抑制流感病毒感染的方法及其药物的制作方法

专利名称：：抑制流感病毒感染的方法及其药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药
技术领域：
中治疗囊膜病毒感染的方法及其中所用的多肽及蛋白质药物。更特别地，本发明包括治疗流感病毒、尤其是高致病性禽流感病毒(如H5N1亚型)和人流感病毒(如H1N1亚型和H3N2亚型)的方法以及其中所涉及的多肽、蛋白质及编码该多肽、蛋白质的核酸和能表达上述多肽或蛋白质的载体或细胞。
背景技术：
：病毒感染不仅对全人类的健康造成极大的危害，也对多种动物的生存和养殖造成严重的威胁，因此成为当前医学及相关领域的重要研究课题。治疗病毒感染的药物的研究和发明具有重要的潜在应用价值，一旦成功，将产生巨大的社会效益和经济效益。流行性感冒(简称流感)是世界上最猖獗的传染病，这种上呼吸道急性传染病的传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高，而且是人、禽、畜共患的病毒性传染病。流感曾多次引起世界大流行如1918年的西班牙流感大流行，死亡人数达5000万；1957年的大流行，全世界有15亿人发病。它的发病率、所造成的总死亡人数及给社会和个人所带来的经济损失至今仍列传染病之首，给人类带来巨大的灾难。我国是流感多发国，自1957年以后的几次流感大流行都起源于我国(郭元吉，程小雯，1997)。因此，我国对流感的防治极为重视。流行性感冒病毒(简称流感病毒，Influenzavirus)是引起流感的病原体，属于正粘病毒科，为极易变异的负链RNA病毒。近年来备受关注的高致病性禽流感病毒(HighlyPathogenicAvianInfluenzaVirus,HPAIV)是由A型流感病毒引起的高度接触性急性传染病，可对家禽和野鸟造成从呼吸系统病变到全身败血症等致死性病变，曾多次在全球范围内发生大规模流行；更为严重的是，近年来发生了多起前所未有的H5N1亚型禽流感病毒感染人并导致患者死亡的事件(Kampseta1，2006)。高致病性禽流感病毒跨越种间障碍，在人际间进行传播并造成新一轮的世界大流行的可能性使得世界各国对高致病性禽流感的防治空前的重视。HPAIV已被世界兽医局动物流行病组织(OIE)列为甲类传染病，并被列入国际生物武器公约动物传染病名单，1992年被我国农业部列为甲类监测传染病。流感病毒主要由囊膜和核衣壳构成，囊膜由纤突、双层类脂膜和基质蛋白(M)构成。纤突分为两类一类呈棒状，由血凝素(HA)分子的三聚体构成；另一类呈蘑菇状，由神经氨酸酶(NA)分子的四聚体构成。双层类脂膜为病毒粒子出芽时从宿主细胞膜获得的。基质蛋白紧密排列在囊膜内侧，是维持病毒形态的结构蛋白。基质蛋白内部包围着核衣壳，核衣壳由8个呈螺旋形排列的RNA-核蛋白复合物(RNP)构成，每个RNP由一个单股负链RNA外面包被着核蛋白(NP)形成，流感病毒基因组的8个负链RNA就形成了8个RNP。按照核蛋白NP和基质蛋白M抗原性的不同，流感病毒被分为A、B、C三型，也有学者称为甲、乙、丙三型。它们没有共同的抗原，但都能感染人，其中以A型流感病毒的流行规模最大。各型流感病毒又根据其病毒粒子表面的血凝素(HA，简写为H)和神经氨酸酶(NA，简写为N)抗原性的不同而被分为多种亚型，其中A型流感病毒中已经发现的H亚型有16种，N亚型有9种，H和N亚型可以形成不同的组合，如H1N1、H5N1、H3N2、H9N2亚型等。自1918年以来，流感病毒已经造成多次世界性的大流行及大流行间期的小流行。流感病毒之所以如此猖獗肆行，是因为它能不断地发生变异，其变异的原因主要有一，流感病毒的基因组是由负链RNA组成的，由于在基因组复制过程中RNA复制酶缺乏校对功能，因此病毒基因组在宿主细胞内复制时极易发生变异，导致其编码的氨基酸发生变异，从而产生抗原漂变；二，流感病毒基因组是由8个分节段的RNA组成的，当同一个细胞感染不同的流感病毒粒子时，8个片段可以随机互相交换，发生基因重排，通过基因重排理论上可能产生28(256)种抗原性和致病力完全不同的新毒株，从而发生抗原转变，导致流感病毒能够逃逸宿主免疫系统的监视，在宿主体内大量复制，造成新的流行。因此，流感病毒的抗原变异快，不同毒株间的基因重排率高，给流感病毒的预防和治疗带来很大的挑战。流感病毒疫苗接种是当前人类预防流感的首选措施，然而，由于流感病毒血清型众多，一旦流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，就会导致疫苗失效，无法提供相应的保护；同时由于流感病毒变异的速度很快，疫苗研发的速度落后于病毒变异的速度，新的流形株出现后，其对应疫苗的制备至少需要6个月的时间(Kampsetal,2006)，造成疫苗制备一直处于被动状态，故无论传统灭活疫苗，还是基因工程疫苗、核酸疫苗等新型疫苗都无法对所有类型的流感病毒提供交叉保护。而且，流感疫苗的保护期短，仅有半年到一年，需要每年接种注射，不易为患者接受。而对于高致病性禽流感病毒疫苗，为避免宿主选择压力导致的病毒抗原变异快速发生，多数国家政府采取禁止或不提倡使用该疫苗的政策，在学术界也存在是否使用该疫苗的争议(Kampsetal,2006)。由于使用疫苗预防流感的效果较差，因此对流感病毒的药物防治的研究倍受关注。目前针对病毒感染、复制的分子机理而设计的药物研发已经取得了一些进展。目前用于治疗流感的化学药物有如下2类(1)离子通道抑制剂，即以流感病毒的离子通道蛋白M2为靶标的金刚垸胺(Amantadine)和金刚乙胺(Rimantadine),通过干扰流感病毒M2蛋白的离子通道活性而阻碍流感病毒的复制(Skehd，1992)，该药具有一定的治疗效果，但目前已经出现大量流感病毒耐药株(Jeffersonetal，2006)，且该类药物有较大的毒副作用，因此，WHO的专家已经建议停止使用M2离子通道抑制剂作为抗流感药物(Kampsetal，2006)。(2)神经氨酸酶抑制剂，即以流感病毒的神经氨酸酶NA为靶标的抑制剂，如4-胍基-2,4-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(4-胍基-Neu5Acen)及其类似物，可以通过抑制该酶的活性而有效地抑制病毒粒子在宿主细胞膜表面的释放，从而抑制流感病毒感染新的宿主细胞的过程。该药现以商品名扎那米韦(Zanamivir)和奥塞米韦(Oseltamivir)在美国和澳大利亚等国家用于流感病毒的治疗。Leneva等(2001)用流感病毒的敏感细胞株MDCK所做的体外实验表明扎那米韦对H5N1、H6N1、H9N2三种亚型的病毒的有效半数抑制浓度(EC50)为8.5-14.0^M。该药同离子通道抑制剂相比，药物的毒副作用较小，但也出现了耐药株(Abedetal,2006)，尤其在H5N1禽流感病毒感染的患者体内出现了耐药株(deJong,2005)。(3)人工合成的唾液酸寡聚糖类似物，如唾液酸糖苷脂质体、唾液酸糖苷多聚体和双价唾液酸糖苷等类似物，可以竞争地结合HA，从而阻碍HA和宿主细胞膜表面受体的结合，干扰了病毒的吸附过程，从而起到抑制病毒的作用，目前体外实验己经证实了其抑制作用(庞浩龙等，2004)，但未见体内实验的报道，更未见商品化的药物问世。(4)目前己经筛选出多种抗A型流感病毒的单味和复方中药制剂，主要为解表药和清热解毒药(如张卫民等，2001)，用于支持疗法，因此并不是流感病毒的特异性抑制剂。另外，中药服用不方便，只为少数人所接受，尤其是西方国家的人对中药的效果持怀疑态度，因此抗流感病毒的中药难以在世界范围内推广。利用生物技术研制的抗流感药物已经取得一些进展。例如，利用反义DNA、反义RNA技术或RNA干扰技术(siRNA)合成的寡核苷酸序列或构建的表达载体，在实验室研究中显示了不同程度的抗流感病毒活性(Gaoetal，2006)，但目前还没有商品化的药物问世。相关的研究表明，siRNA的靶标序列的变异也会导致病毒耐药株的出现，如目前在siRNA抗脊髓灰质炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的研究中已经发现了耐药的突变逃逸株(Dasetal,2004)。目前以囊膜病毒主要膜蛋白上的保守区一七肽重复区(HeptadRepeat,HR)为靶标的抗病毒药物的研发显示了良好的前景，其机理如下囊膜病毒感染宿主细胞的关键步骤是病毒的囊膜和宿主细胞膜的融合，该膜融合过程是由病毒囊膜上的融合蛋白介导的。根据融合蛋白的结构特点可以分为I型和II型融合蛋白，其中含I型融合蛋白的病毒较为常见，包括正粘病毒，副粘病毒，冠状病毒，逆转录病毒以及纤丝病毒等。I型融合蛋白在结构上都有两段称为七肽重复(HR)序列的区域，融合蛋白N端的七肽重复序列被命名为HR1，C端的七肽重复序列被命名为HR2。这两段序列在I型融合蛋白发挥膜融合活性时起重要作用，不同病毒的HR1和HR2序列的位置和长短有所不同。在融合过程中，三个HR2以反向平行的方式附着到三个HR1所形成的中心三聚体的沟槽中，形成一种稳定的六螺旋束或称发卡三聚体的结构，这种结构形成的过程中，可以将病毒囊膜和细胞膜拉近并使二者接触，诱导膜融合的发生。对HIV-1，SARS冠状病毒(SARS-CoV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)、新城疫病毒(NDV)的研究表明外源加入的HR1或HR2多肽能抑制病毒对宿主细胞的感染，推测其机理为在膜蛋白发生构象变化、诱导膜融合的过程中，外源多肽能竞争性地和病毒融合蛋白上的HR2或HR1结合从而阻断病毒融合蛋白自身的HR1和HR2之间的相互作用，使得病毒融合蛋白的发卡三聚体结构不能形成，从而抑制了病毒囊膜和细胞膜的融合，达到阻止病毒进入细胞的目的(Youngetal，1999;Wangetal，2003;Greenbergetal，2004)。目前，源于HIV-1融合蛋白gp41上HR2区域的多肽T-20已于2003年3月通过美国食品和药物检验局(FDA)"快通道"批准，成为第一个阻止HIV-1进入细胞的抗艾滋病的多肽药物，其治疗效果很好。然而这类多肽药物人工合成成本较高，HIV-1又是慢性感染病毒，需要长期持续注射药物，在美国注射T-20要花费两万美元/年，在欧洲要花费两万五千美元/年，昂贵的药费使得T-20的应用受到了一定的限制。与此不同的是，流感病毒为一过性感染，不会形成长期慢性感染，感染前后若能及时给药进行预防和治疗，可以有效地控制病程的发展，减少传染性，降低感染者的死亡率。上述表明抗流感病毒的药物研发虽然取得了一些进展，但已经商品化的化学合成药物都出现了耐药株，已经获得专利保护的抗流感药物中，目前还没有商品化的、基于生物技术而研发的抗流感病毒药物问世。
发明内容面对高致病性禽流感病毒近年来跨越种间障碍进行传播并造成新一轮的世界大流行的可能性，以及人流感病毒常常发生流行的现状，本发明的发明人及时提出与己有抗流感病毒药物作用机理完全不同的一种新的药物研制策略该策略以流感病毒感染宿主细胞这一关键步骤为靶标，基于流感病毒的膜蛋白HA在膜融合前后的构象变化特点，设计和合成了特异性的抑制剂(包括多肽和蛋白质)，此为本发明的创新点之一。其二，I型囊膜病毒的膜融合有两种类型，第一种类型为在中性pH条件下，病毒囊膜直接与宿主细胞膜融合，然后将病毒基因组释放到细胞质中；第二种类型为病毒被细胞内吞后，在内吞泡中低pH条件的诱导下，病毒囊膜与内吞泡膜发生融合，然后将病毒基因组释放到细胞质中。已经发现的源于囊膜病毒膜蛋白的HR1或HR2肽抑制剂所抑制的病毒都属于第一种膜融合类型，而流感病毒的膜融合类型属于第二种，因此，本发明的创新之处还在于首次发现属于第二种膜融合类型的病毒感染也可以被HR1和HR2多肽抑制剂所抑制，这一发明将为同类病毒的抑制剂的筛选提供新的思路。本发明的分子机理如下流感病毒是囊膜病毒，流感病毒囊膜表面主要含有两种膜蛋白即HA和NA，其中HA在病毒感染宿主细胞这一关键步骤中发挥着重要作用。HA合成后被酶切为HA1和HA2两个亚基，其中HA1亚基形成.HA蛋白的头部，主要功能为识别宿主细胞膜表面的受体分子(唾液酸)，HA2位于HA1形成的头部下面，主要与流感病毒囊膜和宿主细胞的内吞泡膜的融合有关。由于流感病毒感染细胞时，首先由膜蛋白HA的头部(HA1亚基)识别宿主细胞膜表面的唾液酸受体分子，然后宿主细胞膜内陷形成内吞泡，将流感病毒粒子包裹进入细胞内，内吞泡中的pH值降低到5.5以下后，HA蛋白的构象发生剧烈变化，HA1三聚体发生解离，位于HA2N端的融合肽被暴露并插入内吞泡膜中，随后位于HA2亚基上的三个HR2以反向平行的方式附着到三个HR1所形成的中心三聚体的沟槽中，形成一种稳定的六螺旋束(6-helix)，最终导致病毒囊膜和内吞泡膜发生融合，从而将病毒核衣壳释放到细胞质中，开始病毒的复制过程。由于两段七肽重复区HR1和HR2在HA蛋白的构象变化过程中发挥着主要作用，因此发明人提出根据高致病性禽流感病毒H5N1囊膜蛋白HA2上的七肽保守区HR1和HR2的序列，设计并合成(或表达)多肽和蛋白质，施药后可以有效地抑制高致病性禽流感病毒H5N1亚型和人流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型流感病毒对其敏感细胞一MDCK细胞的感染，从而提供新型的抗流感病毒(包括人流感病毒和禽流感病毒)的:在本发明中，发明人提出了新型的流感病毒抑制剂一一具有特定序列的多肽、蛋白质及其编码基因，以及包含其中的一种、两种或两种以上组分任意组合的药物。我们针对流感病毒感染宿主细胞的关键步骤一膜融合过程，设计了抑制流感病毒与宿主细胞膜融合的多肽和重组蛋白，用于阻断流感病毒对宿主细胞的感染。本发明的目的在于提供抑制流感病毒感染的多肽、蛋白质及其编码基因，同时包括能表达该多肽或蛋白质的载体，如重组DNA载体、重组病毒载体和细胞等。具体而言，在第一个方面，本发明包括抑制流感病毒感染宿主细胞的多肽HR1和HR2(下文中有时也直接表示为"HR1"和"HR2")，它们的序列为来自H5N1亚型高致病性禽流感病毒囊膜蛋白HA上的保守区序列，即七肽重复区序列(见图1)，其中多肽HR1的代表序列为SEQIDNO:l的氨基酸序列或将SEQIDNO:l的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得的且具有抑制流感病毒感染作用的序列，(如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3);其中多肽HR2的代表序列为SEQIDNO:4的氨基酸序列或将SEQIDNO:4的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得的且具有抑制流感病毒感染作用的序列(如SEQIDNO:5)。上述一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加包括在序列内部的任意位置和序列两端的添加和/或缺失。在变异的氨基酸残基中，优选变异为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更好的保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧基和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在第二个方面，本发明设计了将序列HR1和HR2通过连接肽(即linkerl和linker2)连接得到的蛋白，其中linked和linker2分别独立地为连接肽。本发明可使用连接肽连接在本发明中的各个活性成分(如HR1、HR2)，也可以不使用接头肽而让上述活性成分直接相连或直接混合。优选地，涉及将序列HR1和HR2通过连接肽(即linkerl和linker2)连接得到的重组蛋白一HR12121(该蛋白的结构示意图见图2)。在本发明中，所述连接肽Linked和Linker2为本领域技术人员所熟知的序列，其包含选自下列各项的至少一种甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸。例如由l一50个氨基酸残基组成的、包含若干个甘氨酸和/或丝氨酸和/或脯氨酸和/或丙氨酸残基的、以任意方式组合的多肽，其代表序列见SEQIDNO:6—10。上述五螺旋蛋白的排列顺序为NH2HRl-Linkerl-HR2-linker2-HRl-Linkerl-HR2-linker2-HRlCOOH;其代表的氨基酸序列见SEDIDNO:l1。同时，本发明还涉及上述多肽或蛋白的衍生物。例如，与蛋白检测和纯化标签如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、组氨酸标签(His6)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、N位点利用蛋白(Nus)等(包括但不限于此)融合后形成的重组蛋白。本发明也包括将上述一种以上的多肽和蛋白混合后形成的混合物。在第三个方面，本发明涉及编码上述抑制流感病毒感染的多肽或蛋白质的DNA序列。具体地，编码多肽HR1的DNA序列选自下列多核苷酸序列之一1)SEQIDNO:12的多核苷酸序列；2)编码SEQIDNO:l的氨基酸序列的多核苷酸序列；3)在高严谨条件下与SEQIDNO:12的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，其编码具有抑制流感病毒感染宿主细胞活性的多肽；4)与SEQIDNO:12的多核苷酸序列具有90X以上、优选95°%、96%、97°%、98%或99%同源性，且编码具有流感病毒抑制活性的蛋白质的多核苷酸序列。编码多肽HR2的DNA序列选自下列多核苷酸序列之一1)SEQIDNO:13的多核苷酸序列；2)编码SEQIDNO:4的氨基酸序列的多核苷酸序列；3)在高严谨条件下与SEQIDNO:13的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，其编码具有抑制流感病毒感染宿主细胞活性的多肽；4)与SEQIDNO:13的多核苷酸序列具有90%以上、优选95%、96%、97%、98%或99%同源性，且编码具有流感病毒抑制活性的蛋白质的多核苷酸序列。在本发明的第四个方面，提供了编码蛋白质HR12121的多核苷酸序列，其选自下列多核苷酸序列之一1)SEQIDNO:14的多核苷酸序列；2)编码SEQIDNO:ll的氨基酸序列的多核苷酸序列；3)在高严谨条件下与SEQIDNO:14的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，其编码具有抑制流感病毒感染宿主细胞活性的蛋白质；4)与SEQIDNO:14的多核苷酸序列具有90%以上、优选95%、96%、97%、98%或99%同源性，且编码具有流感病毒抑制活性的蛋白质的多核苷酸序列。所述"在高严谨条件下的杂交"是指核酸能在ManiatisT.等.(编辑)，MolecularCloning:ALaboratoryManual2nded.,ColdSpringHarborLaboratory(1989)所述的条件或类似条件下进行杂交。例如，它是指在下述条件下的杂交能力1)将SEQIDNO:12、13或14所示的多核苷酸分子在酸、碱或热处理后使双链分子变性，然后固定在硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它能与单链DNA分子结合的固相基质上，经变性后加入含有特定序列的外源多核苷酸分子的杂交液，在6S。C杂交4一20h，如果外源多核苷酸分子能和固定在膜上的多核苷酸分子形成双链，即为该两种分子能进行杂交。2)在杂交液中加入SEQIDNO:12、13或14所示的多核苷酸分子，经变性后加入外源多核苷酸分子，在68。C杂交4一20h，杂交后形成的双链可以特异地吸附到羟基磷石灰或其它能与双链DNA分子结合的基质上，通过离心可以收集吸附有双链核酸分子的羟基磷石灰或基质，从而获得杂交的双链DNA分子，这种情况下也表明该外源多核苷酸分子可以和本发明中的序列进行杂交。在本发明的第五个方面涉及含有上述多核苷酸序列的载体。载体可以包括本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明适用的载体包括但不限于在细菌中表达用的载体(包括各类原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达用的杆状病毒载体、在哺乳动物中表达用的载体(如腺病毒载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物所用的器官特异性表达载体如乳腺表达载体等。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制和传代，任何质粒和载体都可使用。优选的表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因；酵母菌的缺陷选择标记，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本领域技术人员可利用本领域已知的DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述的DNA序列、合适的转录和翻译序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞或生物，以便获得所需要的目的蛋白。在本发明的第六个方面还提供了含有上述载体的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染了含本发明所述的编码能抑制流感病毒感染的多肽和蛋白的DNA序列后，可用于生产所需多肽和蛋白，或将其直接用于给药。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入细胞中，所用方法包括但不限于氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法和显微注射法等用于哺乳动物细胞等真核细胞的方法。在本发明的第七个方面，提供用于治疗流感病毒感染的药物，其包括治疗有效量的按照本发明第一方面的多肽和/或第二方面的蛋白质和/或包含按照本发明第三和/或第四方面的多核苷酸的载体或细胞。本发明的药物可以制成注射液、片剂或喷雾剂，药物可以按照药学领域的常规方法制备。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。在本发明的第八个方面，提供了治疗流感病毒感染的方法，其包括对受试者给药治疗有效量的按照本发明第一方面的多肽、第二方面的蛋白质、包含按照本发明第三、第四方面的多核苷酸的载体或细胞，也包括对受试者给药治疗有效量的上述一种以上多肽、蛋白质、载体或细胞的混合物。所述给药可通过所属
技术领域：
技术人员所熟知的方式来进行给药，如注射、口服、肺部、鼻腔、口腔给药等，优选的方式为肺部、鼻腔和口腔给药。给药剂量可以根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需要的量(有效剂量)可以由医师根据实际情况(如受试者的病情、年龄、体重等)而容易地确定。对于注射给药模式来说，优选的剂量是每kg体重100ng-10mg，更优选的是每kg体重1吗-1mg，最优选的是每kg体重10呢-100吗。在本发明的第九个方面，提供用于治疗流感病毒感染的试剂盒，其包括1)按照本发明第一方面的多肽或第二方面的蛋白质，或包含按照本发明第三、第四方面的多核苷酸的载体或细胞或上述一种以上多肽、蛋白质、载体或细胞的混合物；2)使用说明书。其中说明书指示给药的方法，其中包括给药次序、时间、剂量、给药方式等内容。在本发明的第十个方面，涉及包含按照本发明的第一方面的多肽或按照本发明的第二方面的蛋白质或按照本发明第三、第四方面的多核苷酸的载体或细胞或上述一种以上多肽、蛋白质、载体或细胞的混合物在制备用于治疗流感病毒感染的药物中的应用。本发明的方法可以治疗流感病毒的感染，尤其是H5N1、H1N1亚型和/或H3N2亚型的流感病毒，优选是高致病性禽流感病毒(H5N1亚型)的感染，最优选的是在中国分离的青海株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的感染。按照本发明的第一方面的多肽或按照本发明的第二方面的蛋白质或按照本发明第三、第四方面的多核苷酸的载体或细胞或上述一种以上多肽、蛋白质、载体或细胞的混合物优选用于人类、哺乳动物或禽类。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的有益效果对所属领域的技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好象它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。图l:本发明所涉及的禽流感病毒膜蛋白HA的一级结构，HA蛋白合成后可以被特异性的蛋白酶裂解为HA1(l—346位氨基酸)和HA2(347—569位氨基酸)两个亚单位，图示了七肽重复区HR1和HR2在HA2亚单位中的位置。图2:本发明中的重组蛋白质HR12121的结构示意图。HR1和HR2之间由特定的接头肽Linked和Linker2连接，Linkerl和Linker2可以相同，也可以不同，接头肽的具体序列如SEQIDNO:6-10。图3:流感病毒RNA表达载体pHH21的图谱和限制性酶切位点。P:人RNA聚合酶启动子位点；T:鼠RNA聚合酶I终止子；fomBI:为载体上的限制性酶切位点，用于克隆外源基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，为筛选标记。图4:本发明中化学合成的HR1多肽对QH-WSN禽流感病毒噬斑的抑制效果。病毒对照不加多肽、只加病毒感染细胞后产生的噬斑对照；病毒+肽病毒和不同浓度的多肽HR1(多肽的终浓度分别为100、10和1^M)混合后感染细胞产生的噬斑。图示每孔中呈白色的圆斑即单个禽流感病毒感染细胞后扩散到邻近细胞形成的噬斑，经中性红(0.05%)染色后，活细胞着色，呈红色；被病毒感染的细胞已经死亡，不能被染色，呈白色。图5:本发明中化学合成的HR1多肽和HR2A多肽混合后对WSN流感病毒噬斑形成的抑制效果。病毒对照不加多肽、只加病毒感染细胞后产生的噬斑对照；病毒+肽病毒和不同浓度的多肽HR1+HR2A(二者等量混合，每种多肽的终浓度分别为100、10和1pM)混合后感染细胞产生的噬斑。图6:将HR1在真核细胞膜上表达的载体构造示意图。信号肽，为人工合成的人神经生长因子的低亲和力受体(HumanLow-affinityNerveGrowthFactorReceptor,LNGFR)的信号肽；铰链区为免疫球蛋白G的铰链区；跨膜区为LNGFR的跨膜区。增强型绿色荧光蛋白为所用的真核表达载体pEGFP-Nl上的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因。除了以HR2代替HR1以外，将HR2在真核细胞膜上表达的载体构造与HR1的相同。图7:HR1在真核细胞细胞膜上表达的示意图。其中HR1表达在膜外，通过跨膜区锚定在膜上，EGFP表达在细胞膜内，不影响HR1的功能，为稳定克隆细胞系的筛选提供了标记。HR2在真核细胞膜上表达的示意图与HR1相似，只是用HR2代替HR1。图8A:稳定表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK细胞。在荧光显微镜下经蓝光激发后，HR1-EGFP融合蛋白呈现绿色荧光，图示HR1-EGFP融合蛋白在细胞内部和细胞膜表面都有表达，箭头仅示其中之一。图8B:稳定表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞。在荧光显微镜下经蓝光激发后，HR2-EGFP呈现绿色荧光，图示HR2-EGFP融合蛋白在细胞内部和细胞表面都有表达，箭头仅示其中之一。图8C:稳定表达HR1-EGFP和HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞的Western-Blotting检测。用抗EGFP的抗体(1:2000)检测。MDCK:MDCK细胞阴性对照，没有检测到任何条带；MDCK/EGFP:用转染pEGFP-Nl空载体的MDCK细胞为阳性对照，检测到约27kDa的条带，与EGFP蛋白的预期大小相同；MDR1:稳定表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK细胞，检测到约36kDa蛋白条带，与融合蛋白的预期大小符合；MDR2:稳定表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞，检测到约40kDa的蛋白条带，与融合蛋白的预期大小符合。图9A:QH-WSN禽流感病毒在MDCK细胞和稳定表达HR1-EGFP融合蛋白的MDR1细胞上形成的噬斑。图9B:QH-WSN禽流感病毒在MDCK细胞和稳定表达HR2-EGFP融合蛋白的MDR2细胞上形成的噬斑。图10:WSN人流感病毒在MDCK细胞和稳定表达HRl/2-EGFP融合蛋白的MDR1/2细胞上形成的噬斑大小。MDCK:正常的MDCK细胞；MDR1:稳定表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK细胞；MDR2:稳定表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞。第1行所示为WSN人流感病毒感染前的细胞形态(100X表示该图像为100倍放大后拍摄，下同)；第2和第3行所示为WSN人流感病毒感染后所形成的噬斑(100倍放大)。由于WSN人流感病毒在MDCK细胞上形成的噬斑普遍比较大，100倍放大后只拍摄了约l/4大小的噬斑。从图中可以看出，WSN人流感病毒在MDCK细胞上形成的噬斑比在MDR1和MDR2细胞上形成的噬斑大。图11A:SDS-PAGE检测重组蛋白HR12121的表达和纯化。1:BL21/pET-30a空载体诱导表达产物；2:BL21/pET-HR12121在16。C诱导表达12小时后的菌体沉淀；3:BL21/pET-HR12121在16""C诱导表达12小时后的细菌裂解液上清；4-6:分三次洗脱的目的蛋白(洗脱液为200mMTris，20mMNaCl，200mM咪唑)，蛋白大小约25kDa;7:蛋白分子量标准，右侧所示数字为蛋白分子量的大小，单位为kDa。图11B:重组蛋白HR12121表达和纯化的Western-Blotting检测。用抗His的抗体(1:5000)检测。1:BL21/pET-HR12121诱导前的菌体裂解液；2:BL21/pET-HR12121在16。C诱导表达12小时后的菌体裂解液上清；3:从上清中纯化的HR12121蛋白(IOO倍稀释)，右侧所示数字为蛋白分子量的大小，单位为kDa。图12:重组表达并纯化的HR12121蛋白对JX人流感病毒的噬斑抑制效果。病毒对照不加多肽、只加病毒感染细胞后产生的噬斑对照；病毒+蛋白为病毒加不同浓度的蛋白感染的细胞(蛋白终浓度分别为200、20和2(iM)。具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明。但本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，本发明的精神和范围由后附的权利要求书所限定。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟知的《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，北京，中国，2002年)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列举的方法来实施。以下实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。所用溶液的配方，如无特别说明，均为《分子克隆实验指南》中的配方。本发明中涉及流感活病毒的操作均在中国军事医学科学院病原微生物重点实验室的BSL-3实验室完成。实施例1:高致病性禽流感病毒A/bar-headedgoose/Qinghai/1/05株HA和NA基因的病毒RNA表达质粒的构建1.1)病毒RNA的提取高致病性禽流感病毒A/bar-headedgoose/Qinghai/1/05株(以下简称QH株)为H5N1亚型的高致病性禽流感病毒，由本实验室分离和保存(参见文献Liuetal,2005)。将-7(TC保存的QH株流感病毒鸡胚尿囊液经3000r/m离心10min以去除杂蛋白，然后吸取140pi上清到无RNA酶的1.5ml离心管中，用病毒RNA提取试剂盒(QIAmpViralRNAMiniKit,CAT.No.52904)提取病毒RNA，按照试剂盒提供的说明书操作。经提取、吸附、洗涤、离心、洗脱后，获得60pl病毒RNA溶液，分装后置-8(TC保存。1.2)RT-PCR扩增QH株HA和NA的基因片段(1)引物的设计、合成及RT(逆转录)反应根据Liu等(2005)测序的结果，设计如下引物进行RT-PCR反应PhGCAAAAGCAGGGGTCTGATCTGTC(SEQIDNO:15)P2:AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTAC(SEQIDNO:16)P3:GCAAAAGCAGGAGTTCAAAATG(SEQIDNO:17)P4:AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAACAGACTACTTG(SEQIDNO:18)RT-PCR反应所用试剂盒为TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(CodeNo.DRR019A)。HA基因的RT反应体系(10pi)如下MgCl2，2pi;10XRTBuffer:1(il;RNaseFreedH20:1.75pi;dNTPs(各10mM):1RNaseInhibitor:0.25jil;AMVReverseTranscriptase:0.5^1;弓l物Pl:0.5pi;病毒基因组RNA模板3^1。反应条件30。C孵育10min，42。C延伸30min，99。C灭活5min，(TC冰浴5min。NA基因的RT反应体系与HA的相同，只用引物P3代替P1，反应条件也相同。(2)PCR扩增HA基因(SEQIDNO:37)的PCR反应体系(50lil)如下5XPCRBuffer:10^1;灭菌DEPC水28.75pi;TaKaRa五:cTagHS:0.25^1;引物P1和P2(10pM):各0.5^1;RT产物10|^1。反应条件94。C预变性2min，94。C变性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸2min;共循环30次，最后72"C延伸10min。NA基因(SEQIDNO:48)的PCR反应体系与HA的相同，只用引物P3和P4代替引物P1和P2，反应条件也相同。PCR产物经切胶回收纯化(胶回收试剂盒为QIAquickGelExtractionKit(250)，CAT.No.28706)后分别连入pGEM-T载体上(Promega公司)，连接体系为PCR产物7^1;pGEM-T载体1^1;IOX连接酶缓冲液1^1;T4DNA连接酶1^1。16t连接12h以上后，将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞(由本实验室制备并保存)。经测序鉴定阳性克隆，分别命名为pGEM-HA和pGEM-NA。1.3)QH株流感病毒HA和NA基因片段定向克隆到pHH21质粒为了用流感病毒的反向遗传系统制备重组病毒，常用病毒RNA表达载体pHH21(载体图谱见图3)表达流感病毒的基因组负链RNA。为了将HA和NA基因片段定向克隆到pHH21质粒(由美国威斯康辛大学的YoshihiroKawaoka教授惠赠，参见文献Neumannetal，1999)，设计和合成了如下引物P5:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGG(SEQIDNO:19)P6:TATTCGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGG(SEQIDNO:20)分别以pGEM-HA和pGEM-NA为模板，采用如下PCR体系(25pi)分别扩增HA和NA基因片段5XPCRBuffer:5pl;灭菌水12.8^1;dNTPs(各10mM):4TaKaRa￡x&《HS:0.2pi;弓I物P5禾卩P6(10^M):各lph质粒模板I—反应条件9fC预变性2min，94。C变性30sec，56。C退火30sec，72。C延伸2min;共循环30次，最后72。C延伸10min。将目的片段分别切胶纯化后，用5smBI(NewEnglandBiolabs)酶切目的片段，体系如下PCR产物15.0^1;10XNEBbuffer3:5pi;灭菌水28nl;^mBI酶2|il。55。C酶切8h，切胶回收目的片段后，与经同样酶切的载体pHH21相连，体系为PCR产物10jil;pHH21载体6^1;10X连接酶缓冲液2^1;T4DNA连接酶2^。16。C连接12h以上后，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。经测序鉴定阳性克隆，分别命名为pHH21-HA(QH)和pHH21-NA(QH)。实施例2:重组流感病毒WSN和QH-WSN的制备2.1)重组流感病毒WSN的制备实验中所用的重组人流感病毒A/WSN/33(为H1N1亚型，以下有时简称"WSN")由本实验室用12个质粒的流感病毒反向遗传系统(Luytjesetal，1989)制备，该12个质粒反向遗传系统由美国威斯康辛大学的YoshihiroKawaoka教授惠赠(Neumannetal，1999)。该系统包括用于表达流感病毒基因组的8个负链RNA片段的表达质粒(包括pHH21-PB2、pHH21-PBl、pHH21-PA、p朋21-HA、p朋21-NP、pHH21-NA、pHH21-M、pHH21-NS、)和表达流感病毒复制酶复合体的四个蛋白表达质粒(包括pcDNA3-PB2、pcDNA3-PBl、pcDNA3-PA、pCAGGS-NP)。将上述质粒分别转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单克隆在LB培养基中培养6h以上后，用质粒小提试剂盒(QIAprepSpinMiniprepKit(250)，CAT.No.27106)分别提取质粒。将上述12个质粒等量混合，用磷酸钙法(具体方法参见《分子克隆实验指南》)转染293T细胞(购自美国菌种保藏中心，ATCC编号为CRL-11268),10h后换新鲜的Dulbecco，smodifiedEagle'smedium(DMEM)培养基(Gibco公司)，37。C培养72h，取细胞培养上清液感染MDCK细胞(Madin-Darbycaninekidneycell,该细胞购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC保藏号为GDC012)。3—4天后出现细胞病变，收取上清液，稀释1000倍后接种9日龄鸡胚的尿囊腔，37。C接种2一3天，至鸡胚死亡后收取尿囊液，离心后分装，一7(TC保存，得到重组人流感病毒A/WSN/33，以下简称"WSN"。2.2)重组流感病毒QH-WSN的制备同理，利用上述12质粒反向遗传系统，将其中的pHH21-HA和pHH21-NA两种质粒去掉，加入上述制备的QH株的pHH21-HA(QH)和pHH21-NA(QH)质粒，即用QH株的HA和NA基因替换WSN的HA和NA基因后，通过上述反向遗传系统制备重组杂交病毒，命名为"QH-WSN"，其HA和NA蛋白来自H5N1亚型的高致病性禽流感病毒，因此为H5N1亚型，具有高致病性禽流感病毒的感染特性。实施例3:实验用流感病毒的噬斑效价测定为了检测本发明中的多肽和蛋白质对高致病性禽流感病毒的抑制作用，我们检测了其对具有H5N1高致病性禽流感病毒感染特性的QH-WSN重组病毒的抑制效果。同时，为了检测上述多肽和蛋白质对人流感病毒是否具有交叉抑制作用，我们检测了其对与QH-WSN遗传背景相似但表面膜蛋白为H1N1亚型的重组WSN病毒(人流感病毒)的抑制效果；此外，我们同时检测了其对2005年从中国南方地区分离到的人流感病毒H3N2亚型的代表毒株(A/江西/312/2005，简称"JX"株)的交叉抑制效果(蓝雨等，2006)。由于狗肾传代细胞(MDCK)细胞是适合于流感病毒生长的敏感细胞株(Gaushetal，1966)，在本发明中用于检测流感病毒的感染性。所用的具体方法为噬斑抑制实验。由于在实验中需要确定病毒的噬斑效价，所以首先用噬斑实验测定WSN、QH-WSN和JX三种病毒原液的噬斑效价。将MDCK细胞接种于12孔细胞培养板，于37r培养箱(5%C02)培养24—36小时，长至100X满后弃掉上清，将细胞先用PBS溶液(pH7.4)洗2次，再用无血清DMEM培养基洗1次(由于胎牛血清对流感病毒感染宿主细胞有抑制作用，所以在加入病毒前要洗涤细胞，以便去掉培养基中残留的血清)。将上述三种病毒原液分别做10倍梯度稀释，每孔细胞中加入500^，每个梯度设三个复孔，37'C孵育1h后弃掉病毒溶液，用PBS将细胞洗涤2次，再用无血清DMEM培养基洗1次，以去除没有吸附的病毒粒子。预先熔化3%的低熔点琼脂糖，放至室温后取6ml加入等量的预热到37。C的无血清DMEM培养基(不含酚红，无色，购自Gibco公司)和lx胰酶(300:1，购自Gibco公司)，混匀后加入孔中，lml/每孔，室温正放30min以上，待琼脂凝固后，倒置于37"C培养箱继续培养2—4天，待噬斑出现并扩散至其大小适于观察后，取适量熔化的3%低熔点琼脂糖，放至室温，加入等量的预热到37。C的无血清DMEM培养基(不含酚红，无色)，加入1%中性红(20:1，购自Gibco公司)，混匀后加入孔中，lml海孔，避光室温正放30min以上，待琼脂凝固后，避光倒置于37。C培养箱继续培养l一2天，待噬斑清晰后，计数噬斑，每孔计数至少两次，以避免人为误差。每组实验均重复三次以上。根据噬斑的数量和病毒的稀释倍数计算病毒原液的噬斑效价，结果为WSN的噬斑效价为10"PFU/ml(PFU为噬斑形成单位一plaqueformationunit的英文縮写)，QH-WSN的效价为10"PFU/ml，JX的效价为1052PFU/ml。实施例4:QH株来源的HR1多肽的化学合成及其对病毒感染的抑制活性的测定1)HR1多肽的化学合成根据序列表中SEQIDNO:l的氨基酸顺序，利用化学合成法合成纯度大于95X的、来源于QH株的HR1多肽(长度为21个氨基酸)，通过HPLC纯化和质谱鉴定(北京中科亚光生物科技有限公司)，用灭菌的PBS溶液(pH7.4)溶解，使其终浓度为2mM，于4。C保存，l周内使用。2)HR1多肽对三种流感病毒感染的抑制活性测定按照实施例3中的方法接种和培养MDCK细胞，将HR1多肽溶液用无血清DMEM培养基系列稀释为200、20、2^M，另外根据三种流感病毒的PFU效价，用无血清DMEM培养基将三种病毒分别稀释为160PFU/ml，与上述系列稀释的HR1多肽溶液等量混合，使多肽的终浓度为100、10、l一，病毒的终浓度为80PFU/ml，弃掉细胞中的培养基，每孔加入500^混合液，即每孔40PFU病毒，共分4组，其中1组为只加病毒、不加多肽的病毒对照；其余3组为系列稀释的多肽+病毒实验组，每组三个复孔。加入病毒悬液的细胞在37。C感染1h后，弃掉上清，将细胞先用PBS洗2次，再用无血清DMEM培养基洗1次，以去除没有吸附的病毒粒子。以下的噬斑实验步骤与噬斑效价测定实验中的步骤相同。结果判读标准为细胞对照组的细胞状态正常，没有死亡，无噬斑出现；病毒对照组出现大量噬斑为实验有效，计数实验组的噬斑数，按照下列公式计算各个浓度的噬斑抑制率抑制率(％)=(病毒对照组的噬斑数一实验组的噬斑数)/病毒对照组的噬斑数xl00。/。。计算出各个肽浓度的噬斑抑制率后，根据Karber法计算半数抑制浓度(IC5。)或特定浓度时的抑制百分率。每组实验重复三次。HR1多肽在不同浓度下对QH-WSN禽流感病毒噬斑形成的抑制效果如附图4所示，HR1多肽在不同浓度下对H1N1亚型的WSN和H3N2亚型的JX的噬斑形成的抑制效果与图4类似，故省略图片。统计结果表明HR1多肽对QH-WSN(禽流感H5N1亚型)病毒的IC50=15.8±2.3^M;对WSN(人流感H1N1亚型)病毒的IC5o二lU士3.8nM;对JX(人流感H3N2)病毒的IC50=16.4±2.5pM。以上结果说明1)QH株(H5N1亚型)禽流感病毒HA2蛋白来源的HR1多肽在微摩尔浓度可以有效地抑制禽流感病毒QH-WSN株对宿主细胞的感染；2)QH株禽流感病毒来源的HR1多肽不仅可以抑制同源病毒QH株禽流感(H5N1亚型)病毒对宿主细胞的感染，而且可以有效地抑制不同亚型人流感病毒(H1N1亚型和H3N2亚型)对宿主细胞的感染。实验同时用来源于SARS病毒膜蛋白S的一段多肽(氨基酸序列为KLPDDFMGCV)为无关肽段的对照，结果表明，该肽在终浓度为400时，对流感病毒的感染无任何抑制作用，说明禽流感病毒膜蛋白HA2来源的HR1多肽对禽流感和人流感病毒感染的抑制作用是特异性的。实施例5:变异的HR1多肽的化学合成及抑制活性的测定1)变异的HR1-1多肽的化学合成及抑制活性的测定为了检测变异的HR1多肽是否仍具有抑制活性，将HR1多肽序列(SEQIDN0:1)中的第7位氨基酸由A变为氨基酸I，命名为HR1-1(SEQIDN0:2)。HR1-1多肽的化学合成和溶解同实施例4中的1)。用与实施例4中的2)相同的方法测定多肽HR1-1对三种病毒的抑制活性，统计结果表明HR1-1对QH-WSN(禽流感H5N1亚型)病毒的ICso二32.7土6.5|iM;对WSN(人流感H1N1亚型)病毒的IC5()=29.3±5.7jaM;对JX(人流感H3N2)病毒的IC5o=38.2±7.8^M。2)变异的HRl-2多肽的化学合成及抑制活性的测定为了检测其它变异类型的HR1多肽是否仍具有抑制活性，在HR1多肽序列(SEQIDNO:l)中的第12位氨基酸后面插入四个疏水氨基酸A，命名为HR1-2(SEQIDNO:3)。HR1-2多肽的化学合成和溶解同实施例4中的l)。用与实施例4中的2)相同的方法测定多肽HR1-2对三种病毒的抑制活性，统计结果表明HR1-2对QH-WSN(禽流感H5N1亚型)病毒的1(^50=104.5±28.6一对WSN(人流感H1N1亚型)病毒的IC50=110.2±28.2)LiM;对JX(人流感H3N2)病毒的IC50=111.9±19。5nM。以上结果表明无论是点突变的多肽HR1-1还是带有插入突变的多肽HR1-2在微摩尔浓度可以有效地抑制禽流感病毒QH-WSN株和人流感病毒WSN和JX对宿主细胞的感染，因此，对多肽HR1进行合理的改造或变异后形成的多肽仍对流感病毒感染具有抑制效果。实施例6:禽流感病毒QH株HR2多肽的化学合成及抑制活性的测定1)QH株HR2多肽的化学合成根据序列表中SEQIDNO:4的氨基酸顺序，利用化学合成法合成纯度大于95%的来自QH株的HR2多肽(51个氨基酸)，同时将HR2多肽分成HR2A(20个氨基酸)、HR2B(23个氨基酸)和HR2C(16个氨基酸)3段互相重叠的多肽分别合成，其序列见下表。经过HPLC纯化和质谱鉴定，因上述多肽的疏水氨基酸含量较高，用DMEM培养基溶解为较低浓度的溶液，使其终浓度为0.4-1mM，于4。C保存，l周内使用。HR2A:RRIENLNKKMEDGFLDVWTY(SEQIDNO:21)HR2B:NAELLVLMENERTLDFHDSNVKN(SEQIDNO:22)HR2C:FHDSNVKNLYDKVRLQ(SEQIDNO:23)2)HR2多肽对流感病毒感染的抑制活性测定按照实施例4中的2)所述方法，检测HR2A、HR2B、HR2C和HR2对QH-WSN、WSN流感病毒和JX毒株在MDCK细胞上形成噬斑的抑制效果。由于上述多肽中含有大量疏水氨基酸，因此在DMEM培养基中溶解度较低，无法检测高浓度的多肽对流感病毒感染的抑制率，因此实验测定了上述四种多肽在特定浓度时对三种病毒的抑制率(见表1)。实验结果表明HR2A、HR2B、HR2C和HR2对流感病毒噬斑形成都有一定的抑制效果。表l:三种多肽对三种流感病毒的抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*:肽浓度为200pM，**:肽浓度为100nM，***:肽浓度为50^iM，一:没有检测。实施例7:多肽HR1分别和HR2A、HR2B及HR2C多肽的混合物对流感病毒的抑制活性的测定按照实施例4中的2)所述方法，检测多肽HR1分别和HR2A、HR2B、及HR2C多肽两两混合后对QH-WSN和WSN流感病毒在MDCK细胞上形成噬斑的抑制效果。结果表明HR1多肽分别和HR2A、HR2B及HR2C多肽混合后，对流感病毒(包括QH-WSN和WSN)噬斑形成都有一定的抑制效果(图5)，其半数抑制浓度(IC5Q)见表2，上述混合多肽对JX病毒的抑制效果与上述两种病毒类似。表2:多肽混合物对流感病毒的抑制效果(IC5Q，单位为JlM)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例8:稳定表达HR1或HR2融合蛋白的MDCK细胞对流感病毒噬斑形成的抑制效果1)pEGFP-HRl表达载体的构建为了检测表达在宿主细胞膜上的HR1能否干扰流感病毒膜蛋白HA2的构象变化，从而抑制流感病毒囊膜和细胞膜融合的发生，抑制流感病毒对宿主细胞的感染，我们构建了在细胞膜上表达HR1-EGFP融合蛋白的真核表达载体。具体步骤如下高致病性H5N1禽流感病毒QH株HR1的编码序列(见SEQIDNO:12)全长为63bp，为了能使HR1表达在膜上，需要在HR1蛋白的N端添加蛋白分泌信号肽(signalpeptide,SP)，在C端添加跨膜区(membrane-spanningdomain,MSD)。本发明中将HR1的编码序列融合在人神经生长因子的低亲和力受体蛋白(humanlow-affinitynervegrowthfactorrec印tor，LNGFR)的信号肽后面，且在HRl编码序列的C端融合了免疫球蛋白G(IgG)的铰链区(Hinge)和LNGFR的跨膜区。为方便克隆，在SP的N端添加了尺p"I酶切位点，在HRl的N端添加了5"mHI酶切位点，在HRl的C端添加了￡coRI酶切位点，在MSD的C端添加了為oI酶切位点。其中Kozak序列为真核表达增强元件。融合蛋白的结构示意图见图6。合成序列的示意图如下保护碱基-X/wI-Kozak-SP-5amHI-HRl-￡coRI-Hinge-MSD-屈oI-保护碱基编码上述蛋白的完整DNA序列见SEQIDNO:24，为了合成上述序列，合成了如下8条引物P7:GGGGTACCACCATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCG(SEQIDNO:25)CCGTCCATGG(SEQIDNO:26)P9:CTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCGGATCCAAAGAATCCACTCAAAAGGC(SEQIDNO:27)P10:CAATGATCGAGTTGACCTTATTGGTGACTCCATCTATTGCCTTTTGAGTGGAT(SEQIDNO:28)GGTTGTAAGCC(SEQIDNO:29)P12:GGATGGAGCAATAGACGGGGATGAGTGTACATATGCAAGGCTTACAACCACAAT(SEQIDNO:30)P13:GTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTGGTGGGCCTTGTGGCCTACATAGCC(SEQIDNO:31)P14:CCGCTCGAGCAGGATGCCCCTGTTCCACCTCTTGAAGGCTATGTAGGCCACA(SEQIDNO:32)利用以上8条引物互相配对，通过搭桥PCR扩增目的片段，PCR体系(50jil)如下H20，25.8^1;lOxpfti缓冲液，5^1;dNTPs，4^1;P7禾口P14(10pM)，各2P8禾口P13(10^M)，各1.6P9禾口P12(10^M)，各1.2^1;P10和P11(lOpM)，各0.8^1;pfUTaq酶，4|il。PCR反应程序为94。C变性4min，一个循环；94°C，30s，64°C，30s，72°C，30s，32个循环；最后72。C延伸10min。获得308bp(序列见SEQIDNO:24)的片段后，切胶回收纯化目的片段，用i^"I和屈oI双酶切目的片段，酶切体系为PCR产物15pi;10x缓冲液L:4pi;I和屈oI酶(TaKaRa):各2pl;H20，27W。37。C酶切8h以上后回收酶切片段，与用相同酶切的真核表达载体pcDNA4.0(Novagen)连接，连接反应体系如下回收的目的片段8回收的载体骨架片段4^1;10xT4连接酶缓冲液1.5(^1;T4连接酶1.5nl。16。C连接10h以上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后筛选阳性克隆，通过测序鉴定出序列完全正确的阳性克隆，命名为pcDNA-HRl。由于目的片段两端的酶切位点和真核表达载体pEGFP-Nl(ClontechLaboratories,Inc.)上的酶切位点不匹配，重新设计两端的酶切位点为^g/II和/^1，并合成如下引物PI5:CGAGATCTACCACCATGGGGGCAGGTG(SEQIDNO:33)P16:TGCACTGCAGCAGGATGCCCCTGTTCCAC(SEQIDNO:34)通过PCR获得两端带有Bg/II和户WI酶切位点的目的片段，所用的PCR体系为H20，16pi;lOxpfo缓冲液，2.5^1;dNTPs，2.5^1;P15和P16(10pM)，各l模板pcDNA-HRl，1pi;pfUTaq酶，1pl。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94。C，30s，64°C，30s，72°C，30s，32个循环，最后72。C延伸10min。切胶回收PCR产物后，用Sg/II和尸WI双酶切PCR产物(片段大小约300bp)，酶切体系为PCR产物15pi;10x缓冲液H:4|ul;Bg/II和尸Wl酶(TaKaRa):各2pi;H20，27)il。37°C酶切8h以上后回收酶切片段，与用相同酶切的pEGFP-Nl载体相连，经酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为pEGFP-HRl。将表达载体pEGFP-HRl用脂质体法转染MDCK细胞，加入G418抗生素(Gibco公司产品)进行筛选，利用绿色荧光蛋白报告基因挑选稳定克隆细胞，获得能在细胞表面稳定表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK细胞系(蛋白表达示意图见图7，筛选出的稳定克隆细胞见图8A，图中呈绿色的部分即为表达的HR1-EGFP融合蛋白，图中箭头所示仅为示例之一)。2)pEGFP-HR2表达载体的构建HR2编码序列长153bp，可通过PCR直接获得目的片段。合成引物如下P17:CGGGATCCAGGAGAATAGAAAATTTAAAC(SEQIDNO:35)Pl8:CGGAATTCCTGTAGTCGGACCTTGTCG(SEQIDNO:36)利用以上引物，以实施例1中克隆的HA基因(SEQIDNO:37)为模板，通过PCR获得HR2目的片段(153bp，其序列见SEQIDNO:13)。所用的PCR体系为H20，16^1;10xpfu缓冲液，2.5^1;dNTPs，2.5^11;P17和P18(10(iM)，各1nl;模板pGEM-HA,1pfUTaq酶，1|il。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C，30s，62°C，30s，72°C，30s，32个循环，最后72。C延伸10min。用B"mHI和￡coRI双酶切后，与用相同酶切的pcDNA-HRl(回收载体骨架)相连，经筛选获得pcDNA-HR2阳性克隆。利用P15和P16引物，以pcDNA-HR2为模板，通过PCR获得SP-HR2-MSD片段。所用的PCR体系为H20，16pi;lOxpfu缓冲液，2.5pi;dNTPs，2.5pi;P15和P16(10(iM)，各1)il;模板pcDNA-HR2，1^1;pftiTaq酶，1^1。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C，30s，64°C，30s，72°C，30s，32个循环，最后72。C延伸10min。SP-HR2-MSD片段编码序列见SEQIDNO:38。用5g/II和尸WI双酶切PCR产物，与用相同酶切的pEGFP-HRl(回收载体骨架)载体相连，经酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为pEGFP-HR2。将表达载体pEGFP-HR2用脂质体法转染MDCK细胞，加入G418抗生素进行筛选，利用绿色荧光蛋白报告基因挑选稳定克隆细胞，获得能稳定表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞系(蛋白表达示意图见图7，筛选出的稳定克隆细胞见图8B，图中呈绿色的部分即为表达的HR2-EGFP融合蛋白，图中箭头所示仅为示例之一)。对MDCK细胞、转染空载体pEGFP-Nl的MDCK细胞、表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK稳定克隆细胞(MDR1)和表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK稳定克隆细胞(MDR2)进行Western-Blotting检测，确认HR1-EGFP和HR2-EGFP融合蛋白在稳定克隆细胞中表达(见图8C)。3)MDCK稳定克隆细胞系对流感病毒噬斑形成的抑制效果将MDCK细胞、表达HR1-EGFP融合蛋白的MDCK稳定克隆细胞(MDR1)和表达HR2-EGFP融合蛋白的MDCK细胞(MDR2)接种入6孔板，用DMEM培养基培养24-36小时后长至100%满，弃掉上清，将细胞先用PBS洗2次，再用无血清DMEM培养基洗1次。将QH-WSN和WSN重组病毒分别用无血清DMEM培养基稀释为40PFU/ml，按lml/孔的量加入孔中，每组三个复孔，每次设两个6孔板重复。加入病毒悬液的细胞在37。C孵育lh后，弃掉上清，将细胞先用PBS洗2次，再用无血清DMEM培养基洗1次，以去除没有吸附的病毒粒子。以下噬斑实验步骤按照"实施例3"中的方法进行。待噬斑清晰后，计数噬斑，每孔计数至少两次，以避免人为误差。实验重复三次以上。按照下列公式计算稳定克隆细胞的噬斑抑制率抑制率(％)=(MDCK细胞组的噬斑数一表达HR1/2-EGFP融合蛋白细胞组的噬斑数)/MDCK细胞组的噬斑数x100。/。。结果表明表达HR1-EGFP或HR2-EGFP融合蛋白的稳定克隆细胞能有效地抑制流感病毒(包括人流感WSN和禽流感QH-WSN病毒)的感染，病毒在表达HR1或HR2融合蛋白的MDCK细胞上形成的噬斑数减少(见图9A和9B)，而且形成的噬斑大多数比较小(代表性结果见图10)。统计结果表明MDR1对QH-WSN病毒的噬斑抑制率为25±10.0%，MDR2对QH-WSN病毒的噬斑抑制率为57.8±8.0%;MDR1对WSN病毒的噬斑抑制率为11.0士5.2G/。，MDR2对QH-WSN病毒的噬斑抑制率为43.0士19.1G/0。以上结果说明，表达在细胞膜外的HR1和HR2对两种流感病毒都有不同程度的抑制作用，其中HR2的抑制效果更强，且两种融合蛋白对QH-WSN的抑制作用比对WSN的抑制作用强，说明HR1和HR2的抑制作用有一定的特异性，且对同源序列有一定的交叉抑制作用，说明该多肽药物可以广泛应用于抑制多种亚型的流感病毒。实施例9:重组表达的蛋白质HR12121对流感病毒噬斑形成的抑制效果1)原核表达载体pET-HR12121的构建表达载体构建过程中所用引物如下P19:GGAATTCCATATGTCAGGTGGAGGTACCAGGAGAATAGAAAAT(含AWeI和尺，I酶切位点，以下划线标示，下同)(SEQIDNO:39)P20:CGGGATCCCGAACTACCGCCCGAGCTTCCACCTGAACTGCCACCCTGTAGTCGGACCTT(含5amHI位点和linker2)(SEQIDNO:40)P21:CGGAATTCGGTGGCAGTTCAGGTGGAAGCTCGGGCGGTAGTTCGAGGAGAATAGAAAAT(含￡coRI位点和linked)(SEQIDNO:41)P22:CCGCTCGAGACCTCCGCTAGATCTCTGTAGTCGGACCTTGTC(含屈oI和^g/II位点)(SEQIDNO:42)P23:GGAATTCCATATGAAAGAATCCACTC(含7Vfifel位点)(SEQIDNO:43)P24:GGGGTACCTGAGCTGGACGAACTACCGCCC(含夂，I位点)(SEQIDNO:44)P25:GAAGATCTTCAAGCTCCGGTGGCAGTTCAG(含Bg/II位点)(SEQIDNO:45)P26:CCGCTCGAGTTTGTCAATGATCGAG(含iol位点)(SEQIDNO:46)表达载体构建过程如下以pcDNA-HR2为模板，以P19和P20为引物，PCR获得AWeI-HR2-Linker2-5amHI片段(长度为225bp)。所用的PCR体系为H20，16(il;lOxpfu缓冲液，2.5^1;dNTPs，2.5(il;P19和P20(10pM)，各1pi;模板pcDNA-HR2，lpl;pfoTaq酶，1pl。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s，32个循环，72°C，lOmin，1个循环。切胶回收目的片段后用A^I和B函HI双酶切，回收后连接于用同样酶切的pET-30a载体(Novagen)骨架中，获得pET-HR2-Linker2质粒，其上的相关酶切位点顺序为AWel-Xp"I-HR2-Linker2-万amHI。第二步以pcDNA-HR2为模板，以P21禾BP22为引物，PCR获得五coRI-Linkerl-HR2』g/IKY7oI片段(长度为221bp)。所用的PCR体系为H20，1610xpfu缓冲液，2.5pi;dNTPs，2.5^d;P21和P22(10pM),各1模板pcDNA-HR2，1pfUTaq酶，1pl。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C,30s，56°C，30s，72°C，30s，32个循环，72°C，10min，1个循环。切胶回收目的片段后用五coRI和^zoI双酶切，回收后连接于用同样酶切的pcDNA-HRl载体骨架中，获得pcDNA-HRl-Linkerl-HR2质粒，其上的相关酶切位点顺序为SamHI-HRl-五c。RI-Linkerl-HR2-Bg/IHoI。第三步用BawHI禾B屈oI双酶切质粒pcDNA-HRl-Linkerl-HR2，回收HR1-Linkerl-HR2片段(长度为281bp)，连入用同样酶切的pET-HR2-Linker2质粒骨架中，筛选获得pET-HR2-Linker2-HRl-Linker1-HR2质粒，命名为pET-HR212，其上的相关酶切位点顺序为I-HR2-Linker2-B"/wHI-HRl-五coRI-Linkerl-HR2-Sg/II-^72oI。第四步以质粒pET-HR212为模板，以P23和P24为引物，PCR获得A^el-HRl-Linkerl-A:戸I片段(长度为135bp)，所用的PCR体系为H20，16^1;10xpfoBuffer,2.5dNTPs，2.5^1;P23禾HP24(10(iM)，各1模板pET-HR212，1pfoTaq酶，1pl。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C，30s，56°C，30s，72°C，30s，32个循环，72。C，lOmin，1个循环。切胶回收目的片段后经A^el和^"I双酶切，连入经同样双酶切的pET-HR212载体骨架中，筛选获得pET-HRl-Linkerl-HR2-Linker2-HR1-Linkerl-HR2质粒，命名为pET-HR1212，其上的相关酶切位点顺序为iV^I-HRl-Linkerl-《/"I-HR2-Linker2-SamHI-HRl-EcoRI-Linkerl-HR2姻II-勘I。第五步以质粒pET-HR212为模板，以P25和P26为引物，PCR获得Bg/II-Linker2-HRl-屈oI片段(长度为131bp)，所用的PCR体系为H20，16^1;lOxpfoBuffer,2.5^1;dNTPs，2.5^1;P25禾口P26(10|iM)，各1nl;模板pET-HR212，1^d;pfUTaq酶，1(il。PCR反应程序为94°C，4min，1个循环，94°C，30s，56°C，30s，72°C，30s，32个循环，72°C，10min，1个循环。切胶回收目的片段后经Sg/II和；^oI双酶切，连入经同样双酶切的pET-HR1212载体骨架中，筛选获得pET-HRl-Linkerl-HR2-Linker2-HR1-Linkerl-HR2-Linker2-HRl质粒，经测序验证，序列完全正确(SEQIDNO:47)，命名为pET-HR12121，其上的相关序列顺序为I-HR1-LinkerI-HR2-Linker2-SawHI-HRl-五coRI-Linkerl-HR2-Sg/II-Linker2-HR1匿為I。2)多螺旋蛋白HR12121在大肠杆菌BL21中的重组表达和纯化将原核表达载体pET-HR12121转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，取单菌落接种于50mlLB培养基中，加入卡那霉素至终浓度为50吗/ml，37。C培养8h;然后按照1:100的比例转接入4L新鲜的LB培养基中，加入卡那霉素至终浓度为50吗/ml，37。C培养2-2.5h;至006()()达到0.35-0.4后，将菌液温度降至16°C，加入终浓度为0.8mM的诱导剂IPTG，在16°C培养12h，诱导目的蛋白的表达，同时小量诱导转化入BL21的空载体pET-30a，作为阴性对照。裂解菌体，进行SDS-PAGE检测表明诱导后，目的蛋白HR12121大量表达，约占菌体总蛋白量的15%;将菌体悬浮于裂解缓冲液(200mMTris，20mMNaCl)并超声破碎后(超声条件为超声4s，间隔12s，连续超声50次后，冷却10min重复4次)，于4。C离心15min(15000r/m)，在上清和沉淀中都检测到目的蛋白的表达(见图IIA)。将离心后的上清与Ni+beads于4匸结合2h以上，经裂解缓冲液冲洗至没有杂蛋白流出后，用含有200mM咪唑的裂解缓冲液洗脱目的蛋白，分3次收集洗脱液，每次收集15ml，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果(见图11A)。纯化后的目的蛋白纯度达到95%以上。经超滤管浓缩后，用0.22pM无菌滤膜过滤除菌，蛋白浓度为6.2mg/ml，摩尔浓度为250。经Western-Blotting检测，anti-His抗体可以特异地与大小约25kDa的蛋白结合，检测到的蛋白与目的蛋白的大小(24.8kDa)相符(见图11B)。3)多螺旋蛋白HR12121对流感病毒噬斑形成的抑制效果按照实施例4中2)所述方法，检测重组表达的HR12121蛋白对QH-WSN、WSN和JX三种流感病毒在MDCK细胞上形成噬斑的抑制效果。将重组蛋白进行系列稀释，使其终浓度分别为400、40、4pM，分别与等量病毒混合后做噬斑检测，代表性结果示于图12。统计结果表明HR12121对禽流感病毒QH-WSN噬斑形成的1<:5()为53.8±14.1^M，对人流感病毒WSN噬斑形成的IC5Q为53.3±22.6^M，对人流感病毒JX噬斑形成的ICso为28.0±16.3一。总结上述多个实施例的结果表明化学合成的HR1或HR2多肽、经过变异的HR1-1和HR1-2多肽、分段合成的HR2A、HR2B、HR2C多肽、混合的HR1多肽加其它多肽(如HR2A多肽、HR2B多肽或HR2C多肽)、重组表达的HR12121蛋白、表达在真核细胞膜上的HR1-EGFP融合蛋白和HR2-EGFP融合蛋白都对高致病性禽流感病毒(H5N1亚型)和人流感病毒(H1N1亚型和H3N2亚型)对宿主细胞的感染有抑制效果，因此本发明中的多肽和蛋白质可以作为抗流感病毒感染的特异性抑制剂。参考文献AbedY，BazM，BoivinG.ImpactofneuraminidasemutationsconferringinfluenzaresistancetoneuraminidaseinhibitorsintheNlandN2geneticbackgrounds.AntivirTher.2006，11(8):971-6.DasAT,BrummelkampTR,WesterhoutEM,VinkM,MadiredjoM,BernardsR,BerkhoutB.Humanimmunodeficiencyvimstype1escapesfromRNAinterference-mediatedinhibition.JVirol.2004，78(5):2601-5.deJongMD，TranTT，TruongHK,VoMH,SmithGJ,NguyenVC,BachVC，PhanTQ,DoQH,GuanY,PeirisJS,TranTH,FarrarJ.OseltamivirresistanceduringtreatmentofinfluenzaA(H5N1)infection.NEnglHMed.2005，353(25):2667-72.GaoY，SunL，DongJ，XuX,ShuY,ChenM，YinL,LiangZ，JinQ.RapididentificationofsmallinterferingRNAthatcaneffectivelyinhibitthereplicationofmultipleinfluenzaBvirusstrains.AntivirTher.2006,ll(4):431-8,GaushCR,HardWL,SmithTF.Characterizationofanestablishedlineofcaninekidneycells(MDCK).ProcSocExptlBiolMed.1966,122(3):931-5.GreenbergM,CammackN,SalgoM,SmileyL.HIVfbsionanditsinhibitioninantiretroviraltherapy.RevMedVirol.2004，14(5):321-37.JeffersonT，DemicheliV,RivettiD,JonesM,DiPietrantonjC,RivettiA.Antiviralsforinfluenzainhealthyadults:systematicreview.Lacent.2006,367(9507):303-13.KampsBS，HoffmannC,PreiserW.Influenzareport2006.2006,FlyPublisher,Paris,France.LenevaIA,GoloubevaO，FentonRJ,TisdaleM，WebsterRG.EfficacyofzanamiviragainstavianinfluenzaAvirusesthatpossessgenesencodingH5N1internalproteinsand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技术领域：
中抑制囊膜病毒感染的方法及其中所用的多肽和蛋白质药物。更特别地，本发明包括抑制流感病毒、尤其是高致病性禽流感病毒和人流感病毒(如H1N1亚型和H3N2亚型)的方法以及其中所涉及的多肽、蛋白质及编码该多肽和蛋白质的核酸和能表达该多肽和蛋白质的载体和细胞。文档编号C07K14/005GK101186637SQ20071030186公开日2008年5月28日申请日期2007年12月18日优先权日2007年11月14日发明者刘俊娥,波田,福高申请人:中国科学院微生物研究所