斥反应。
4.CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂在制备用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述CXCR4抑制剂选自:抗CXCR4抗体或其活性片段、CXCR4拮抗剂AMD3100， 所述CXCL12抑制剂选自:抗CXCL12抗体、CXCL12拮抗剂和竞争性结合CXCL12的CXCR4的可溶性片段。
6.(a) CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及(b) VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂在制备用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述CXCR4抑制剂选自:抗CXCR4抗体或其活性片段、CXCR4拮抗剂AMD3100， 所述CXCL12抑制剂选自:抗CXCL12抗体、CXCL12拮抗剂和竞争性结合CXCL12的CXCR4的可溶性片段， 所述VEGF-C抑制剂选自:抗VEGF-C抗体、VEGF-C拮抗剂和竞争性结合VEGF-C的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段， 所述VEGF-D抑制剂选自:抗VEGF-D抗体、VEGF-D拮抗剂和竞争性结合VEGF-D的VEGFR-3或VEGFR-2的可溶性片段， 所述VEGFR-3抑制剂选自:抗VEGFR-3抗体和抑制VEGFR-3酪氨酸激酶活性的拮抗剂。
8.用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药物组合物，包括: 作为活性成分的:(a) CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，和(b) VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂，以及 任选的可药用载体。
9.用于抑制肿瘤患者中的肿瘤淋巴转移的药盒，包括: (a)CXCR4抑制剂和/或CXCL12抑制剂，以及 (b)VEGF-C抑制剂和/或VEGF-D抑制剂和/或VEGFR-3抑制剂。
【文档编号】A61K45/06GK103736092SQ201310340853
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】罗永章, 卓巍, 贾琳, 付彦, 常国栋 申请人:清华大学, 北京普罗吉生物科技发展有限公司