专利名称：：尼氟酸在制备慢性内脏痛的抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于医学领域，尤其涉及一种尼氟酸在制备慢性内脏痛的抑制性药物中的应用。
背景技术：
：慢性内脏痛在临床上极为普遍，而且常伴有情绪反应和防御反应，如果疼痛达到一定程度，还可以引起心率减慢、外周心血管舒张等效应，导致血压下降，甚至更严重后果。世界卫生组织于2000年认为“慢性疼痛是一类疾病”，从而将慢性疼痛归到了疾病之列。因此，慢性内脏痛不再仅仅是内脏疾病的伴随症状，其本身就是一种疾病。虽然炎症、肿瘤等是慢性内脏痛常见的致病因素，但临床上仍有相当比例的慢性内脏痛患者体检无明显的器质性变化，如功能性胃肠病(functionalgastrointestinaldiseases,FGIDs)。肠易激综合征(IrritableBowelSyndrome,IBS)就是其典型代表,也是消化内科病人求治的最常见原因之一。统计资料显示，IBS占临床消化门诊病例的三分之一，其主要临床特征是反复发作的慢性腹痛及排便习惯的改变，病程迁延漫长，但缺乏异常体征，且病因不明，给临床治疗带来很大的麻烦，严重影响病人的生活。在美国仅IBS—项医疗费用每年消耗超过80亿美元。直到2000年，Al-Chaer等才首次报道了IBS样慢性内脏痛敏大鼠模型。该模型表现为新生期大鼠遭受疼痛或炎症刺激，成年后出现慢性内脏痛敏，伴有腹泻、便秘等症状，而且没有病理形态学改变的证据。这一模型的出现为IBS研究提供了可靠的工具。以往IBS的研究主要集中在消化道运动功能紊乱现象，近年来内脏痛觉高敏感日益受到关注，被认为可能是产生IBS症状(腹痛和肠道运动异常等)的主要原因。所谓内脏痛觉高敏感是指引起内脏疼痛的阈值降低，内脏对生理性刺激产生不适感或对伤害性刺激反应强烈的现象。对于内脏痛觉高敏感发生机制目前存在四种假设:①胃肠道传入神经的敏感化(外周敏感化)脊髓背侧角神经元的敏感化(中枢敏感化)改变对脊髓伤害性神经元下行的易化或抑制的影响(可能受心理过程影响)；④由于认知和情感的偏倚(警觉过度)将非伤害性感觉误认为伤害性感觉，是精神心理障碍的结果。超极化环核苷酸门控阳离子(hyperpolarization-activatedcyclicnucleotidegatedcation,HCN)通道由Noma和Irisawa首次报道。他们发现在兔子窦房结细胞上存在着一个超极化激活的内向电流，并且被Brown等命名为If(为“funny”电流，因为它具有不寻常的激活特性)。后来的研究进一步发现这一电流也存在其他组织中，称之为Ih(超极化激活电流)，也被称为I,(为“queer”电流)。而其分子基础在很长时间内未能得到证明。直到1997年，SantOT0等才从大鼠大脑中克隆出一个候选离子通道，并且证明为脑环核苷酸门控通道(mBCNG)。这一通道具有共同特征，长时程的起搏功能，并且属于一个4成员家族。此后两年陆续克隆出多种超极化激活环核苷酸(HCN)通道，其中哺乳动物存在着四种亚型，分别称之为HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。HCN通道广泛地分布于全身，在可兴奋和不可兴奋的组织中都存在。HCN通道主要分布在心脏，包括窦房结和房室结以及心肌里，也分布于整个大脑和神经组织。已经证实，外周敏感化和中枢敏感化等机制参与导致组织损伤和炎症情况下的内脏痛觉高敏感。脊髓背角伤害性突触传递的增强是中枢敏化的一部分，也是神经病理疼痛行为的另一个重要诱因。伤害性中心末端的兴奋性神经递质如P物质和谷氨酸释放增加，对神经病理疼痛有很大作用。研究表明，HCN通道在脊髓背角的伤害性中心末端和机械敏感性中心末端有表达。此外，HCN2阳性终端也含有SP和谷氨酸。它们构成兴奋性中间神经元与突触连接。如此分布有助于HCN通道参与突触前神经递质释放的调节以及随后的脊髓背角的中间神经元兴奋性调节。因此我们有理由猜测脊髓HCN可能参与了脊髓背角的中枢敏化。一般而言，在神经系统受伤后，伤害性传导途径出现兴奋性过度，这会扩大正常性或有害性刺激，诱发慢性、异常性疼痛反应。离子通道是神经兴奋性的主要决定因素，而且包含广泛，包括Na+通道，K+通道和Ca2+通道等非常有趣的离子通道。最近研究表明，HCN通道在神经病理性疼痛起作用，是个有价值的靶点。用各种各样的动物模型进行的一系列研究陆续展示了Ih对神经病理性疼痛的作用。将ZD7288按一定形式给以神经病理痛模型，腹内注射，或者鞘内注射，或者对损伤的坐骨神经进行外周神经阻滞，或者跖肌内注射入受伤后掌，或者受伤的DRG的局部用药，结果都观察到显著的镇痛效果而无运动功能能障碍。此夕卜，几种临床使用的止痛药，如洛哌丁胺(loperamide),异丙酹和可待因等起的镇痛效果，也是通过抑制Ih发挥作用。但是，目前对HCN通道在疼痛中作用的研究主要集中在神经病理痛模型。鉴于内脏痛的病理生理过程有别于躯体痛，因此，本课题组对DRG和脊髓背角的HCN通道是否参与内脏痛敏的形成进行了初步的探讨。本实验室前期研究，采用急性内脏痛模型和IBS模型，通过腹壁撤退反射评分、痛阈测定和腹外斜肌放电测量等三项指标来评估大鼠对结直肠扩张刺激的反应程度，结果显示无论是急性内脏痛模型，还是IBS模型，ZD7288鞘内给药均能剂量依赖性降低大鼠腹壁撤退反射评分和腹外斜肌放电幅值，同时升高痛阈。该结果提示，阻断脊髓水平的HCN通道对急、慢性内脏痛大鼠可能有镇痛作用；同时HCN通道免疫组织化学研究也显示，在IBS模型大鼠脊髓的腰骶段、胸腰段和背根神经节等组织中，HCN2的表达显著强于正常组大鼠。免疫反应性表明，HCN不仅在脊髓中有分布，在大脑组织中也有分布。HCN2在大脑中广泛分布，而HCNl主要位于皮质，集中分布于新皮质、海马、上丘和小脑。双倍免疫荧光法阐释HCNl和HCN2在海马和新皮质树突远端的锥体细胞中都有表达。众所皆知，新生大鼠的神经系统特别脆弱，具有可塑性，而我们前期的研究也发现脊髓部位存在着HCN表达的可塑性改变。有鉴于此，我们推测IBS模型大鼠的大脑组织中，可能也存在着HCN表达的可塑性改变。目前HCN通道阻断剂在临床已经开始使用，包括心动过缓药。Procolan(类似于伊伐布雷定(ivabradine)),—种特异性Ih阻断剂，对HCN通道的四个亚型没有药理学选择性，在欧洲已经用于稳定型心绞痛的对症治疗，但是由于目前缺乏HCN通道亚型特异性阻断剂，其在临床治疗中出现了一系列的副作用。因此在研究HCN通道在疼痛中时，探知究竟HCN哪一亚型在起作用，或者哪一亚型的作用更大，以及开发出更具有亚型特异性的阻断齐U，意义非常重大。最新研究发现尼氟酸是HCN2亚型通道的特异性阻断剂。尼氟酸是一种非甾体抗炎镇痛药，以往多用于风湿性疼痛的治疗，有研究表明尼氟酸能作用于S4电压敏感区域的外区从而改变HCN2起搏通道的门控作用。鉴于本实验室的前期研究结果，本课题考虑在IBS模型大鼠幼年期腹腔给以尼氟酸，观察HCN2通道亚型在慢性内脏痛的作用。本研究应用IBS模型，在IBS模型幼鼠早期给予超极化激活环核苷酸门控阳离子通道亚型2(HCN2)的特异性阻断剂尼氟酸进行干预，通过行为学(腹壁撤退反射评分和痛阈测定)，电生理学(腹外斜肌放电幅值)等方法测定其成年后内脏痛敏感性的变化，并结合免疫组织化学实验方法阐明HCN2通道在慢性内脏痛中的作用及其机制，以期为内脏痛的药物治疗提供新的作用靶点。
发明内容本发明的目的在于提供一种尼氟酸在制备慢性内脏痛的抑制性药物中的应用，即尼氟酸作为HCN2亚型通道的特异性阻断剂的应用，可以作为治疗慢性内脏痛的药物。本发明的目的是这样实现的，所述的尼氟酸是一种非甾体抗炎镇痛药，能作为HCN2亚型通道的特异性阻断剂。所述的尼氟酸是一种非留体抗炎镇痛药，在制备治疗慢性内脏痛药物中的应用。本发明具有如下的优点:所述的尼氟酸是一种非留体抗炎镇痛药，以往多用于风湿性疼痛的治疗。该研究表明尼氟酸能作用于S4电压敏感区域的外区从而改变HCN2起搏通道的门控。本课题的研究也表明，在IBS模型大鼠的生长发育阶段给予HCN2通道的特异性阻断剂尼氟酸，结果发现尼氟酸能减轻IBS模型大鼠成年时的内脏敏化状态，该结果从另一个角度提示了HCN2可能参与慢性内脏痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特异性阻断剂)能剂量依赖性抑制IBS大鼠的内脏痛反应，并提高其痛反应阈，提示尼氟酸早期应用可有效阻断大鼠慢性内脏痛的形成，该通道亚型有望成为慢性内脏痛药物治疗的新靶点。图1为本发明的实验一的技术路线图。图2为本发明实验二的技术路线图。图3为腹壁撤退反射(AWR)评分图。图4为正常和IBS模型大鼠腹壁撤退反射评分图。图中的林<0.01，vscontrolrats。图5为正常和IBS模型大鼠痛阈图，图中的**:/*<0.01,vscontrolrats。图6为正常和IBS模型组大鼠腹外斜肌放电幅值图；图中的*，林<0.05,P<0.01,vscontrolrats。图7为对照大鼠结肠HE染色(X200倍)图。图8为IBS模型大鼠结肠HE染色(X200倍)图。图9为HCNl在正常对照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表达(X400倍)图，图中可见HCNl在正常对照大鼠和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上，而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图10为HCN2在正常对照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表达(X400倍)图；图中可见HCN2在正常对照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上,而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图11为HCNl在正常对照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表达(X400倍)图；图中可见HCNl在正常对照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上，而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图12为HCN2在正常对照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表达(X400倍)图；图中可见HCN2在正常对照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上，而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图13为HCNl在对照和IBS模型大鼠大脑中缝核的表达(X400倍)图；图中可见HCNl在正常对照大鼠和IBS模型大鼠中缝核中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上,而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图14为HCN2在对照和IBS模型大鼠大脑中缝核的表达(X400倍)图；图中可见HCN2在正常对照大鼠和IBS模型大鼠中缝核中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上,而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图15为HCNl在正常对照和IBS模型大鼠大脑室旁核的表达(X400倍)图；图中可见HCNl在正常对照大鼠和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上,而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图16为HCN2在正常对照和IBS模型大鼠大脑中室旁核的表达(X400倍)图；图中可见HCN2在正常对照和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上,而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图17为HCNl在正常对照和IBS模型大鼠大脑海马的表达(X400倍)图；图中可见HCNl在正常对照和IBS模型大鼠海马中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上，而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图18为HCN2在正常对照和IBS模型大鼠大脑海马的表达(X400倍)图；图中可见HCN2在正常对照和IBS模型大鼠海马中均有分布，主要表达在细胞膜和细胞质上，而在IBS模型大鼠上表达显著增强。图19为尼氟酸对IBS模型大鼠痛阈的作用图；图中的*，**:P<0.05,P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO。图20为尼氟酸对慢性内脏痛大鼠腹外斜肌放电幅值的抑制作用图；图中的**-.P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO:P<0.01，vsIBSmodelratswithNFAlmg;#:P<0.01，vsIBSmodelratswithNFA5mg。图21为新生期CRD建立大鼠内脏痛觉高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在压力值为20mmHg下腹外斜肌放电的交互作用图。图22为新生期CRD建立大鼠内脏痛觉高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在压力值为40mmHg下腹外斜肌放电的交互作用图。图23为新生期CRD建立大鼠内脏痛觉高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在压力值为60mmHg下腹外斜肌放电的交互作用图。图24为新生期CRD建立大鼠内脏痛觉高敏感性IBS模型和注射尼氟酸在压力值为80mmHg下腹外斜肌放电的交互作用图。具体实施例方式下面结合实例对本发明进行详细说明:材料与方法1、材料1.1实验动物及其分组清洁级新生SD大鼠6窝，每窝10只左右，雌雄各半(购自上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物许可证号:SCXK(沪)2007-0005]。新生大鼠出生后的当天定为第ld，在生后第8天进行分组。将32只SD新生大鼠随机分为Al和A2两组，每组16只。Al组为新生期(生后814d)结直肠给予结直肠扩张刺激，A2组为新生期未进行结直肠扩张刺激(新生乳鼠刺激过程和实验操作均在光线下进行)；然后再将A组随机分为AlBl和A1B2两组，每组8只，同理将B组随机分为A2B1和A2B2两组，每组8只。在新生大鼠出生后2123d，连续三天给以AlBl和A2B1组大鼠腹腔注射尼氟酸，同时给以A1B2和A2B2组腹腔注射二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMS0)作溶剂对照。具体分组结果如下:AlBl组:新生期Cl，2123d腹腔注射尼氟酸；A1B2组:新生期Cl，2123d腹腔注射DMSO；A2B1组:新生期未行Cl，2123d腹腔注射尼氟酸；A2B2组:新生期未行Cl，2123d腹腔注射DMS0。随后各组大鼠继续鼠乳喂养至24d，第25d断奶，第30d雌雄分笼饲养。采用混合配方饲料(由福建医科大学实验动物中心提供)喂养，自由进食饮水，每日更换饮水、饮料，保持大鼠生活环境通风及清洁卫生；观察进食、饮水、活动、大小便情况，确保大鼠健康及避开各种伤害性刺激。大鼠正常饲养到第8w，体重达250g左右开始进行各项实验。药品和试剂碘酒，75%酒精，8%异戊巴比妥钠，石蜡油，尼氟酸(sigma公司)，DMS0，生理盐水，乙醚，4%多聚甲醛，肝素，10%中性福尔马林，兔抗HCN1、HCN2多克隆抗体(abeam公司)，UltraSensitiveSP试剂盒(兔，MAIXIN-BIO),DAB显色试剂盒(MAIXIN-B10)。仪器与材料人血管重建气囊20mmX2.5mm(美国)，PE10(BectonDickinson),RM6240多道生理记录仪(成都仪器厂)，针形电极(成都仪器厂)，鱼跃牌台式血压计(上海跃进医疗器械厂)，自制乳胶气囊，自制有机玻璃箱，秒表(JOEREX)，电热恒温水浴箱(成都仪器厂)，BP221电子天平(德国Sartorius)，HJ-2双头磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)，倒置显微镜，Olympus显微摄影系统(日本)；DHG_9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)JK-5型生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2245型石蜡切片机(德国Leica);数码医学图像分析系统MoticMed6.0(北京麦克奥迪公司)。方法2.1实验一和实验二的技术路线图见图1和图2。内脏痛IBS模型的建立2.2.1慢性内脏痛觉敏化IBS模型的建立参照林国威报道的方法建立幼鼠内脏痛高敏感IBS模型。新生鼠在出生后814d，每天下午接受一次结肠刺激(colonirritation,Cl)。Cl采用20mmX2.5mm人血管重建气囊，将气囊全部插入幼鼠结直肠中，加压扩张产生60mmHg压力(血压计测定)，压力维持Imin后排出空气再抽出气囊；随后，常规饲养至8周龄。对照组除了不予Cl外，其他过程相同。所有实验操作时间限定在Ih内完成。期间幼鼠继续与母鼠同笼，鼠乳喂养；实验前称体重并记录。大鼠8周后再进行内脏痛敏感性测定。腹腔给药注射时，右手持注射器，左手的小指和无名指抓住新生鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使新生鼠的头部向下，从新生鼠腹部的右下象限进针，每次注射量0.1ml0在出生后2123d，AlBl与A2B1组大鼠腹腔注射尼氟酸5mg，A1B2与A2B2组大鼠腹腔注射DMSO。内脏高敏感性的评定2.3.1腹壁撤退反射(abdominalwithdrawlreflex,AffR)评分成年大鼠用的结直肠扩张球囊(以下简称球囊)由输液导管插入7号乳胶指套(中指或无名指)制成，长度约45cm，导管与指套连接处用丝线双重结扎，确保密封不漏气。球囊在实验前应充气过夜，使其具有较好的顺应性。CRD时球囊被插入末端结扎线距肛门括约肌大约Icm处，用胶带轻轻将外端导管固定在大鼠尾巴上，以防球囊在实验过程中滑出。导管通过三通管一端与血压计相连，一端连接注射器。大鼠在实验前18h禁食不禁水，用乙醚或氟烷麻醉后，将未充气的球囊涂石蜡油后插入结直肠内，并按上述方法固定。将大鼠放置在20cmX6cmX8cm的有机玻璃箱内观察,约30min大鼠完全适应后开始实验。结直肠扩张(colorectaldistension，CRD)分别采用20、40、60、80mmHg四个压力，每次扩张持续20S，刺激间隔4min，取3次评分之均值。为了能客观比较对照和ClIBS模型大鼠的各项指标，检测时采用单盲法，即对实验操作者隐瞒实验动物的类型。评分标准为:O分，无明显行为变化；1分，大鼠身体不动或仅有简单的头部运动；2分，腹部肌肉开始收缩；3分，下腹壁抬离箱底或明显收缩变平；4分，腹壁拱起或伴身体、骨盆躬起(图3)。痛阈测定:AWR方法测定痛反应阈:球囊放置等过程同前，通过注射器持续、缓慢加压，每IOmmHg为一压力梯度，每个压力停留3min，间隔lmin，以肉眼观察出现明显的下腹壁抬离箱底或明显收缩变平(即AWR3分)时的最小压力值为痛反应阈。扩张压力范围在1080mmHg之间；每只大鼠重复三次，取平均值。腹外斜肌放电(ThespikesofEOMA))方法按前述方法置入乳胶气囊后，用RM6240BD多道生理信号采集处理系统记录在各CRD压力下大鼠腹外斜肌的放电活动。在OmmHg压力下的腹外斜肌放电为基础放电，为消除基础放电不同对结果的影响，将每只大鼠在各CRD压力下腹外斜肌放电幅值减去其基础放电幅值，其差值代表各个不同CRD压力下腹外斜肌放电幅值。结直肠局部组织病理变化的观测旨在判断慢性内脏高敏IBS模型的结直肠局部组织病理变化特点。大鼠深度麻醉后，用10%多聚甲醛经左心室插管灌注半小时，至四肢发白并强硬后取出乙状结肠与直肠，投入20%多聚甲醛中后固定46h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。常规石蜡切片(5ym)，60°C烘烤Ih后，二甲苯脱蜡，由高到低梯度酒精至水洗，苏木素、伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。切片由福建医科大学病理科专家诊断，观察指标为结直肠局部组织有无损伤和炎症等异常改变。参照以下标准进行分级:0，在固有层内未见中性粒细胞浸润，无间质水肿；1+，在固有层内有少量的中性粒细胞浸润，少或无间质水肿；2+，在固有层内可见中等数量的中性粒细胞浸润，间质水肿明显；3+，大量的中性粒细胞弥散浸润，间质水肿严重。免疫组织化学法脊髓，大脑(中缝核、室旁核、海马)取材、固定大鼠乙醚麻醉后，经左心室灌注固定，经升主动脉快速灌注4°C生理盐水250ml，继之灌注4°C4%多聚甲醛(用PBS配制，pH=7.4)500ml，持续lh。然后打开椎板，暴露脊髓，找到并取出脊髓(胸腰段和腰骶段)和大脑(中缝核、室旁核、海马)。10%中性福尔马林浸泡固定过夜，石蜡包埋后，连续冠状切片，片厚4um，收集切片于0.01mmol/L的PBS中，置于多聚赖氨酸处理的载玻片上，进行免疫组化实验检测HCN1、HCN2的表达。检测HCNl、HCN2表达的免疫组织化学方法步骤①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。②柠檬酸高压修复(L5分钟)。③室温冷却后自来水冲洗，再用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。④每张切片加I滴3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。⑤除去PBS液，每张切片加I滴正常非免疫山羊血清，室温下孵育10分钟。⑥直接甩去血清，每张切片加I滴多克隆一抗(1:900)，4°C下孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3分钟。⑦除去PBS液，每张切片加I滴生物素标记二抗工作液,室温下孵育60min。PBS冲洗3次，每次3分钟。⑧除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-5分钟。⑨自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。统计学处理:实验结果采用>±s表示。在OmmHg压力下的腹外斜肌放电为基础放电,为消除基础放电不同对结果的影响，将每只幼鼠在20、40、60、80mmHgCRD压力下腹外斜肌放电幅值减去其基础放电幅值，其差值代表各个不同CRD压力下腹外斜肌放电幅值。AffR评分及腹外斜肌放电数据采用重复测量方差分析，痛阈采用单因素方差分析。选取尼氟酸给药剂量5mg组，用2X2析因分析统计方法进行统计分析。统计分析采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，以/7<0.05差异具有统计学意义。图像处理采用MoticMed6.0数码彩色医学图像分析系统，测定上述免疫组化染色的脊髓与大脑切片。每张切片随机选取3个高倍镜视野(400倍)，经彩色图像分析仪，读取并输入计算机，由系统进行分析，测得每个视野中的平均累积光密度，3个视野测得的平均值即为该例的平均累积光密度。平均累积光密度越大，反映组织染色越强。平均累积光密度值用采用单因素方差分析，统计分析采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，以P<0.05差异具有统计学意义。结果I慢性内脏痛大鼠IBS模型的评价1.1腹壁撤退反射在2060mmHg结直肠扩张压力下，IBS模型大鼠AWR评分显著高于对照大鼠，而在SOmmHg结直肠扩张压力下两组大鼠评分差异无统计学意义(见图4)。腹壁撤退反射测定大鼠的痛阈与正常大鼠相比，IBS模型大鼠的痛阈显著降低0°<0.01)(见图5)。腹外斜肌放电在20SOmmHg各个结直肠扩张压力下，IBS模型大鼠腹外斜肌放电均明显高于对照大鼠(见图6)。结肠组织病理改变观察比较对照和IBS模型大鼠远端降结肠局部组织学的病理改变，肉眼均未见明显的肠腔扩张以及与周围组织粘连等病理改变。降结肠HE染色光镜下均未见明显组织损伤，无中性粒细胞浸润，间质无明显水肿(见图7，8)。通道与慢性内脏高敏关系的形态学研究2.1HCNUHCN2在大鼠胸腰段脊髓的表达观察比较HCN1、HCN2在正常与IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表达，结果显示，HCNl和HCN2均主要在神经元细胞和神经胶质细胞的细胞膜和细胞浆上表达(见图9，10)。图像分析结果表明，IBS模型大鼠胸腰段脊髓HCNl和HCN2平均积分光密度值(integrateopticaldensity,10D)均显著高于正常大鼠,差异有统计学意义(见表I,表2)。表IHCNl在大鼠胸腰段脊髓的,达_权利要求1.尼氟酸在制备HCN2亚型通道的特异性阻断剂中的应用。2.尼氟酸在制备治疗慢性内脏痛的药物中的应用。全文摘要本发明公开一种尼氟酸在制备慢性内脏痛的抑制药物中的应用，尼氟酸在制备HCN2亚型通道的特异性阻断剂中的应用，以及尼氟酸在制备治疗慢性内脏痛药物中的应用。该研究表明尼氟酸能作用于S4电压敏感区域的外区从而改变HCN2起搏通道的门控。本课题的研究也表明，在IBS模型大鼠的生长发育阶段给予HCN2通道的特异性阻断剂尼氟酸，结果发现尼氟酸能减轻IBS模型大鼠成年时的内脏敏化状态，该结果从另一个角度提示了HCN2可能参与慢性内脏痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特异性阻断剂)能剂量依赖性抑制IBS大鼠的内脏痛反应，并提高其痛反应阈，提示尼氟酸有望成为治疗慢性内脏痛药物。文档编号A61K31/455GK103070866SQ20121048907公开日2013年5月1日申请日期2012年11月27日优先权日2012年11月27日发明者林春,卢大力,唐影,陈瑜申请人:福建医科大学