专利名称：抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途， 属于生物医药技术领域。
背景技术：
甲胎蛋白(alpha_fetoprotein,AFP)是胚胎期由肝脏、卵黄囊产生的一种糖蛋白， 出生后急剧降低。当发生肝脏肿瘤、某些胃肠道肿瘤和某些生殖系统肿瘤时，血清AFP水平又复升高。目前AFP作为一种公认的肿瘤标志物在肿瘤的诊断中具有重要作用。大约有 80%的肝癌患者血清AFP升高，是诊断原发性肝癌的常用检查项目之一。有约50%的生殖细胞肿瘤出现AFP阳性，在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。其中AFP阳性胃癌发病率占胃癌的5. 1%_15%，这种肿瘤恶性程度高，具有细胞形态学像肝癌，易发生肝转移和早期淋巴道转移，侵袭性强，预后差的特点。
近年来研究发现AFP在肿瘤的发生发展中具有重要作用(I)免疫调节活性AFP 能抑制NK细胞活性及T淋巴细胞依赖的抗原反应，诱导抑制性T细胞的产生，下调单核细胞表面的MHC-1I类分子，及抑制肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的细胞毒性作用；AFP还能降低肝癌细胞死亡受体的表达，使之逃避淋巴细胞的攻击。(2)促进肿瘤细胞增殖实验证明， AFP对人肝癌HepG2细胞、H22细胞和Ehrlich腹水癌细胞及宫颈癌HeLa细胞有直接促增殖作用，用AFP (20mg/L)刺激人肝癌细胞Bel 7402发现c_fos，c-jun和N_ras的mRNA量升高，说明AFP能刺激一些与细胞增殖和分化有关的癌基因表达，从而促进肿瘤细胞增殖。 提示AFP可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌性蛋白质。(3)参与肿瘤细胞凋亡过程有研究报道AFP通过与AFP受体结合从而阻止肿瘤细胞凋亡。另有研究认为AFP在肿瘤细胞中能通过活化caspase3诱导凋亡。
AFP作为一种胚胎时期或病理状态合成的蛋白质，它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛过程，在肿瘤发生发展过程中不仅是一种伴随现象，而且是促进肿瘤细胞生长的内源性物质。这一作用可以被AFP单克隆抗体阻断。抑制AFP基因表达的药物和方法将会影响肿瘤细胞的增殖，从而达到抗肿瘤治疗的目的。因此，阻断AFP基因的表达及其生物学活性同时结合其他的治疗手段有可能是一个治疗与AFP相关肿瘤的一个新的策略。
本发明人在AFP阳性胃癌中的研究证实，利用RNAi技术抑制AFP表达对AFP 阳性胃癌细胞FU97具有增殖抑制及凋亡诱导作用，同时可能通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成在肝癌中，研究报道AFP的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA) 可诱导人肝癌细胞系Huh7的生长阻滞(参见Yang X, Zhang Y, Zhang L, Zhang L, Mao J. Silencingalpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in humanhepatocellular cancer cell. Cancer Lett.2008 Nov 28;271 (2):281-93. Epub 2008 Jul26.)。本发明课题组的研究也发现AFP-siRNA可抑制肝癌细胞SMMC-7721 的增殖(参见 WangYS，Ma XL, Qi TGj Liu XDj Meng YSj Guan GJ. Do wnregulation ofalpha-fetoprotein siRNAinhibits proliferation of SMMC-7721 cells. World J Gastroenterol. 2005 0ctl4;11 (38):6053-5.)。
信号转导和转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一种存在于细胞楽；与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。STAT3在多种肿瘤细胞中被激活，并持续处于高活性状态。它具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进，已被公认为一种肿瘤相关基因。大量研究发现，利用反义核酸、STAT3的显性负性异构体以及RNAi技术阻断STAT3的活性及表达可使肿瘤细胞生长受到抑制。
RNA干扰((RNA interference, RNAi)是近年来发现和发展起来的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。RNAi技术具有高效性、特异性、操作相对简便、效果稳定、一次可研究多个基因等多方面的优势。目前，在某些病毒性疾病的治疗研究中已取得了一定的进展，在基因功能研究和基因治疗方面也已显示出巨大的应用前景。
双靶标RNAi是将2个shRNA装入同一质粒的不同RNA聚合酶III启动子 (H1+U6)-终止信号结构单元。每个shRNA独立有效转录。不同的启动子避免使用单一启动子因序列相同可能引发的重组，2个shRNA分别作用于不同目标基因，增强对靶细胞的作用效果。
目前尚无关于利用RNAi技术将干扰STAT3和AFP基因的高效siRNA串联在一个 shRNA表达质粒上、达到同时高效抑制二种在肿瘤中异常高表达的基因的双靶标siRNA真核表达质粒及其应用的报道。发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途。
发明概述本发明以利用RNA干涉技术为主，针对STAT3和AFP基因的有效靶序列，构建了能在哺乳动物细胞中同时表达STAT3和AFPsiRNA的表达质粒 pGenesill. 5-STAT3-AFP，以下简称pGl. 5-SA。其示意图谱见
图1，能高效、特异性地抑制 AFP和STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的基因药物。
术语说明
STAT3 :英文 signal transducer and activator of transcription 3 的简写，信号转导与转录激活因子3。
AFP,英文 alpha-fetoprotein 的简写，甲胎蛋白。
siRNA:英文 small interference RNA 的简写，小干扰 RNA
shRNA:英文 short hairpin RNA 的缩写，短发夹 RNA。
shRNA包括两个短的`反向重复序列(一个是正向序列，另一个是反向互补序列，两者可以结合成为双链，其中的正向序列为干涉靶序列)，中间由一茎环(loop)序列分隔，组成发夹结构。所谓反向重复序列是指在同一多核苷酸链内下游存在着与上游某一段序列的互补序列反向的序列。
RT-PCR:英文reverse transcription Polymerase Chain Reaction 的缩写，反转录聚合酶链式反应。
western blotting :western 蛋白印迹法。
mRNA:英文messenger RNA的缩写,信使核糖核酸。
cDNA:英文complementary DNA的缩写,互补脱氧核糖核酸。
DEPC :英文diethypyrocarbonate的缩写,焦碳酸二乙酯,是一种RNA酶抑制剂。
MTT :英文 3_ (4，5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -3, 5-d1-phenytetrazoliumromi de的缩写，四甲基偶氮唑盐，常用做比色法测定细胞活力的试剂。
本发明的技术方案如下
抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以 pGenesill. 5为载体，利用双靶标siRNA技术，在一个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和 AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用，是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质；
所述的shRNA序列的两个反向重复序列分别是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互补序列；
所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’， 起始于 956 位 ,② 5’ -CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于 508 位；
所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为
5’-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’ ，5’-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3’ ；
STAT3、AFP 基因 shRNA 表达框的 loop 序列分别为5’ -GGCCGGCGCGC-3’， 5，-CGCGCGCGGGCC-3，；
由以下方法制得
(I) STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建
a.第一轮PCR 以包含Hl和U6启动子的质粒XM-2P为模板，设计PCR引物，在3’ 引入PCR模板质粒XM-2P的部分序列，用于扩增Hl和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列；
上游引物P1-FW:5 ’ -GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3'
下游引物P卜RV : 5 ’ -CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC-3’ ；
b.第二轮PCR :以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”及限制性内切酶 HindIII (AAGCTT)、BamHI (GGATCC)，为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”
上游引物P2-FW: 5，-AGTAAGCTTAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3，，
下游引物P2-RV:5，-ATGGATCCAAAAACAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’ ；
c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为HindII1- -shRNAl-Hl 启动子-U6 启动子-shRNA2_BamHI。
(2)将步骤(I)所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体 pGenesill. 5同时用Hindlll、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5 α大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA ;得到抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒 pGenesill. 5-STAT3-AFP ；
(3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶 HindIIKBamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesill. 5质粒中。
本发明的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒在制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物中的应用。
为了对STAT3、AFP双siRNA表达质粒对STAT3和AFP基因的抑制效果及对AFP阳性肿瘤细胞的作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA), 反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription Polymerase Chain Reaction, RT— PCR)法测定对STAT3和AFP信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)表达水平的抑制作用， 蛋白印迹法(western blotting)测定对STAT3和AFP蛋白表达水平的影响。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、细胞免疫化学法检测Ki67分析转染STAT3、AFP双siRNA表达质粒后对 AFP阳性肿瘤细胞生长增殖的影响。
本发明的针对STAT3和AFP基因构建的双siRNA表达质粒是可用于高表达STAT3 的AFP阳性肿瘤治疗物质，其在体外培养的AFP阳性肿瘤细胞内可有效抑制STAT3和AFP 基因的表达，对肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用，可进一步在实验动物体内进行基因治疗研究。
本发明的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒的制备方法和生物学活性鉴定主要包括如下内容
一、质粒的制备，包括双RNA聚合酶III启动子(H1+U6)的引入，双基因shRNA表达框的设计与构建，将上述构建的双shRNA表达框定向克隆入载体pGenesill. 5，转化宿主菌、扩增及质粒DNA的提取，质粒的鉴定。
二、质粒生物学活性的鉴定，包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT - PCR 检测STAT3和AFP基因的表达、western blotting测定STAT3和AFP蛋白表达水平的影响。 MTT、细胞免疫化学法检测Ki67分析转染STAT3、AFP双siRNA表达质粒后对AFP阳性肿瘤细胞生长增殖的影响。
下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法
1、RNA干涉靶序列的选择及双RNA聚合酶III (H1+U6)启动子的引入选用经筛选、验证有效的STAT3及AFP基因的RNAi靶序列，分别为
①5’-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’
② 5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’
设计PCR引物，以包含Hl和U6启动子的质粒XM-2P为模板，扩增Hl和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop 序列上游引物P1-FW:5’ -GGCCGGCGCGCCCAATGCAGGCAATCTGTTGCGGGAAAGAGTGATC-3’ 下游引物P1-RV:5’ -CGCGCGCGGGCCGTTCATGAATGTCTCCCTGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’ PCR 反应体系试剂体!Η(μ丨)
权利要求
1.抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以pGenesill. 5为载体，利用双靶标siRNA技术，在ー个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用，是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质； 所述的shRNA序列的两个反向重复序列分别是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互补序列； 所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’，起始于 956 位5’ -CAGGGAGACATTCATGAAC-3'，起始于 508 位； 所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为5’-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’ ，5’-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3’ ； STAT3、AFP 基因 shRNA 表达框的 loop 序列分别为5’ -GGCCGGCGCGC-3’，5，-CGCGCGCGGGCC-3，； 由以下方法制得 (1)STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建 a.第一轮PCR以包含Hl和U6启动子的质粒XM-2P为模板，设计PCR引物，在3’引入PCR模板质粒XM-2P的部分序列，用于扩增Hl和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列；上游引物P1-FW:5’ -GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3’，下游引物P1_RV:5，-CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGITTCGTCCTTTC-3，； b.第二轮PCR以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶111终止序列“ AAAAA ”及限制性内切酶HindII I(AAGCTT)、BamHI (GGATCC)，为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”上游引物P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3’，下游引物P2-RV:5’ -ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’ ； c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为HindII1-ShRNAl-Hl 启动子-U6 启动子-shRNA2_BamHI。
(2)将步骤(I)所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesill. 5同时用Hindlll、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5 a大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA ;得到抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒pGenesill. 5-STAT3-AFP ； (3)质粒的鉴定将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIIKBamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesill. 5质粒中。
2.权利要求1的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒在制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对肿瘤中异常高表达的AFP和STAT3基因的靶序列，构建了能在真核细胞中同时表达STAT3和AFP siRNA的质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP。本发明能高效、特异性地抑制肿瘤细胞的STAT3和AFP基因表达，可用于制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物。
文档编号A61K48/00GK103031334SQ20121048890
公开日2013年4月10日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者马效恩, 郑燕, 汪运山, 石晓红, 王婧男, 胡瑞, 孔毅 申请人:汪运山