治疗视网膜疾病的方法

治疗视网膜疾病的方法【专利摘要】本发明提供了治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括向患有所述视网膜疾病的对象给予有效量的神经营养因子。在本发明中有用的神经营养因子包括中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)和保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)。本发明还包括药物组合物和含有MANF和CDNF的药盒。【专利说明】治疗视网膜疾病的方法[0001]相关申请交叉参考[0002]本申请要求2011年6月9日提交的美国临时申请系列号61/495，182的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。[0003]关于联邦资助的研究和开发的声明[0004]本发明是在美国政府支持下完成的，资助号为R0-1EY-018586、R0-1EY-015289和P30EY-14801，由国家眼科研究院，国家卫生研究院(NEI/NIH)授予，以及资助号为W81XWH-09-1-0674,由美国国防部授予。美国政府可享有本发明的某些权利。[0005]发明背景发明领域[0006]本发明一般涉及视网膜退化疾病领域。更具体地，其与用神经营养因子以及包括神经营养因子的组合物和药盒治疗视网膜退化疾病的方法有关。【
背景技术：
】[0007]中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)和保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)是具有神经营养能力的新型进化保守性蛋白家族的两种已知成员(Petrova等，2003;Lindholm等，2007)。该家族的第一个成员，MANF，是从小鼠I型星形胶质细胞系(称为腹侧中脑细胞系I(VMCLl))的条件性介质中鉴定的一种因子，其促进培养的胚胎多巴胺能神经元的存活(Petrova等，2003)。MANF也显著减少中风大鼠模型中缺血性皮层中的梗塞(Airavaara等,2009)并且促进培养的心肌细胞的存活(Tadimalla等,2008)。另一方面，⑶NF首先是在计算机上鉴定然后生化表征的(Lindholm等，2007)。其在鼠和人的组织中表达，包括大脑。CDNF的单次注射拯救了黑质中安非他明诱导的在多巴胺能神经元的损失(Lindholm等，2007)。结构分析显示MANF和⑶NF具有N-端皂化蛋白样脂质结合结构域和可能负责内质网(ER)应激应答的C-端结构域，并且两种蛋白都不与任意已知生长因子类似(Parkash等，2009)。⑶NF和MANF的受体和信号途径未知。虽然这两种蛋白被认为是帕金森病的潜在治疗方法，本发明人认为它们是其他神经变性疾病的潜在治疗方法，包括视网膜退化病，如遗传性视网膜疾病、年龄相关的黄斑变性和青光眼。【
发明内容】[0008]鉴于它们的神经营养能力和在神经变性疾病中的潜在治疗能力，本发明公开了神经营养因子，MANF和⑶NF，用于拯救在患者视网膜退化疾病中的感光细胞和视网膜神经节细胞，视网膜退化疾病包括遗传性视网膜疾病、年龄相关的黄斑变性和青光眼。[0009]具体地，本发明提供了治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括向患有所述视网膜疾病的对象给予有效量的神经营养因子。需要治疗的对象可以是动物，其可包括哺乳动物(例如，人)。可进行治疗或由本发明的抑制的视网膜疾病包括神经变性疾病，如年龄相关的黄斑变性、青光眼、遗传性视网膜疾病、散发性视网膜疾病、其他退化视网膜疾病或视网膜损伤。[0010]可在本发明的实施方式中给予的神经营养因子包括单独或一起给予的MANF和CDNF。所述神经营养因子可以是重组的或分离的因子，并且在具体有用的实施方式中，所述神经营养因子是人神经营养因子。[0011]在【具体实施方式】中，所述神经营养因子在药学上可接受的载剂中给予。在一些实施方式中，所述神经营养因子注射入需要的对象的眼部，其也可使用缓释载剂给予。[0012]本发明也提供了用于在神经细胞中促进神经保护的方法，所述方法包括将所述神经细胞与神经营养因子接触，所述神经营养因子可包括单独或组合的神经营养因子MANF和⑶NF。神经细胞的接触可以在体外或体内进行。[0013]可由本发明的方法治疗的细胞类型包括神经节细胞或感光细胞。[0014]本发明也提供药物组合物，所述组合物包括神经营养因子，其可包括单独或组合的MANF和CDNF。本发明也涉及包括神经营养因子、试剂及它们的使用说明书的药盒部分。另外，本发明可采用具有序列SEQIDNO:1、2、3或4的神经营养因子。[0015]如本领域技术人员阅读本公开后可判断，本文所述的方法、组合物和药盒能够与药物、医学和兽医学上的应用，以及基础科学研究和方法结合使用。当考虑附图和详细说明时，本发明的这些和其他的目标、特征和优势会变得更为清晰。[0016]当考虑附图和详细说明时，本发明的这些和其他的目标、特征和优势会变得更为清晰。[0017]附图简要说明[0018]为了更充分理解本发明的本质，参考以下与附图结合的详细说明应该是必须的，其中:[0019]图1显示在Iμg和5μg的量下纯化的重组人MANF蛋白的凝胶电泳图，与标准的分子量(MW)梯度相比显示纯化的MANF蛋白的大小为约20千道尔顿(KD)。[0020]图2显示在5μg的量下纯化的重组人⑶NF蛋白的凝胶电泳图，与标准的分子量(MW)梯度相比显示纯化的⑶NF蛋白的大小为约18千道尔顿(KD)。[0021]图3A-3C显示光学显微镜下对照和经MANF处理的S334ter3大鼠的视网膜外核层部分，以及每个的外核层厚度的定量分析的图。图3A显示对照，经PBS(磷酸盐缓冲盐水)处理的视网膜。图3B表示经MANF处理的视网膜。比例尺，25μm。图3C是在经PBS处理和经MANF处理的视网膜中视网膜外核层的厚度的定量分析示意图。[0022]图4A-4C显示对照和经⑶NF处理的S334ter3大鼠的视网膜外核层部分的光学显微镜照片，以及每个的外核层厚度的定量分析的图。图4A表示对照，经PBS(磷酸盐缓冲盐水)处理的视网膜。图4B表示经⑶NF处理的视网膜。比例尺，25μm。图4C是在经PBS处理和经⑶NF处理的视网膜中视网膜外核层的厚度的定量分析示意图。[0023]图5A-5C显示在对照和经MANF处理的S334ter3大鼠(图5A和5B)中用AlexaFluor488偶联的PNA(花生凝集素)染色的全组织标本包埋(wholemounted)视网膜的视锥外节(COS)的荧光显微照片，以及每个的定量分析(图5C)。图5A表示对照，经PBS处理的视网膜。图5B表示经MANF处理的视网膜。比例尺，50μm。图5C是在经PBS处理和经MANF处理的视网膜中视网膜标记细胞数量的定量分析示意图。[0024]图6A-6C显示在对照和经CDNF处理的S334ter3大鼠(图6A和6B)中用AlexaFluor488偶联的PNA染色的全组织标本包埋视网膜的COS的荧光显微照片，以及每个的定量分析(图6C)。图6A表示对照，经PBS处理的视网膜。图6B表示经⑶NF处理的视网膜。图6C是在经PBS处理和经⑶NF处理的视网膜中视网膜标记细胞数量的定量分析示意图。[0025]图7A-7C显示全组织标本包埋视网膜神经节细胞的氟金反向标记(Fluoro-Goldretralabeled)的代表性显微照片:对照大鼠(图7A)、除PBS处理以外还进行视神经挤压之后的大鼠作为对照(图7B)、以及除MANF处理以外还进行视神经挤压之后的大鼠(图7C)。图7A表示未经过视神经挤压的对照视网膜神经节细胞。图7B表示在视神经挤压和PBS处理之后两周的视网膜神经节细胞。图7C表示在视神经挤压和MANF处理之后两周的视网膜神经节细胞。[0026]图8显示Western印迹探测MANF和B-肌动蛋白(上样对照)的照片。显示了来自在出生后I天、5天、8天、10天、12天、16天、25天、30天、40天和60天的野生型SpragueDawley大鼠视网膜的提取物中的MANF表达水平。[0027]图9显示用抗-MANF抗体探测的大鼠视网膜的冷冻切片的荧光显微照片。标尺，50μm。在所述部分上标记的层包括视网膜色素上皮细胞(RPE)、感光细胞外节段(OS)、感光细胞内节段(IS)、外核层(ONL)、内核层(INL)、内网状层(IPL)和神经节细胞层(GCL)。在RPE细胞、米勒(MUller)细胞纤维和细胞体，以及GCL中显示MANF的免疫活性。[0028]图10显示SEQIDNO:1的核酸序列。[0029]图11显示SEQIDNO:2的核酸序列。[0030]图12显示SEQIDNO:3的氨基酸序列。[0031]图13显示SEQIDNO:4的氨基酸序列。[0032]附图中相似的附图标记表示这些附图中相似的部分。[0033]优选实施方式的详细说明[0034]本发明涉及用于治疗视网膜疾病的治疗方法、组合物以及药盒。[0035]本发明的几个方面在下面描述，参考实施例仅用于说明目的。应理解，提出大量的具体细节、关系和方式来提供对本发明的充分理解。然而，相关领域的普通技术人员容易认识到，本发明能在没有一个或多个具体细节或有其他方法、流程、试剂、细胞系和动物时实施。本发明不受所述行为或事件顺序的限制，因为一些行为可能以不同的顺序和/或同时与其他行为或事件发生。在此描述或参考的许多技术和过程为本领域技术人员熟知，并且通常使用常规方法使用。[0036]除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。还会理解，术语，如在常用的词典中定义的那些，应该解释为具有与它们在相关领域的文本中的意思相一致的意思和/或如本文另外定义。[0037]本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。本文的不定冠词“一个”、“一种”以及“该”也应理解为包括复数形式，除非上下文另有明确说明。[0038]本文使用的短语“和/或”应理解为指相关联元件“之一或两者”，即，在一些情况中存在关联性而在其它情况中无关联的元件。[0039]本文使用的“或”应该理解为与上述定义的“和/或”具有相同的意思。例如，当分隔一列项目时，“和/或”或者“或”应解释为包括性的，即，包括至少一个，但也包括多于一个的一些元件，以及可选的额外未列出项目。仅清楚指示相反的术语例如“其中仅一个”或“确定的一个”或在权利要求中使用时，“由……组成”指包含一些元件或元件列表中确定的一个元件。一般而言，当其之前有排他性术语时例如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“明确的其中之一”时，本文所用的术语“或”应仅解释为指示专一性选择(即，“一个或另一个但非两者”)。[0040]本文使用的术语“包含”、“含”、“有”、“具有”、“含有”或其变体是与术语“包括”相似的包括性的。[0041]本文公开的所有基因、基因产物(包括RNA和蛋白)以及它们相应的名字旨在对应于本文公开的组合物和方法可应用的任何物种的同源物。当公开一个具体物种的基因或基因产物时，该公开应理解为仅用于示例而不应解释为限制，除非上下文另外明确指出。例如，本文公开的基因和基因产物，其在一些实施方式中与哺乳动物(包括人)的核酸和/或核酸序列相关，旨在包括来自其他动物的同源和/或直向同源和/或旁系同源基因和基因产物，所述其他动物包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、爬行类、两栖类、鸟类和其他脊椎动物。[0042]在本发明的文本中，术语“多肽”和“蛋白”是等价的并且可互换使用的。它们是指任意氨基酸链，并且包括对其的任意翻译后修饰(例如磷酸化或糖基化)。[0043]本文使用的术语“对象”是指任意的动物(例如，哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类)，包括但不限于人、非人的灵长类、啮齿类等，其成为具体治疗的受体。通常，当在本文中指代对象时，术语“对象”和“患者”可互换使用。另外，在本发明的方法中使用转基因动物(例如，转基因大鼠和小鼠)。[0044]本文使用的术语“化合物”是指神经营养因子，除非另外明确说明。出于本发明的目的，所述神经营养因子能够以重组DNA、RNA或蛋白的形式存在、描述和/或应用。所述神经营养因子能够以分离的形式，如从动物(其也可以是对象)分离和纯化。在一些实施方式中，所述神经营养因子可以是多肽、多核苷酸或其片段。本文中术语“生物制剂”也可以与“化合物”互换使用来指代本发明的神经营养因子。[0045]本文使用的术语“片段”是指化合物的一部分。例如，当指代蛋白时，片段是低于所述多肽全长的多个连续的氨基酸。例如，化合物的片段可与其母化合物共享最高99%、95%,90%,85%,80%,75%,70%,65%^；60%的序列。[0046]本文使用的术语“给予”是指采用玻璃体内、眼内、眼睛、视网膜下、鞘内、静脉内、皮下、经皮、皮内、颅内、局部等给药方式向对象提供治疗有效量的化学或生物化合物或药物组合物。本发明的化学或生物化合物可单独给予，但也可根据选择的给药途径和标准药学实践与其他化合物、赋形剂、填料、粘结剂、运载体或其他载剂一起给予。给药可以是运载体或载剂的方式，如可注射溶液，包括无菌水性或非水性溶液，或盐水溶液；乳膏；洗剂；胶囊；片剂；颗粒；粒料；粉末；悬浮液，乳剂或微乳剂；贴片；胶束；脂质体；囊泡；植入物，包括微植入物；滴眼液；其他蛋白和肽；合成聚合物；微球；纳米颗粒等。[0047]本发明的化学或生物化合物或药物组合物也可以包含或包装其他非毒性化合物，如药学上可接受的运载体、赋形剂、粘结剂和填料，包括但不限于葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、黄原胶、刺槐豆胶、半乳糖、寡糖和/或多糖、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、淀粉片段、角蛋白、二氧化硅胶体、马铃薯淀粉、尿素、葡聚糖、糊精等。具体地，可考虑在本发明的实践中使用的药学上可接受的运载体、赋形剂、粘结剂和填料是可使得本发明的化合物可进行玻璃体内递送、眼内递送、眼部递送、视网膜下递送、鞘内递送、静脉内递送、皮下递送、透皮递送、皮内递送、局部递送的那些物质。另外，包装材料可以是生物学惰性的或缺少生物活性，如塑料聚合物、硅油等，并且可以由对象内部加工而不影响与之一起包装和/或递送的神经营养因子的功效。[0048]本发明的化合物也可以考虑通过植入载剂的方式给予，如包封细胞技术(ECT)或其他相似的未来产生的微植入技术。在Tao，W.等，2006、Tao,W.和Wen，R.，2007以及Sieving等，2006中描述了ECT，其通过引用纳入本文。在一些实施方式中，ECT载剂可以每IxlO6个细胞每天约250ng-约800ng的速率释放本发明的化合物。所述植入载剂也可以是任意其他相似的缓释载剂或之后发展的载剂等。[0049]当用于本文所述的化合物、生物制剂或药物组合物时，术语“有效量”表示产生需要的治疗结果所需的量。例如，有效量是治疗、治愈或缓解疾病的症状的有效水平，因为该疾病而给予所述治疗化合物、生物制剂或组合物。具体治疗目标的有效量的探求会取决于多种因素，包括治疗的疾病和其严重程度和/或发展/进程的阶段；生物可及性，以及使用的特定化合物、生物制剂或药物组合物的活性；给药的途径或方法以及对象上的引入位点；所述特定化合物或生物制剂的清除速率和其他药代动力学性质；治疗的持续时间；感染方案；与所述特定化合物、生物制剂或组合物组合或同时使用的药物；治疗对象的年龄、体重、性别、饮食、生理和总体健康情况；以及相关科学领域中技术人员熟知的类似因素。根据待治疗的对象的情况，在剂量上的会出现一些必要的变化，并且在任何情况下，医师或其他单独给予治疗会确定单独患者的合适剂量。[0050]本文使用的“疾病”是指疾病、病症或状况，或其他与健康或正常生物学活性不同的情况，并且这些术语可互换使用。所述术语是指损害正常功能的任意状况。所述状况可由散发性或可遗传的遗传异常引起。所述状况也可由非遗传异常引起。所述状况也可用对象受到来自环境因素的伤害引起，例如但不限于切割、挤压、烧伤、刺穿、拉伸、剪切、注射或另外改变对象的细胞、组织、器官或系统等。[0051]本文使用的“治疗”或“处理”是指阻止或抑制，或尝试阻止或抑制疾病的发展或进程，和/或产生，或尝试产生疾病和/或其症状的减少、抑制、回归或缓解。如本领域技术人员所理解，可以使用各种临床和科学方法和试验来评价疾病的发展或进程，并且相似地，可以使用各种临床和科学方法和试验来评价疾病或其症状的减少、回归或缓解。另外，可以向对象或细胞培养物中施用治疗。[0052]按照本发明的至少一个实施方式，治疗在需要的患者中的视网膜疾病的方法包括向所述对象给予有效量的本文所述的化合物。在一个实施方式中，该化合物是神经营养因子。[0053]术语“神经营养因子”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸及其衍生的蛋白，以及它们的片段，它们负责神经细胞在成熟神经细胞的发育中和维持期间的生长和存活。在本发明的一些实施方式中，所述神经营养因子是中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)。在其他实施方式中，所述神经营养因子是保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)。另外，给予的所述神经营养因子可以是MANF和⑶NF的组合。如本领域技术人员理解，MANF和CDNF可以具有同源物、直向同源物和/或旁系同源物，其会被另外考虑用于本发明。[0054]在本发明的一个实施方式中，所述神经营养因子是重组多肽。所述重组多肽可以是重组MANF或⑶NF蛋白。在本发明中也考虑可在本文所述的方法和药盒中使用重组MANF和/或⑶NF多肽片段。在本文所述的方法和药盒中还可考虑采用重组MANF和/或⑶NF全长DNA、cDNA或mRNA(或其片段)。在一些实施方式中，所述DNA、cDNA或mRNA(或其片段)可以包括于质粒、载体等。例如，可以通过基因治疗技术或包封细胞技术(ECT)的方式使用多核苷酸或其片段。另外，本发明可采用具有序列SEQIDN0:l、2、3或4的神经营养因子(或其片段、重组体、嵌合体或组合)。[0055]在本发明的方法中，用药学上可接受的运载体或载剂给予所述神经营养因子。例如，所述药学上可接受的运载体或载剂可以是盐水溶液或可考虑的任意其他载剂。[0056]具体地，在一个实施方式中，以注射的方式给予所述神经营养因子。在一些实施方式中，注射位点是对象的眼部并且可以是眼内、玻璃体内、视网膜下和相似的给药方式。在其他的实施方式中，在与眼部相邻的区域给予所述神经营养因子，并且可以通过注射或其他本文所述的递送方法。[0057]也可以通过在待治疗对象的眼部中植入载剂的方式给予所述神经营养因子。所述载剂可以是微植入装置，如包封细胞技术(ECT)或其他相似或未来的微植入技术。[0058]通过本发明所述的方法治疗的视网膜疾病可以是中枢神经系统的组织或细胞损伤的结果。治疗的视网膜疾病也可以是神经变性疾病(例如，视网膜色素变性)。损伤或患有神经变性疾病的组织或细胞可以是神经节细胞，如视网膜神经节细胞或感光细胞。在一些实施方式中，治疗的视网膜疾病包括神经节细胞退化。这样的神经节细胞退化可以由青光眼诱导。[0059]考虑用本文所述的治疗方法治疗的神经变性疾病可以是在自然中遗传性的或散发性的(例如，分离的，非可遗传的情况下发生)。如本领域技术人员所理解，神经变性疾病也包括除了视网膜神经变性疾病以外的状况，并且本发明的方法、组合物和药盒被考虑适用于其他这样的疾病。这样的疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、青光眼、年龄相关听力丧失、进行性核上性麻痹、轻度认知障碍、痴呆、脊髓性小脑萎缩症等。[0060]在至少一个实施方式中，在损伤或患有神经变性疾病的位置上或在与感染或患病的位置相邻的区域内给予所述神经营养因子。也可以通过载剂的方式给予所述神经营养因子，所述载剂以控制(例如，时间和/或剂量依赖性)的方式释放所述因子，例如在ECT中，如本文前述。[0061]按照本发明的另一个实施方式，促进神经细胞中的神经保护的方法包括将所述神经细胞与神经营养因子，如MANF、CDNF或其组合接触。本文使用的术语“神经保护”是指防止、阻止、抑制或减缓神经破坏、神经元退化和/或神经元死亡。在由衰老、遗传因素、环境变化、物理压力或损伤、内源或外源生物或化学因素(例如，神经妥乐平(neuiOtropins)、维生素、酒精、药剂、缺血等)、中风等引起的破坏或退化之后可以引发神经保护。[0062]本文使用的术语“接触”是指在细胞和所述神经营养因子(或含有所述神经营养因子的载剂)之间指导产生空间关系的作用，所述作用在预定和特定的时间内并且在一定条件下进行，所述条件适于在接触的细胞中引发需要的生物反应，如神经保护。在所述细胞和所述神经营养因子之间的空间关系可包括直接接触，其中所述因子在接触的细胞的表面直接引发反应或进入所述细胞以进一步发挥作用，或非直接接触，其中所述因子通过胞外信号传导引发细胞上的反应(例如，另一种物质的活化或修饰后与接触的细胞互相作用)。如本文使用，生物反应包括神经保护反应或由细胞产生的任意其他反应,该反应造成所述细胞的疾病的阻止、抑制、减少或缓解。[0063]在本发明的【具体实施方式】中，由神经营养因子接触神经细胞发生在体外。“体外”可包括在细胞或阻止培养基中，或测试试管培养基中。在其他实施方式中，神经细胞的接触发生在体内。“体内”可包括动物模型(例如，转基因动物如小鼠或大鼠)或本文定义的活的对象，包括人。在其他实施方式中，神经细胞的接触离体发生。“离体”可包括已经从其来源分离的或提取的来自对象的完整组织、器官或系统或其部分。本文使用的术语“分离的”表示所描述的物品是隔离的或分离的。分离的东西可以仍然在对象内或在对象外存在。本文使用的术语“提取的”表示所描述的物品是从对象中移出的并且在所述对象以外存在。[0064]在本发明的一些实施方式中，可由本发明的方法进行治疗的神经细胞类型包括神经节细胞或感光细胞。在一个【具体实施方式】中，可由本发明的方法进行治疗的神经细胞类型包括视网膜神经节细胞。[0065]本发明的神经营养因子可以是重组或分离的神经营养因子，并且也可以是重组或分离的人神经营养因子。如本文使用相对于基因或其片段，或基因产物或其片段，术语“分离的”定义为从动物中移出的和/或纯化的用于在本文所述的方法中使用。本文使用的术语“基因”是指衍生自编码RMA或蛋白质的染色体的多核苷酸。如本文所用，基因可以包括或不包括与特定基因相关的所有的内含子、外显子、启动子区域、非编码区域等。[0066]本发明也涉及包括神经营养因子，如MANF、⑶NF或其组合的药物组合物或药物。根据所选择的给药途径和标准药学实践，所述药物组合物也可包括其他药学上可接受的化合物、赋形剂、添加剂、填料、粘结剂、佐剂或运载体或载剂。如此，可以在药物或药物组合物的生产或制备中使用所述神经营养因子。同时，包括所述的神经营养因子的所述药物和药物组合物可以用于本文所述的疾病的治疗。[0067]本发明也涉及包括神经营养因子和其他需要的试剂的组合药盒以实施本发明的方法。所述组合药盒也可包括使用说明书。所述神经营养因子和试剂可包括在一种或多种组合物中，并且每种神经营养因子和试剂可在组合物中与合适的载剂组合，或单独存在。所述组合药盒可包括MANF、⑶NF或其组合，如纯化的蛋白(重组或从动物中分离)或纯化的核苷酸(重组或从动物中分离)。[0068]在其他实施方式中，所述组合药盒包括标记的对特定神经细胞类型有特异性的生物标志物,如感光细胞生物标志物或视网膜神经节细胞生物标志物、参比标准和在阅读本发明公开之后可由本领域技术人员鉴定的另外的组分。[0069]无须赘述，可以相信本领域的技术人员能够根据以上说明书的描述充分利用本发明。通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。虽然已经提供了具体实施例，但是上述的说明是示例性的而非限制性的。前述的实施方式的特征中的任意一个或多个能够以任意方式与本发明中任意其他实施方式中的一个或多个特征组合。另外，本领域的技术人员在阅读本说明书后将清楚了解本发明的许多变化。[0070]本申请所引用的所有出版物和专利文献都通过在相关部分引用纳入本文，以用于所有相同程度的目的，就好像每个单独出版物或专利文献都单独表示。在该文献中引用多种参考文献，本申请并不承认任何特定文献对其发明为“现有技术”。实施例[0071]本文所述的方法和组合物以及相关的药盒在下面的实施例中进一步说明，其通过说明的方式提供并且并非旨在限定。应该认识到，组分的比例变化和元件替代为该领域技术人员熟知并且在本发明实施方式范围内。展示理论方面同时理解该申请并不受到所展示的理论的束缚。[0072]下面的材料和方法用于本文所示的所有方法和组合物。[0073]重组人MANF和CDNF蛋白的克隆:MANF(SEQIDNO:1)和CDNF(SEQIDNO:2)的开放阅读框(ORF)各自通过聚合酶链式反应(PCR)从人大脑cDNA克隆，并且确认所得的克隆序列。每个ORF亚克隆到表达载体pQE30(加州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA))中，其含有在阅读框中N-端的6XHiS-标签编码序列。然后，各含有MANF和⑶NF序列的表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达(XL-blue，加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene,LaJolla,CA)),并且在天然条件下通过N1-NTA琼脂糖柱(凯杰公司)上固定金属亲和色谱纯化相应的表达的蛋白。将洗脱的蛋白进行缓冲液交换为磷酸盐缓冲的盐水(PBS)并且在_80°C下小份保存直至使用。合适的人MANF蛋白序列表示为SEQIDNO:3，而合适的人CDNF蛋白序列表示为SEQIDNO:4。[0074]纯化的MANF和⑶NF蛋白的观察:Iμg和/或5μg的纯化的蛋白在4_12%NuPAEG胶上进行电泳并且用考马斯蓝观察以确认纯化和合适的分子量。在与Iμg和/或5yg样品相邻的一条泳道中对分子量标记物(MW)进行电泳。[0075]转基因动物:如之前所述产生和使用携带鼠视紫红质突变S334ter的转基因大鼠，称为S334ter-3大鼠(Liu等，(1999))。[0076]感光细胞保护测试:向S334ter3大鼠给予MANF和PBS(对照)的单次玻璃体内注射。具体地，向出生后(PD)第9天的大鼠的一只眼睛中注射6μgMANF，并且向相同大鼠中剩余的一只眼睛中同时注射3μLPBS作为对照。通过与10μL微量注射器(内华达州雷诺的汉密尔顿公司(Hamilton，Reno，NV))连接的33-号针头实施注射。在出生后21天处死动物并且如前述取得、塑料包埋和对每只眼睛进行切片(Liu等，(1999))。对所得的半薄视网膜切片用甲苯胺蓝进行染色并且由光学显微镜检查。使用6μg⑶NF实施相似的实验。[0077]视锥感光细胞外节(COS)保护试验:向S334ter3大鼠给予MANF和PBS(对照)的单次玻璃体内注射。向出生后(PD)第20天的大鼠的一只眼睛中注射6μgMANF,并且向相同的大鼠中剩余的一只眼睛中同时注射3μLPBS作为对照。通过与10μL微量注射器(内华达州雷诺的汉密尔顿公司(Hamilton，Reno，NV))连接的33-号针头实施注射。在治疗10天后(出生后第30天)处死动物并且收获每只眼睛。用AlexaFluor488偶联的PNA(花生凝集素)染色全组织标本包埋视网膜，其特异性地与视锥感光细胞的外节结合，并且通过荧光显微检查。使用6μg⑶NF实施相似的实验。[0078]视神经挤压试验:通过用氟金反向标记来标记野生型SpragueDawley大鼠的视网膜神经节细胞。在标记一周后，挤压视神经并且随后立即进行6ygMANF的玻璃体内注射。在神经挤压和治疗两周后，处死大鼠并且收获视网膜。通过荧光显微检查全组织标本包埋视网膜。[0079]视网膜的MANF蛋白表达分析:在聚丙烯酰胺凝胶上对来自出生后I天、5天、8天、10天、12天、16天、25天、30天、40天和60天的野生型SpragueDawley大鼠的视网膜的等量提取物进行电泳，转膜并且用针对MANF和β_肌动蛋白的抗体探测。分析结构蛋白，β-肌动蛋白的表达以确保每个分析时间点上蛋白提取物的一致性加载。[0080]实施例1:重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)的纯化[0081]为了测试用于神经保护性质的神经营养因子，产生重组人MANF和⑶NF蛋白并且纯化以用于进一步的实验。如上述的材料和方法在大肠杆菌中表达重组人MANF，纯化并且观察。图1中所示的结果显示观察到Iμg和5μg的纯化MANF为20kDa的单条带。泳道I显示分子量标记物(MW);泳道2显示Iyg的纯化的MANF;而泳道3显示5μg的纯化MANF。“KD”指代“千道尔顿”。[0082]实施例2:重组人多巴胺神经营养因子(CDNF)的纯化[0083]CDNF也被用作具有神经保护性质的候选神经营养因子。如上述的材料和方法在大肠杆菌中表达重组人CDNF，纯化并且观察。图2中所示的结果显示观察到5μg的纯化的⑶NF是18kDa的单条带。泳道I显示分子量标记(MW);泳道2显示5μg的纯化的⑶NF。“KD”指代“千道尔顿”。[0084]实施例3:在视网膜退化的啮齿模型的视网膜中由MANF保护感光细胞[0085]在寻找可拯救在视网膜退化疾病(包括遗传性视网膜疾病(例如，视网膜色素变性)、年龄相关黄斑变性和青光眼)中感光细胞的神经营养因子中，测试重组人MANF蛋白在视网膜退化啮齿模型的视网膜中的感光细胞保护性质。为此，使用S334ter3转基因大鼠，由于它们特征性的累积视网膜感光细胞退化(Liu等，(1999))。[0086]图3A中所述的结果显示在出生后21天时，在PBS(对照)处理的S334ter3大鼠中，视网膜的外核层仅有一排核(参见图3A中的箭头)。图3B中所示的结果显示在相同动物的剩余的一只眼睛中于出生后9天的MANF单次玻璃体内注射保护了出生后21天时的感光细胞免受退化，外核层含有3-4排的核(参见图3B中两个箭头之间)。[0087]上部视网膜的外核层的厚度的定量分析，如图3C所示，表明MANF处理的视网膜的外核层(17.47土3.96μΜ,η=5)显著厚于对照PBS处理的视网膜(7.07土1.12μΜ,η=5)(平均值土标准差)。Ρ〈0.001(斯氏t检验)。[0088]实施例4:在视网膜退化啮齿模型的视网膜中由⑶NF保护感光细胞[0089]在寻找其他能够拯救在视网膜退化疾病中的感光细胞的神经营养因子中，测试重组人CDNF蛋白在与前述MANF研究所用的相同视网膜退化啮齿模型中的感光细胞保护性质。[0090]图4A中所述的结果显示在出生后21天时，在PBS(对照)处理的S334ter3大鼠中，视网膜的外核层仅有一排核(参见图4A中的箭头)。图4B中所示的结果显示在相同动物的剩余的一只眼睛中于出生后9天的CDNF单次玻璃体内注射保护了出生后21天时的感光细胞免受退化，外核层含有3-4排的核(参见图4B中两个箭头之间)。[0091]上部视网膜的外核层的厚度的定量分析，如图4C所示，表明⑶NF处理的视网膜的外核层(16.6^2.87μΜ,η=6)显著厚于对照PBS处理的视网膜(7.4土3.43μΜ，η=6)(平均值土标准差)。P〈0.001(斯氏t检验)。[0092]实施例5:在视网膜退化啮齿模型的视网膜中由MANF保护视锥感光细胞的外节[0093]作为神经营养因子的感光细胞保护能力的另一测试，在与本文前述相同的视网膜退化啮齿模型中分析暴露于重组人MANF蛋白之后的视锥外节。[0094]图5B所示的结果显示在出生后20天向视网膜脱化啮齿模型的眼睛中进行MANF单次玻璃体内注射防止视锥外节出现退化，如出生后30天的时间点所测，对比相同的动物用PBS(对照)处理的剩余眼睛(图5A)。[0095]图5C所示的结果是AlexaFluor488偶联的PNA-阳性染色细胞的数量的定量分析，其是视锥感光细胞存在的指示。该照片显示MANF处理的视网膜相比对照PBS-处理的视网膜(398.7±25.4μM)含有显著较大数量的视锥感光细胞(569.5±46.5μΜ)(C，平均值士标准差)。Ρ〈0.001(斯氏t检验)。[0096]实施例6:在视网膜退化啮齿模型的视网膜中由CDNF保护视锥感光细胞的外节[0097]采用与实施例5中相同的实验过程以进一步测试重组人CDNF蛋白的感光细胞保护能力。[0098]图6B所示的结果显示在出生后20天向视网膜脱化啮齿模型的眼睛中进行⑶NF单次玻璃体内注射防止视锥外节出现退化，如出生后30天的时间点所测，对比相同的动物用PBS(对照)处理的剩余的眼睛(图6A)。[0099]图6C所示的结果是AlexaFluor488偶联的PNA-阳性染色细胞的数量的定量分析，其是视锥感光细胞存在的指示。该照片显示⑶NF处理的视网膜相比对照PBS-处理的视网膜(412.75+40.9μM)含有显著较大数量的视锥感光细胞(561.5+81.3μΜ)(C，平均值士标准差)。P=0.012(斯氏t检验)。[0100]实施例7:在大鼠中视神经挤压之后由⑶NF对视网膜神经节细胞的保护[0101]作为神经营养因子MANF的神经保护能力的另外测试，在大鼠中视神经挤压和暴露于MANF之后分析视网膜神经节细胞。[0102]图7A-C中所示的结果显示MANF在视神经挤压之后保护视网膜神经节细胞的能力。如图7A所示，反向标记的神经节细胞分布在对照小鼠的代表性显微照片上。如图7B所示，在PBS-处理的视网膜中(对照)，反向标记的神经节细胞大部分在视神经挤压2周后退化。相反，如图7C所示，MANF处理能够在视神经挤压和处理两周后拯救许多视网膜神经节细胞。[0103]实施例8:在大鼠中感光细胞发育期间在视网膜中MANF蛋白的表达较高[0104]用Western印迹分析法分析的来自出生后I天、5天、8天、10天、12天、16天、25天、30天、40天和60天的野生型SpragueDawley大鼠视网膜的蛋白提取物中的MANF表达水平。如图8所示，在出生后发育中检测到高水平的MANF表达(出生后1-16天)。当经过出生后16天视网膜成熟时，其表达降低(参见图8中从出生后25天-60天的连续表达水平降低)。[0105]实施例9:在视网膜上MANF的免疫活性[0106]如图9所示，用抗-MANF抗体探测的冷冻切片证明MANF的免疫活性位于视网膜色素上皮细胞(RPE)、米勒细胞纤维和细胞体，以及在视网膜神经节细胞层中。[0107]在实施例中展示的结果一起揭示了MANF和CDNF具有对于感光细胞的神经保护性质，以及MANF至少还在视网膜神经节细胞中具有神经保护性质。另外，MANF至少在感光细胞的发育期间具有高表达水平，并且当感光细胞成熟时其水平降低。这些结果表明MANF和CDNF是视网膜退化疾病的治疗剂。[0108]应理解发明详述部分，而非摘要部分是旨在用于解释权利要求。摘要部分可能显示本发明的一个或多个但不是全部发明人考虑到的示例性实施方式，并且因此，并不旨在以任意方式限制本发明和所附的权利要求。[0109]以上【具体实施方式】的描述应该完全揭示了本发明的一般性质，通过应用本领域技术范围内的知识，他人无需过多实验即能很容易地就各种应用改良和/或修改这些【具体实施方式】而不背离本发明总体理念。由于能够对本发明所述的优选实施方式做出许多修饰、改变和变化，应理解前述说明中提出或附图中示出的所有事项被理解为说明目的，而不构成限制。因此，本发明的范围应该由所附的权利要求及其法律对等方案确定。另外，本发明的宽度和范围不应局限于任何上述示例性实施方式，而相似地仅由下面的权利要求书和其等价物来限定。[0110]参考文献[0111]Airavaara,M.,Shen,H.,Kuo,C.,Peranen,J.,Saarma,M.,Hoffer,B.和Wang,Y.(2009).Mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactorreducesischemicbraininjuryandpromotesbehavioralrecoveryinrats(在大鼠中中脑星形胶质细胞源性神经营养因子减少缺血性脑损伤并促进行为恢复).JournalofComparativeNeurology515:116-124.[0112]Lindholm，P.，Voutilainen，M.H.，Lauren，J.，Peranen,J.，Leppanen，V.，Andressoo，J.，Lindahl，M.，Janhunen，S.，Kalkkinen，N.，Timmusk，T.，Tuominen，R.K.和Saarma,M.(2007).NovelneurotrophicfactorCDNFprotectsandrescuesmidbraindopamineneuronsinvivo(新型神经营养因子⑶NF在体内保护和拯救中脑多巴胺神经兀).Nature448:73-78.[0113]Liu,C.，Li，Y.，Peng,Μ.，Laties，Α.Μ.和Wen，R.(1999).Activationofcaspase_3intheretinaoftransgenicratswiththerhodopsinmutationS334terduringphotoreceptordegeneration(在感光细胞退化期间视紫红质突变S334ter的转基因大鼠的视网膜中光天蛋白酶的活化).JournalofNeuroscience19:4778-4785.[0114]Parkash,V.，Lindholm，P.，Peranen,J.，Kalkkinen，N.，Oksanen，E.，Saarma,M.,Leppanen,V.和Goldman，A.(2009).ThestructureoftheconservedneurotrophicfactorsMANFandCDNFexplainswhytheyarebifunctional(保守性神经营养因子MANF和CDNF的结构解释了为什么它们是双功能的).ProteinEngineering,Design&Selection22:233-241.[0115]Parkash,V.(2009).Neurotrophicfactorsandtheirreceptors(神经营养因子及其受体).论文.赫尔辛基大学(UniversityofHelsinki).赫尔辛基大学出版社(HelsinkiUniversityPress).[0116]Petrova,P.S.，Raibekas，A.，Pevsner,J.，Vigo,N.，Anafi,M.，Moore,M.K.，Peaire,A.E.，Shridhar，V.，Smith，D.1.，Kelly,J.，Durocher,Y.和Commissiong，J.W.(2003).Anewmesencephalic，astrocyte-derivedneurotrophicfactorwithselectivityfordopaminergicneurons(具有对于多巴胺能神经元选择性的新型中脑星形胶质细胞源性神经营养因子).JournalofMolecularNeuroscience20:173-187.[0117]Sieving,P.A.，Caruso，R.C.，Tao,W.Coleman，H.R.，Thompson,D.J.S.，Fullmer，K.R.,和Bush，R.A.(2006).Ciliaryneurotrophicfactor(CNTF)forhumanretinaldegeneration:PhaseItrialofCNTFdeliveredbyencapsulatedcellintraocularimplants(用于人视网膜退化的睫状节神经细胞营养因子(CNTF):包封细胞眼内植入衍生的CNTF的I期试验).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencel03:3896-3901.[0118]Tadimalla，A.，Belmont，P.J.，Thuerauf，D.J.，Glassy,M.S.，Martindale,J.J.，Gude,N.，Sussman，M.A.和Glembotski，C.C.(2008).Mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactorisanischemia—induciblesecretedendoplasmicreticulumstressresponseproteinintheheart(中脑星形胶质细胞源性神经营养因子是在心脏中缺血诱导型分泌内质网应激反应蛋白).CirculationResearch103:1249-1258.[0119]Tao,W.，Wen,R.，Aguirre,G.D.，Laties，A.M.(2006).Cell-Baseddeliverysystems!developmentofencapsulatedcelltechnologyforophthalmicapplications(基于细胞的递送系统:眼科应用的包封细胞技术的发展).在G.J.Jaffe,P.Ashton(编)，Intraoculardrugdelivery-principlesandclinicalapplications(《眼内药物递送:原理和临床应用》)(第8章)中.TF公司(Taylor&Francis).[0120]Tao,W.和Wen，R.(2007).ApplicationofEncapsulatedCellTechnologyforRetinalDegenerativeDiseases(用于视网膜退化疾病的包封细胞技术的应用).在J.Tombran-Tink&C.J.Barnstable(编)，OphthalmologyResearch:RetinalDegenerations:Biology,Diagnostics,andTherapeutics(《眼科研究:视网膜退化:生物学、诊断和治疗》)(401-413)中.新泽西州胡马纳出版公司(NewJersey:HumanaPress，Inc).[0121]由于能够对本发明所述的优选实施方式做出许多修饰、改变和变化，应理解前述说明中提出或附图中示出的所有事项被理解为说明目的，而不构成限制。因此，本发明的范围应该由所附的权利要求及其法律对等方案确定。[0122]现在本发明已被描述。【权利要求】1.一种治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括向患有所述视网膜疾病的对象给予有效量的MANF。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MANF包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其片段。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述视网膜疾病是神经变性视网膜疾病。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予有效量的CDNF。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述⑶NF包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，MANF是药学上可接受的运载体。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述药学上可接受的运载体是盐水溶液。8.如权利要求1所示的方法，其特征在于，向所述对象的眼睛给予MANF。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，通过注射进行给予。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述注射是玻璃体内注射。11.如权利要求1所示的方法，其特征在于，向与所述眼睛相邻的区域给予MANF。12.如权利要求1所示的方法，其特征在于，所述视网膜疾病是中枢神经系统的组织或细胞的损伤的结果。13.如权利要求12所示的方法，其特征在于，所述中枢神经系统的所述组织或所述细胞是神经节细胞。14.如权利要求12所示的方法，其特征在于，所述中枢神经系统的所述组织或所述细胞是感光细胞。15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述视网膜疾病选自遗传性疾病或散发性疾病。16.一种用于促进神经细胞中的神经保护的方法，所述方法包括将所述神经细胞与选自⑶NF、MANF及其组合的神经营养因子接触。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述接触发生在体内。18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述接触发生在体外。19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是视网膜神经节细胞。20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是感光细胞。21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经营养因子是重组神经营养因子。22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经营养因子是人神经营养因子。23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述人神经营养因子是重组人神经营养因子。24.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述MANF包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其片段。25.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述⑶NF包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段。26.—种药物组合物，所述组合物包括选自MANF、⑶NF及其组合的神经营养因子。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述MANF包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其片段。28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述⑶NF包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段。29.如权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括水性溶液和一种或多种药学上可接受的赋形剂、添加剂、运载体或佐剂。30.一种治疗视网膜疾病的方法，所述方法包括向患有所述视网膜疾病的对象给予有效量的⑶NF。31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述⑶NF包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段。32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予有效量的MANF。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述MANF包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其片段。34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述视网膜疾病是神经变性视网膜疾病。35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，CDNF在药学上可接受的运载体中。36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述药学上可接受的运载体是盐水溶液。37.如权利要求30所示的方法，其特征在于，向所述对象的眼睛给予CDNF。38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，通过注射进行给予。39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述注射是玻璃体内注射。40.如权利要求30所示的方法，其特征在于，向与所述眼睛相邻的区域给予CDNF。41.如权利要求30所示的方法，其特征在于，所述视网膜疾病是中枢神经系统的组织或细胞的损伤的结果。42.如权利要求41所示的方法，其特征在于，所述中枢神经系统的所述组织或所述细胞是神经节细胞。43.如权利要求41所示的方法，其特征在于，所述中枢神经系统的所述组织或所述细胞是感光细胞。44.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述视网膜疾病选自遗传性疾病和散发性疾病。45.一种包括神经营养因子、一种或多种试剂以及它们的使用说明书的药盒，所述神经营养因子选自MANF、⑶NF及其组合。46.如权利要求45所述的药盒，其特征在于，所述MANF包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其片段。47.如权利要求45所述的药盒，其特征在于，所述⑶NF包括SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段。【文档编号】A61K38/00GK103987400SQ201280038869【公开日】2014年8月13日申请日期:2012年6月8日优先权日:2011年6月9日【发明者】R·温申请人:迈阿密大学